CN103805687A - Alk融合基因检测的pcr引物、试剂盒和液相芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了检测ALK融合基因的PCR引物、试剂盒和液相芯片。所述液相芯片包括：PCR扩增引物；由tag序列和特异性引物组成的ASPE引物，所述特异性引物序列为：针对K15;DEL15A20的SEQ ID NO.12、针对K17;A20的SEQ ID NO.13、针对K9;A20的SEQ IDNO.14、针对T6;A20的SEQ ID NO.15、和/或针对T3;A20的SEQ ID NO.16；微球。本发明所述的液相芯片具有非常好的信号-噪声比，可一步完成5种融合亚型的扩增，且特异性引物具有非常好的特异性。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及ALK融合基因检测的的PCR引物、试剂盒和液相芯片。
技术背景
ALK基因位于染色体2p23位点，正常情况下人源的alk可转录产生大小6222bp的mRNA，由29个外显子构成，编码1620个氨基酸序列200KDa的I型穿膜蛋白ALK，该蛋白为一种受体酪氨酸激酶（receptortyrosinekinase，RTK），是RTK胰岛素超家族的成员。完整的ALK具有典型的RTK三部分结构，即胞外区、亲脂性穿膜区和胞浆内酪氨酸激酶。据文献报道，ALK蛋白除在极少部分弥漫性大B细胞淋巴瘤中表达外，可在60%～85%的原发性系统性ALCL中表达，是原发性系统性ALCL相对特异的免疫表型特征。ALK在某些ALCL中的异常表达来源于不同的染色体易位，每个易位会产生不同的融合蛋白质，由配偶体的5’端和ALK酪氨酸激酶结构域3’端融合得到。在大部分ALK融合基因中，ALK断裂点位于第19内含子内，在mRNA上，断裂点一般位于第20个外显子的第一个核苷酸上。
目前，与ALK相关的融合基因，除了发现EML4-ALK融合基因之外，又发现了KIF5B-ALK.、KLC1-ALK和TFG-ALK融合基因。在腺癌患者检测中发现了两种KIF5B-ALK基因融合亚型，K15;DEL15A20和K17;A20。
KLC1-ALK融合基因也许并不多见，但是该融合基因在肺腺癌中确实存在。KLC1与ALK基因发生融合，与ALK基因发生t(2;14)(p23;q32.3)易位产生KLC1-ALK融合基因。这两个基因之间，形成框内基因融合。完整KLC1-ALK cDNA可能产生的具有984个氨基酸的蛋白质，包含KLC1基因三分之二的氨基末端和ALK基因细胞内区域。研究发现，具有这个融合基因的病人极可能受益于ALK抑制剂治疗。另外，KLC1-ALK融合基因从腺癌（原发生位置细支气管肺泡癌）中被发现。而细支气管肺泡癌很少发现KLC1-ALK融合基因，从病理学角度出发，大规模检测细支气管肺泡癌个体以及对ALK融合基因癌前情况，这是非常有意义的。
在非小细胞肺癌（NSCLC）中，Rikova等研究发现了TFG-ALK融合基因，这个融合基因有两种异位的变异型：最近证实为t（2；3）（p23；q35）和inv（2）（p23q25），两种不同的融合蛋白85kDa（TFG-ALK短的）和97kDa（TFG-ALK长的）是与t（2；3）（p23；q25）有关，这种包括TFG（TRF融合基因），inv（2）（p23q25）包括ATIC基因（以前称为pur-T），是转录ATIC，其在嘌呤生物合成通路上起着重要作用。
目前，针对ALK融合基因的研究大部分采用RT-PCR方法以及非放射性同为杂交FISH方法进行检测。RT-PCR方法是针对已知的ALK融合基因的类型以及融合方式来设计引物，将RNA反转录获得cDNA后，通过PCR扩增目的片段的方式来进行检测，则存在灵敏度低，样品易污染、假阳性率高的缺点。非放射性原位杂交技术FISH法的原理是设计与被检测的ALK融合基因同源互补的核酸探针，二者经过变性－退火－复性，即可形成KALK融合基因的DNA与核酸探针的杂交体。用报告分子（如生物素等）标记核酸探针的某一种核酸，可利用该报告分子与荧光素标记的特异性碱基之间的免疫化学反应，经荧光检测体系的镜下对待测DNA进行定性以及相对定位分析。尽管该法较为直观，但是试验过程过于繁琐，需要的试剂种类繁多，费时费力，且试验结果需要经验丰富的专家来判读，结果判读存在较大的主观性，而且其只能检出融合基因是否存在，不能准确得出具体的融合类型，且灵敏性较低，因而一定程度上限制了该法的应用。鉴于各种融合基因（如ALK融合基因）的表达产物对癌症等疾病的发生发展起着重要作用，因此，本领域迫切需要开发更为实用的融合基因检测方法。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种检测ALK融合基因的PCR引物，所述PCR引物可用于单独或并行检测KIF5B-ALK、KLC1-ALK、TFG-ALK融合基因的5种基因融合亚型：KIF5B-ALK的K15;DEL15A20、K17;A20；KLC1-ALK的K9;A20；TFG-ALK的T6;A20、T3;A20。
实现上述目的的技术方案如下：
一种检测ALK融合基因的PCR引物，所述PCR引物为：针对K15;DEL15A20的SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2、针对K17;A20的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3、针对K9;A20的SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.4、针对T6;A20的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5、和/或针对T3;A20的SEQID NO.1和SEQ ID NO.6。
本发明的另一目的是提供一种检测ALK融合基因的PCR试剂盒。
实现该目的的技术方案如下：
一种检测ALK融合基因的PCR试剂盒，包括有上述的PCR引物。
在其中一个实施例中，所述PCR试剂盒还包括有阳性对照品，所述阳性对照品为：针对K15;DEL15A20的含有SEQ ID NO.1和与SEQ ID NO.2反向互补配对的序列的核酸片段、针对K17;A20的含有SEQ ID NO.1和与SEQ ID NO.3反向互补配对的序列的核酸片段、针对K9;A20的含有SEQ ID NO.1和与SEQ ID NO.4反向互补配对的序列的核酸片段、针对T6;A20的含有SEQ ID NO.1和与SEQ ID NO.5反向互补配对的序列的核酸片段、和/或针对T3;A20的含有SEQ ID NO.1和与SEQ ID NO.6反向互补配对的序列的核酸片段。更优选地，所述阳性对照品为针对K15;DEL15A20的SEQ ID NO.7、针对K17;A20的SEQ ID NO.8、针对K9;A20的SEQID NO.9、针对T6;A20的SEQ ID NO.10、和/或针对T3;A20的SEQ ID NO.11。
本发明的另一目的是提供一种检测ALK融合基因的液相芯片。
实现上述目的的技术方案如下：
一种检测ALK融合基因的液相芯片，包括有：
（A）上述PCR引物；
（B）.针对ALK融合基因不同融合类型分别设计的ASPE引物：每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的融合类型的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为：针对K15;DEL15A20的SEQ ID NO.12、针对K17;A20的SEQ ID NO.13、针对K9;A20的SEQ IDNO.14、针对T6;A20的SEQ ID NO.15、和/或针对T3;A20的SEQ ID NO.16；所述tag序列选自SEQ ID NO.17—SEQ ID NO.26；
（C）.有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.27—SEQ ID NO.36，且所述anti-tag序列能相应地与（B）中所选的tag序列互补配对。
在其中一个实施例中，所述ASPE引物为：针对K15;DEL15A20的由SEQ ID NO.17和SEQID NO.12组成的序列、针对K17;A20的由SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.13组成的序列、针对K9;A20的由SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.14组成的序列、针对T6;A20的由SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.15组成的序列、和/或针对T3;A20的由SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.16组成的序列。
本发明的另一目的是提供一种用于检测ALK融合基因的特异性引物。
具体技术方案如下：
一种用于检测ALK融合基因的特异性引物，所述特异性引物为：针对K15;DEL15A20的SEQ ID NO.12、针对K17;A20的SEQ ID NO.13、针对K9;A20的SEQ ID NO.14、针对T6;A20的SEQ ID NO.15、和/或针对T3;A20的SEQ ID NO.16。
本发明的主要优点在于：
1、本发明所提供的ALK融合基因检测液相芯片与测序法的吻合率高达100％。
2、本发明的检测液相芯片步骤简单，使用逆转录产物作为模板，通过严格筛选的PCR引物，通过一步PCR即可完成含有5种KIF5B-ALK、KLC1-ALK、TFG-ALK融合基因亚型的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的定性分析特征。
3、本发明的检测试剂盒使用含有目标检测融合亚型序列的质粒载体作为阳性对照品，进一步保证了检测的准确性和可靠性。
4、本发明所制备的KIF5B-ALK、KLC1-ALK、TFG-ALK融合基因的液相芯片具有非常好的信号-噪声比，所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应，同时，本发明设计的ASPE型特异性引物具有非常好的特异性，能准确区分各种型别的融合基因亚型。
5、本发明所提供的检测方法所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合实际应用的需要。
6、本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。
说明书附图
图1是实施例2中PCR扩增的组1的聚丙烯酰胺凝胶电泳图片。
具体实施方式
本发明实施例中未说明的常规条件和方法，按照本领域技术人员采用的常规方法来进行，如《分子克隆实验指南》第三版，或按照生产厂商所提供的操作方法来实施。
实施例1一种检测ALK融合基因的融合基因检测的PCR引物和阳性对照品
一、RT-PCR扩增
1、逆转录
针对各种目标检测的KIF5B-ALK、KLC1-ALK、TFG-ALK融合基因亚型，本发明先使用随机引物对目标检测样本进行逆转录，将样本中mRNA反转录成为cDNA，具体实验步骤参照《分子克隆实验指南》，使用随机引物进行mRNA的反转录为常规操作步骤。
2、PCR扩增
表1中的融合类型为本发明目标检测的5种ALK融合基因亚型，根据该融合基因序列的核酸组成特征，利用Primer5.0设计正向引物和反向引物。使用步骤1所得的cDNA作为模板，对5种目标检测融合基因亚型进行并行扩增。
所有引物由Invitrogen公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/L Tris Buffer配制成300pmol/mL的贮存液。
其中，K9;A20表示KLC1基因的外显子9和ALK基因的外显子20发生融合。
表1KIF5B-ALK、KLC1-ALK、TFG-ALK融合基因亚型扩增引物
二、阳性对照品
本发明根据目标检测ALK融合基因的5种亚型的融合序列特征，设计核酸片段作为检测的阳性对照品，该阳性对照品为含有表1中扩增引物的正向引物和与反向引物反向互补配对的序列的核酸片段，其正向引物和反向引物反向互补配对的序列之间的核酸片段可以是人类基因组序列，也可以是来源于植物、微生物等非人源的核酸序列，且所合成的阳性对照品的片段大小与表1中相应的目标检测融合类型的扩增产物大小一致，从而实现在扩增过程中阳性对照的作用，同时，实现其它的实验目的（例如：当使用来源于植物、微生物等非人源的核酸序列时，可以避免阳性对照品中人类基因组序列对其它检测样本的阳性污染等。）
本发明检测方法中，针对各种目标检测融合基因亚型，采用插入相应人类基因组序列作为阳性对照品。具体见表2中的SEQ ID NO.7~SEQ ID NO.11，委托金唯智生物科技（北京）有限公司进行目标插入序列的合成，将经过纯化的合成序列插入到PMD18-T载体上，然后转化至大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中，通过蓝白斑筛选，构建目标检测的5种ALK融合基因亚型重组质粒DNA作为阳性对照品。构建的5种重组质粒经双向DNA测序鉴定正确。提取质粒，紫外分光光度计定量，稀释至5.0×1010拷贝/毫升于-20°C保存。
表2KIF5B-ALK、KLC1-ALK、TFG-ALK融合基因亚型阳性对照质粒的插入序列
实施例2使用实施例1中PCR引物检测ALK融合基因
1、PCR扩增
利用表1所述的PCR扩增引物，对目标检测样本的mRNA反转录产物和阳性对照品进行PCR扩增，实现5种融合基因亚型的目标序列的并行扩增，一步扩增出5条含有融合基因亚型的目标序列，产物大小如表1所示，扩增引物序列（SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.6）见上述表1所示。
首先配制PCR引物工作液：分别各取SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.6的引物贮存液100ul于1.5ml微量离心管中，混合均匀即为多重PCR引物工作液。多重PCR反应体系如下：
PCR扩增程序为：95℃3min；94℃20s，56℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min；4℃保存备用。
2、结果检测与数据分析
使用上述PCR扩增对10个样本进行检测，该步骤的PCR扩增产物中，针对目标检测样本的mRNA反转录产物，若存在某种融合类型的亚型，则扩增出相应条带，若样本中不含有某种融合类型的亚型，则不能扩增出相应的条带，该扩增产物可通过琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、Southern杂交、固相芯片、液相芯片等本领域技术的常规方法检测，从而确定是否存在某种融合基因亚型。
由上述聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物的结果可见，本发明检测方法的扩增引物特异性高，针对5种融合基因亚型，能够特异扩增出单一条带，并可以实现多种融合基因亚型的并行检测。
实施例3一种检测ALK融合基因的液相芯片
一、ASPE引物
针对目标检测KIF5B-ALK K15;DEL 15A20、K17;A20；KLC1-ALK K9;A20；TFG-ALKT6;A20、T3;A20共5种融合亚型设计的特异性引物序列。ASPE引物由“Tag+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示：
表3ASPE引物序列（特异性引物序列）
表4ASPE引物序列（tag序列）
| 序号 | SEQ ID NO. | tag序列（5’-3'） |
| 1 | 17 | TACACTTTATCAAATCTTACAATC |
| 2 | 18 | TACATTACCAATAATCTTCAAATC |
| 3 | 19 | CAATTCATTTACCAATTTACCAAT |
| 4 | 20 | TAATCTTCTATATCAACATCTTAC |
| 5 | 21 | ATCATACATACATACAAATCTACA |
| 6 | 22 | CTACTATACATCTTACTATACTTT |
| 7 | 23 | TCAAAATCTCAAATACTCAAATCA |
| 8 | 24 | AATCCTTTCTTTAATCTCAAATCA |
| 9 | 25 | TCAATTACCTTTTCAATACAATAC |
| 10 | 26 | CTACAAACAAACAAACATTATCAA |
每条ASPE引物包括两个部分，5’端为针对相应微球上anti-tag序列的特异性tag序列，3’端为突变型或野生型特异性引物序列（如上述表3所示）。所有ASPE引物由Invitrogen公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。
二、anti-tag序列包被的微球
根据所设计的ASPE特异性引物序列，选择tag序列，最大限度地减少各微球的anti-tag序列之间以及tag与ASPE特异性引物序列可能形成的二级结构，选择的两种微球编号与微球上相应的anti-tag序列如表2所示：
表5微球编号与微球上相应的anti-tag序列
| 序号 | SEQ ID NO | 微球编号 | 微球上对应的anti-tag序列（5'-3'） |
| 1 | 27 | 11 | GATTGTAAGATTTGATAAAGTGTA |
| 2 | 28 | 86 | GATTTGAAGATTATTGGTAATGTA |
| 3 | 29 | 27 | ATTGGTAAATTGGTAAATGAATTG |
| 4 | 30 | 58 | GTAAGATGTTGATATAGAAGATTA |
| 5 | 31 | 46 | TGTAGATTTGTATGTATGTATGAT |
| 6 | 32 | 63 | AAAGTATAGTAAGATGTATAGTAG |
| 7 | 33 | 55 | TGATTTGAGTATTTGAGATTTTGA |
| 8 | 34 | 20 | TGATTTGAGATTAAAGAAAGGATT |
| 9 | 35 | 18 | GTATTGTATTGAAAAGGTAATTGA |
| 10 | 36 | 94 | TTGATAATGTTTGTTTGTTTGTAG |
选择的10种微球购自美国Luminex公司，将anti-tag序列包被与微球上。anti-tag序列与微球之间连接有5－10个T的间隔臂序，即在每个anti-tag序列前加上一段5－10个T的间隔臂序列，anti-tag序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的anti-tag序列用灭菌ddH2O配成100nmol/ml的贮存液。微球包被的过程如下：
分别取5×106个上述编号的羧基化的微球（购自Luminex公司）悬浮于50ul 0.1mol/L的MES溶液中（pH4.5），加入10ul合成的anti-tag分子（100nmol/ml）。配制10ng/ml的EDC（N-（3-Dimethylaminopropyl）-N-ethylcarbodiimide）（购自Pierce Chemical公司）工作液。往微球悬液中加入2.5ul的EDC工作液，恒温孵育30分钟，再加入2.5ul的EDC工作液，再恒温孵育30分钟。反应结束后，用0.02％的Tween-20洗涤一次，再用0.1％的SDS液洗涤一次。将洗涤后的包被有anti-tag序列的微球重悬于100ul的Tris-EDTA溶液[10mmol/L Tris（pH8.0），1mmol/LEDTA中，2-8℃避光保存。
三、从样本中扩增出可能存在融合序列的引物
本发明提供一种检测实施例1中RT-PCR扩增产物的检测方法，使用实施例2中的检测方法对目标检测的5种融合基因亚型和阳性对照品进行PCR扩增，具体的正向引物和反向引物，如表1所示，具体的操作步骤见实施例2。
实施例4运用实施例3中融合基因检测液相芯片对样本的检测
所述各种溶液的配方如下：
50mM的MES缓冲液（pH5.0）配方（250ml）：
2×Tm杂交缓冲液
| 试剂 | 来源 | 终浓度 | 每250ml的用量 |
| 1MTris-HCl，pH8.0 | SigmaT3038 | 0.2M | 50ml |
| 5MNaCl | Sigma S5150 | 0.4M | 20ml |
| Triton X-100 | Sigma T8787 | 0.16％ | 0.4ml |
过滤后贮存于4℃。
ExoSAP-IT试剂盒购自美国USB公司。
生物素标记的dCTP购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
一、样本的RNA的准备
样本RNA的抽提操作，具体见《分子克隆实验指南》第三版，并使用随机引物对样本mRNA进行逆转录，参见实施例1。
二、待测样品的PCR扩增
使用实施例2中的检测方法，利用表1所述的PCR扩增引物，对目标检测样本的mRNA反转录产物和阳性对照品进行PCR扩增，实现5种融合基因亚型的目标序列的并行扩增，一步扩增出5条含有融合基因亚型的目标序列，产物大小如表1所示。引物序列（SEQ IDNO.1~SEQ IDNO.6）见上述表1所示。
首先配制PCR引物工作液：分别各取SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.6的引物贮存液100ul于1.5ml微量离心管中，混合均匀即为多重PCR引物工作液。多重PCR反应体系如下：
PCR扩增程序为：95℃3min；94℃20s，56℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min；4℃保存备用。
三、PCR产物的酶切处理
参照ExoSAP-IT试剂盒说明，详细步骤如下：
1.取7.5ul PCR反应后的产物，加入3ul ExoSAP-IT酶；
2.37℃孵育15min。80℃孵育15min，使多余的酶灭活。酶切处理后的产物直接用于后续的ASPE引物延伸反应。
四、位点特异的引物延伸反应（ASPE）
利用表3设计的位点特异性引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记，本实施例使用的ASPE引物的组成如下表所示：
首先配制混合的ASPE引物工作液：取相应的ASPE引物贮存液各10ul于1.5ml微量离心管中，加入10mmol/L Tris Buffer补至200ul，混合均匀即为ASPE混合引物工作液。ASPE反应的体系如下：
PCR程序为：96℃2min；94℃30s，58℃1min，72℃2min，30个循环；4℃保存备用。
五、杂交反应
1.根据设计的ASPE引物，选择如实施例3所述的5种包被有anti-tag序列的微球（微球浓度均为2.5×105个/ml）。
2.分别取1ul每种编号的微球于1.5ml的微量离心管中；
3.微球于≥10000g离心1-2min；
4.弃去上清，微球重悬于100ul的2×Tm杂交缓冲液中，涡旋混匀；
5.取25ul上述微球悬液于96孔滤板相应的孔中，对照孔加25ul的ddH2O；
6.取5-25ul的ASPE反应液于相应的孔中，用ddH2O补足至50ul；
7.用锡箔纸包住96孔板以避光，95℃60s，37℃15min孵育杂交；
8.杂交后的微球于≥3000g离心2－5min；
9.去上清，将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中；
10.微球于≥3000g离心2－5min；
11将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中，加入15ul浓度为10ug/ml的链霉亲和素-藻红蛋白（SA-PE）；
12.37℃孵育15min，于Luminex仪器上检测。
六、结果检测与数据分析
反应后产物通过Luminex系列分析仪器检测。以突变型荧光值（MFI）大于100为cut-off值，当突变型检测的MFI值大于100时，判定该样本存在该突变类型，否则判定该样本为相应的野生型。
使用本方法检测大量样本的ALK融合基因亚型，以测序法检测与液相芯片结果作对照，同时对实施例1中的RT-PCR产物进行检测，计算本发明所提供的方法检测结果的吻合率。本方法检测20份样本的ALK融合基因亚型检测结果与测序结果吻合率达到100％。可见本发明所提供的ALK融合基因亚型检测液相芯片能够准确地检测出5种ALK融合基因亚型，且结果稳定可靠。
表6样本检测结果（MFI）
| 样本 | K15;DEL15A20 | K17;A20 | K9;A20 | T6;A20 | T3;A20 |
| 阳性对照 | 3231 | 3048 | 2691 | 3104 | 2612 |
| 阴性对照 | 11 | 21 | 13 | 22 | 19 |
| 11 | 31 | 22 | 14 | 42 | 24 |
| 12 | 31 | 27 | 31 | 37 | 23 |
| 13 | 11 | 22 | 13 | 42 | 27 |
| 14 | 28 | 30 | 15 | 24 | 38 |
| 15 | 11 | 31 | 34 | 28 | 28 |
| 16 | 16 | 39 | 28 | 32 | 35 |
| 17 | 19 | 43 | 14 | 25 | 39 |
| 18 | 23 | 28 | 17 | 44 | 26 |
| 19 | 25 | 44 | 18 | 42 | 28 |
| 20 | 21 | 43 | 20 | 25 | 26 |
| 21 | 27 | 34 | 3227 | 34 | 39 |
| 22 | 13 | 35 | 15 | 41 | 22 |
| 23 | 3510 | 32 | 27 | 32 | 22 |
| 24 | 14 | 42 | 23 | 23 | 36 |
| 25 | 29 | 45 | 17 | 2978 | 20 |
| 26 | 32 | 32 | 30 | 30 | 26 |
| 27 | 23 | 38 | 33 | 29 | 21 |
| 28 | 33 | 30 | 17 | 27 | 31 |
| 29 | 21 | 28 | 13 | 44 | 29 |
| 30 | 33 | 33 | 27 | 32 | 29 |
表7样本KIF5B-ALK融合基因分析结果
| 样本号 | 液相芯片检测结 | 测序检测结果 |
| 11 | 野生型 | 野生型 |
| 12 | 野生型 | 野生型 |
| 13 | 野生型 | 野生型 |
| 14 | 野生型 | 野生型 |
| 15 | 野生型 | 野生型 |
| 16 | 野生型 | 野生型 |
| 17 | 野生型 | 野生型 |
| 18 | 野生型 | 野生型 |
| 19 | 野生型 | 野生型 |
| 20 | 野生型 | 野生型 |
| 21 | K9;A20融合 | K9;A20融合 |
| 22 | 野生型 | 野生型 |
| 23 | K15;DEL15A20 | K15;DEL15A20 |
| 24 | 野生型 | 野生型 |
| 25 | T6;A20融合 | T6;A20融合 |
| 26 | 野生型 | 野生型 |
| 27 | 野生型 | 野生型 |
| 28 | 野生型 | 野生型 |
| 29 | 野生型 | 野生型 |
| 30 | 野生型 | 野生型 |
实施例5Tag序列及Anti-Tag序列的选择
一、液相芯片制备的设计（Tag序列及Anti-Tag序列的选择）
以ALK融合基因的K17;A20；K9;A20；T3;A20亚型的检测液相芯片为例，针对该3种融合基因亚型设计ASPE引物3’端的特异性引物序列（如表3所示），而ASPE引物5’端的Tag序列则选自SEQ ID NO.17-SEQ ID NO.26，相应的，包被于微球上的与对应tag序列互补配对的anti-tag序列选自SEQ ID NO.27-SEQ ID NO.36。具体设计如下表（表8）所示。特异性引物序列的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1、实施例2和实施例4所述。
表8液相芯片制备的设计
二、样品检测
采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品31-50进行检测，检测结果如下：
表9样本检测结果（MFI）
表10样本ALK融合基因亚型检测结果分析
| 样本号 | 液相芯片检测结 | 测序检测结果 |
| 31 | 野生型 | 野生型 |
| 32 | 野生型 | 野生型 |
| 33 | 野生型 | 野生型 |
| 34 | 野生型 | 野生型 |
| 35 | 野生型 | 野生型 |
| 36 | 野生型 | 野生型 |
| 37 | 野生型 | 野生型 |
| 38 | K9;A20融合 | K9;A20融合 |
| 39 | 野生型 | 野生型 |
| 40 | 野生型 | 野生型 |
| 41 | 野生型 | 野生型 |
| 42 | 野生型 | 野生型 |
| 43 | 野生型 | 野生型 |
| 44 | 野生型 | 野生型 |
| 45 | 野生型 | 野生型 |
| 46 | 野生型 | 野生型 |
| 47 | 野生型 | 野生型 |
| 48 | 野生型 | 野生型 |
| 49 | 野生型 | 野生型 |
| 50 | 野生型 | 野生型 |
从上述实施例可见，其它针对不同融合亚型的液相芯片，ASPE引物运用不同的tag序列，其结果依然稳定可靠，具体数据省略。而ASPE引物选用实施例4中tag序列与特异性引物序列搭配时，效果更佳（信噪比更好），参见本实施例试验组1。其它不同tag序列与特异性引物序列搭配，与实施例4和本实施例的结果相同，具体数据省略。
实施例6交叉反应率检测
一、实验目的
针对本发明融合基因并行检测液相芯片，进行交叉反应率的检测。取阳性对照质粒，检测KIF5B-ALK的K15;DEL15A20、K17;A20；KLC1-ALK的K9;A20；TFG-ALK的T6;A20、T3;A20共5种融合亚型的交叉反应率。
二、操作步骤
1、配制阳性对照质粒的混合液（简称：样本质粒），该混合液含有每种质粒的浓度为106拷贝/uL，上样10uL，重复3次。
2、对阳性对照质粒的混合液进行PCR扩增，一步扩增出5条含有融合基因亚型的目标序列，产物大小如表1所示。
配制PCR引物工作液：分别各取SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.6的引物贮存液100ul于1.5ml微量离心管中，混合均匀即为多重PCR引物工作液。多重PCR反应体系如下：
PCR扩增程序为：95℃3min；94℃20s，56℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min；4℃保存备用。
三、PCR产物的酶切处理（如实施例4所示）
四、位点特异的引物延伸反应（如实施例4所示）
利用表3设计的位点特异性引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记,本实施例使用的ASPE引物的组成如实施例4所示。
针对5种基因融合亚型，分别取相应的ASPE引物，配制成ASPE工作液：取相应的ASPE引物贮存液各10ul于1.5ml微量离心管中，加入10mmol/L Tris Buffer补至200ul，混合均匀即为ASPE引物工作液。分别配制5种针对不同融合类型的ASPE工作液，并使用以下体系，分别进行ASPE延伸。ASPE反应的体系如下：
PCR程序为：96℃2min；94℃30s，58℃1min，72℃2min，30个循环；4℃保存备用。
五、杂交反应（如实施例4所示）
六、结果检测与数据分析
反应后产物通过Luminex系列分析仪器检测。
表11样本质粒检测结果
实施例7ALK融合基因突变检测特异性引物序列的选择
一、液相芯片制备的设计（野生型和突变型特异性引物序列的选择）
以ALK融合基因K15;A20；K9;A20；T6;A20亚型的检测液相芯片为例，以该突变位点所在目标序列的正向或反向互补序列为模板，分别针对K15;A20；K9;A20；T6;A20亚型设计ASPE引物3’端的特异性引物序列，包括本发明实施例1中优选的特异性引物序列和2条备选的特异性引物序列，如表12所示。
表12特异性引物序列
以ALK融合基因K15;A20；K9;A20；T6;A20亚型的检测液相芯片为例，针对K15;A20；K9;A20；T6;A20亚型选用不同的特异性引物序列，而ASPE引物5’端的tag序列则固定为实施例4中的最佳效果序列，并选用与之相对应的anti-tag序列，具体设计如下表（表13）所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例3和实施例4所述。
表13液相芯片制备的设计
二、样品检测
采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品51-70进行检测，检测结果如下：
表14样本检测结果（MFI）
表15样本ALK融合基因亚型检测结果分析
| 样本号 | 液相芯片检测结 | 测序检测结果 |
| 51 | 野生型 | 野生型 |
| 52 | 野生型 | 野生型 |
| 53 | 野生型 | 野生型 |
| 54 | 野生型 | 野生型 |
| 55 | 野生型 | 野生型 |
| 56 | K15;A20融合 | K15;A20融合 |
| 57 | 野生型 | 野生型 |
| 58 | 野生型 | 野生型 |
| 59 | 野生型 | 野生型 |
| 60 | 野生型 | 野生型 |
| 61 | 野生型 | 野生型 |
| 62 | T6;A20融合 | T6;A20融合 |
| 63 | 野生型 | 野生型 |
| 64 | 野生型 | 野生型 |
| 65 | 野生型 | 野生型 |
| 66 | 野生型 | 野生型 |
| 67 | 野生型 | 野生型 |
| 68 | 野生型 | 野生型 |
| 69 | 野生型 | 野生型 |
| 70 | 野生型 | 野生型 |
由本实施例可见，ASPE引物选用实施例4中特异性引物序列与tag序列搭配时，效果更佳（信噪比更好），参见本实施例试验组4。其它来源于目标检测位点所在序列的正向或反向互补序列的不同特异性引物序列与tag序列搭配，与实施例4和本实施例的结果相同，即依然是实施例4中所述的特异性引物序列与不同的tag序列搭配效果更佳，具体数据省略。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (8)
1.一种检测ALK融合基因的PCR引物，其特征是，所述PCR引物为：针对K15;DEL15A20的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、针对K17;A20的SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.3、针对K9;A20的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4、针对T6;A20的SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.5、和/或针对T3;A20的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.6。
2.一种检测ALK融合基因的PCR试剂盒，其特征是，包括有权利要求1所述的PCR引物。
3.根据权利要求2所述的PCR试剂盒，其特征是，所述PCR试剂盒还包括有阳性对照品，所述阳性对照品为：针对K15;DEL15A20的含有SEQ ID NO.1和与SEQ ID NO.2反向互补配对的序列的核酸片段、针对K17;A20的含有SEQ ID NO.1和与SEQ ID NO.3反向互补配对的序列的核酸片段、针对K9;A20的含有SEQ ID NO.1和与SEQ ID NO.4反向互补配对的序列的核酸片段、针对T6;A20的含有SEQ ID NO.1和与SEQ ID NO.5反向互补配对的序列的核酸片段、和/或针对T3;A20的含有SEQ ID NO.1和与SEQ ID NO.6反向互补配对的序列的核酸片段。
4.根据权利要求3所述的PCR试剂盒，其特征是，所述阳性对照品为针对K15;DEL15A20的SEQ ID NO.7、针对K17;A20的SEQ ID NO.8、针对K9;A20的SEQ ID NO.9、针对T6;A20的SEQ ID NO.10、和/或针对T3;A20的SEQ ID NO.11。
5.一种检测ALK融合基因的液相芯片，其特征是，包括有：
（A）权利要求1所述的PCR引物；
（B）.针对ALK融合基因不同融合类型分别设计的ASPE引物：每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的融合类型的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为：针对K15;DEL15A20的SEQ ID NO.12、针对K17;A20的SEQ ID NO.13、针对K9;A20的SEQ IDNO.14、针对T6;A20的SEQ ID NO.15、和/或针对T3;A20的SEQ ID NO.16；所述tag序列选自SEQ ID NO.17-SEQ ID NO.26；
（C）.有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.27-SEQ ID NO.36，且所述anti-tag序列能相应地与（B）中所选的tag序列互补配对。
6.根据权要求5所述的液相芯片，其特征是，所述ASPE引物为：针对K15;DEL15A20的由SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.12组成的序列、针对K17;A20的由SEQ ID NO.18和SEQ IDNO.13组成的序列、针对K9;A20的由SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.14组成的序列、针对T6;A20的由SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.15组成的序列、和/或针对T3;A20的由SEQ ID NO.21和SEQID NO.16组成的序列。
7.根据权利要求5或6所述的液相芯片，其特征是，所述间隔臂为5-10个T。
8.一种用于检测ALK融合基因的特异性引物，其特征是，所述特异性引物为：针对K15;DEL15A20的SEQ ID NO.12、针对K17;A20的SEQ ID NO.13、针对K9;A20的SEQ IDNO.14、针对T6;A20的SEQ ID NO.15、和/或针对T3;A20的SEQ ID NO.16。
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