CN103789304A - 基于梨基因组开发的irap标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公布了基于梨基因组开发的IRAP标记及其应用，属于分子生物学技术领域。所述标记引物组包括8条引物，分属于7个LTR-RT家族，除了PbrRE2属于TRIM超家族外，其余6个家族PbrRE1，PbrRE4，PbrRE5，PbrRE6，PbrRE7及PbrRE8，均属于Ty1-Copia超家族。本发明获得的IRAP引物组合具有多态性高，扩增稳定，重复性好，电泳条带清晰等优点。利用该套引物进行梨品种资源和无性系芽变品种鉴定，可以快速准确分辨梨的不同品种、鉴定无性系芽变，并反映出供试材料的遗传亲缘关系。发明的标记可应用于种质资源评价和育种亲本的选择。

Description

基于梨基因组开发的IRAP标记及其应用

一、技术领域

本发明涉及基于梨基因组开发的IRAP标记及其应用，属于分子生物技术领域，提供了8个基于梨基因组序列注释获得的LTR_RT家族开发的IRAP标记引物序列，有效鉴别了梨的品种资源多样性及芽变品种，可应用于梨种质资源评价和育种亲本的选择。

二、背景技术

梨(PyrusL.)是世界上广泛栽培的果树，在果树经济产业中占有重要地位，是我国第三大果树树种。梨按起源可划分为东方梨和西方梨，其主要栽培品种又可以划分为白梨（P.bretschneideri Rehd.）、砂梨（P.pyrifoliaNakai）、秋子梨（P.ussuriensis Maxin.）、西洋梨（P.communis L.）、新疆梨（P.sinkiangensisYü）及其他种间杂交类型。目前，梨的新品种资源繁多，同时，随着新品种的不断增多，如何快速准确鉴别不同的品种资源是梨的资源与育种研究的重要内容之一。在梨的新品种选育方法除了传统杂交育种外，其较高的芽变频率使得芽变选种在梨育种中占有越来越重要的地位，然而目前可用于梨无性系芽变品种鉴定及其与亲本之间亲缘关系遗传多样性评价的分子标记研究相对较少，因此开发高效的分子标记对芽变品种和丰富的品种资源遗传多样性进行评价，将对梨的育种工作起到重要的推动作用。

基于DNA多态性的分子标记是以个体间核苷酸序列变异为基础的遗传变异，其检测技术具有较多优势，如：没有组织特异性，不受环境季节限制，测试周期短，标记位点丰富等，已经大量应用于农作物新品种的鉴定，品种真实性的检测及品种间亲缘关系分析工作中。近年来，越来越多的科技工作者发现反转录转座子插入到功能基因位点附近可以导致其功能改变（增强或抑制），是体细胞变异的重要诱因之一。反转录转座子是以RAN为中介，反转录成DNA后进行转座复制的遗传因子，可以在基因组中产生大量的稳定遗传变异的位点。其中LTR_RT是占据植物基因组比例最大的一类反转录转座子，如：桃基因组的19%，棉花基因组的53%，甚至玉米基因组中多达70%都由LTR_RT 构成，而梨基因组中LTR_RT比例也高达43%。因此，利用LTR_RT开发分子标记相比其他常规的遗传学和分子生物学方法可以检测到更多稳定的遗传变异位点。而IRAP标记原理是根据反转录转座子的长末端重复序列（LTR）中的保守序列设计引物，检测基因组中相邻同家族反转录转座子成员之间的片段多态性，具有操作简单，多态性高，可重复性好，且开发引物费用相对较低等优点，可以用于无性系芽变品种鉴定及品种资源的多样性评价。目前，尚未有梨的IRAP标记开发和应用研究。因此，开发梨的基因组IRAP标记进行梨的品种资源多样性评价和芽变品种鉴定显得尤为重要，在品种资源评价与育种领域中有广泛的应用前景。 

三、发明内容

技术要求

本发明目的之一在于提供8个基于梨全基因组序列注释的LTR_RT家族开发的IRAP标记引物，这些引物具有多态性丰富，电泳条带清晰，重复性好且扩增稳定等优点，可用于梨无性系芽变品种鉴定及品种资源的遗传多样性评价研究。

技术方案

1、基于梨基因组开发的IRAP标记引物，是指以下8条引物中的一条或任意两条或任意多条引物：

PbrRE1-2  5’-TCAAACCAAACAATGTGGTCA-3’；

PbrRE1-4  5’-TGATTGGAAGAATGCGATCTAA-3’； 

PbrRE2-2  5’-ACCGTGATGGAATGGTAAGC-3’； 

PbrRE4-1  5’-GATAATTGATCCGGCCCATA-3’； 

PbrRE5-1  5’-AAATACCCAAGTCCCCAAGC-3’； 

PbrRE6-1  5’-AAGGAATATGGTTGGAGTCCTTC-3’； 

PbrRE7-1  5’- TGTTGGAGAGTTGACCTTTTG-3’； 

PbrRE8-1  5’- GCATGGGCAAAGTTTTCAAT-3’。

所述基于梨基因组开发的IRAP标记引物的应用，其特征在于： 

1）以提取的待测2份以上梨品种样品DNA为模板，用所述8条引物中的一条或任意两条或任意多条引物进行PCR扩增，上下游引物为同一条引物；

PCR反应体系是：20μl的总体系中含有1.0μl 浓度为100 ng/μl的模板DNA，2.5μl 10×Buffer 包含Mg2+， 1.5μl 2.5 mM dNTP，3μl 的浓度为10 pmol/μl引物，0.3μl 浓度为5 U/μl Taq DNA聚合酶。

PCR反应程序是：94℃预变性4min，然后94℃ 15s，56℃ 40s，72℃ 2min，共37个循环，72℃ 延伸 10min 后在 10℃ 条件下保存； 

PCR产物加入4.0μl 6 X loading buffer，95℃ 变性5min，冰浴5min，采用质量比8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；

2）以2000bp Marker为DNA分子量标准，统计各待测样品的扩增条带数，各条带进行编号后，使用软件POPGENE v.1.32计算待测两两品种间的DICE遗传相似系数；

3）利用NTSYS pc V 2.1 软件的SHAN模块对两两品种间的DICE遗传相似系数矩阵进行基于UPGMA法的聚类分析，得到的聚类结果显示品种间遗传关系远近。

根据步骤3）所述的聚类结果，可以进行梨无性系芽变品真实性鉴定或品种资源的遗传多样性评价。 

  

有益效果

1. 首次利用梨的基因组信息，注释LTR-RT反转录转座子，并开发新型的分子标记，这为实现基于分子标记的育种策略和品种鉴定，从而为梨品种资源评价、鉴定无性系芽变，以及育种亲本的选配等起到很好的辅助作用，提高育种科学性和技术水平。

2. 本发明开发了8条梨的IRAP标记的引物，该引物在梨基因组中分布均匀，多态性丰富，扩增条带清晰且稳定易于统计，除了可用于梨种质资源的指纹图谱构建、遗传多样性评价，品种审定，品种权保护，以及种质资源管理等领域外，相比于其他标记，还可以有效鉴定梨的无性系芽变品种。 

3. 开发的梨的IRAP标记可以鉴定不同品种资源的特异谱带，提供品种鉴定的依据，从而为保护育种者、生产者和消费者的合法权益，促进梨产业的健康发展提供有效依据。 

四、附图说明

图1引物PbrRE1-2，PbrRE1-4，PbrRE2-2及PbrRE4-11在10份梨材料中检测到的可稳定扩增的多态性条带； 

图2引物PbrRE1-4在33份梨品种材料中检测到的多态性，可以检测到丰富稳定的带型； 

五、具体实施方式

实施例1：

梨基因组IRAP标记在梨品种资源多样性评价及无性系芽变品种鉴定中的应用：

1. 品种材料

选取的33份梨品种包括13个母本品种及其20个无性系芽变品种，分属于5个栽培种，即白梨，砂梨，秋子梨，西洋梨及新疆梨（表1）。

2. 基于梨全基因组序列注释重复序列，获得8个拷贝数较多的LTR_RT家族，并开发IRAP标记引物，其获得方法步骤如下： 

a) 梨全基因组序列获得

梨全基因组序列从梨基因组计划网站下载（http://peargenome.njau.edu.cn/），共512Mb，2103个scaffold，覆盖基因组97.1%。

b) 梨基因组序列中LTR_RT家族注释及鉴定 

利用LTR反转录转座子注释软件LTR_STRUC （McCarthy EM, McDonald JF, 2003, LTR_STRUC: a novel search and identification program for LTR retrotransposons. Bioinformatics 19: 362-367)根据LTR_RT结构特点对梨基因组序列进行LTR_RT搜索，对搜索结果进行人工检测，去除假阳性LTR_RT；根据真实LTR_RT的5’端LTR序列进行家族分类，标准为：LTR序列相似度>80%认为是同一家族LTR_RT；最后用cross_match软件对每个家族LTR_RT在全基因组范围进行同源比对，从而获得第一轮结构搜索漏掉的LTR_RT成员。同一家族LTR-RT的LTR序列相似度>80%，完整的LTR-RT内部一般包括gag-pol基因，根据编码基因顺序的不同，LTR-RT通常可以分为Ty1-Copia 和 Ty3-Gypsy 两个超家族，而内部缺失编码基因的LTR-RT根据其序列长短又可以分为LARD 和 TRIM两个超家族。本发明中所开发的8条IRAP标记引物，分属于7个LTR-RT家族，除了PbrRE2属于TRIM超家族外，其余6个家族，PbrRE1，PbrRE4，PbrRE5，PbrRE6，PbrRE7及PbrRE8，均属于Ty1-Copia超家族。

c) 梨基因组基于LTR_RT的IRAP标记引物设计 

对注释的8个拷贝数高的LTR_RT家族分别进行IRAP引物设计，共设计18条引物。以其中一个家族为例，首先用Muscle软件对该家族所有成员5’端LTR序列进行比对，选择保守区域用Primer5.0进行引物设计；引物设计条件：退火温度为55~65℃，GC含量为45~60%，引物长度为18~25bp，由Invitrogen（上海）贸易有限公司合成。

3. 利用上述IRAP标记引物对梨无性系芽变品种鉴定及品种资源遗传多样性评价的方法，其步骤如下： 

a) 利用CTAB法提取DNA

b) 梨基因组IRAP标记引物的扩增与筛选

利用上述合成的18条引物，以10份梨品种基因组DNA为模板进行扩增，根据扩增结果，筛选出多态性丰富，条带清晰且可以稳定扩增的8条引物（表2），图1为8条引物对PbrRE1-2，PbrRE1-4，PbrRE2-2及PbrRE4-1在10份梨材料中的扩增指纹带型，丰富的多态性表明这些引物可以用于梨品种资源遗传多样性评价及芽变品种鉴定。 

c) 以提取的待测样品DNA为模板，利用步骤b)筛选的8条引物序列对33份梨品种材料进行PCR扩增。PCR反应体系是：20μl的总体系中含有1.0μl 浓度为100 ng/μl的模板DNA，2.5μl 10×Buffer (Mg²⁺ )， 1.5μl 2.5 mM dNTP，3μl 的浓度为10 pmol/μl引物，0.3μl 浓度为5 U/μl Taq DNA聚合酶。PCR反应程序是：94℃预变性4min，然后94℃ 15s，56℃ 40s，72℃ 2min，共37个循环，72℃ 延伸 10min 后在 10℃ 条件下保存。PCR产物加入4.0μl 6 X loading buffer，95℃ 变性5min，冰浴5min，采用质量比8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。取3μl样品以2000bp Marker为DNA分子量标准，60W恒功率电泳1.5h，银染显色。图2为引物PbrRE1-4在33份梨品种中的指纹带型，可以检测到丰富稳定的多态性。 

d) 根据电泳图片进行扩增图谱分析 

根据电泳图片结果，记录扩增图谱，每个位置条带分别进行编号，若有扩增条带显示记为‘1’，若无则记为‘0’，从而建立供试材料扩增图谱信息数据库；

e) 利用步骤d) 统计结果进行梨无性系芽变品鉴定及品种资源的遗传多样性评价。 使用POPGENE v.1.32 (Yeh, Yang et al. 1999, POPGENE, version 1.32: the user friendly software for population genetic analysis. Molecular Biology and Biotechnology Centre, University of Alberta, Edmonton, AB, Canada.)计算种间的DICE遗传相似系数，基于相似系数矩阵，利用NTSYS pc V 2.1 (Yeh, Yang et al. 1999, NTSYS, version 1.32: the user friendly software for population genetic analysis. Molecular Biology and Biotechnology Centre, University of Alberta, Edmonton, AB, Canada)软件的SHAN模块进行基于UPGMA法的聚类分析。

4. 结果分析 

利用筛选的8条引物分别33个品种（包括13个梨芽变系）进行IRAP图谱分析，结果发现8条引物均能扩增出清晰稳定的带型。33份梨无性系芽变品种间遗传相似性系数值变动范围是0.375-0.975，其中‘鸭梨’和西洋梨‘早红考密斯’遗传相似系数最小，表明二者间亲缘关系最远，而‘考密斯’与其芽变品种‘红考密斯’遗传相似系数最大，表明其亲缘关系最近，即二者发生的遗传变异最小。

对33份梨无性系芽变品种进行聚类分析，当遗传相似系数为0.53时，所有品种可以聚成两大类，第一组为来自中国和日本地区的东方梨，而第二组为来自美国和英国的西洋梨。聚类分析表明，通过8条IRAP标记组合基本可以将所有的无性系分别聚类，也可以将东方梨与西方梨分别聚类。很好的反映了不同梨品种资源间的遗传多样性和亲缘关系。 

通过不同的标记引物组合可以有效的区分33个梨品种材料（表3）。例如，我们发现引物PbrRE6-1与引物PbrRE8-1扩增图谱可以用来鉴定除了 ‘考密斯’无性系外所有的无性系芽变品种，而‘考密斯’无性系的3个品种可以通过引物PbrRE6-1和引物PbrRE1-4的扩增图谱来进行区分鉴定。引物PbrRE1-4第一条扩增带可以将芽变品种‘红考密斯’鉴定出来（图2），而引物PbrRE6-1的第一条扩增条带可以用来区分‘考密斯’和‘早红考密斯’两个品种。 

因此，通过8条IRAP标记引物我们不但可以进行梨品种间遗传多样性分析，相对于其他标记而言，还可以有效的进行梨无性系芽变品种鉴定，这将更有利于保护育种者、生产者和消费者的合法权益。同时，鉴定的遗传差异较大的品种，对于杂交育种亲本的选配，发挥杂种优势有很好的指导作用。 

  

表1. 本发明中用于梨无性系芽变品种鉴定及亲缘关系遗传多样性评价的品种材料

以上品种均为公知公用，各品种参见参考文献：

王月志, 戴美松, 张树军, 施泽彬. 我国梨芽变育成品种分析及芽变性状变异机制研究进展. 果树学报, 2010，29 (4): 676-682.

路娟, 吴俊, 张绍铃, 吴华清, 张妤艳. 不同系统梨种质遗传多样性与分类关系的SSR分析. 南京农业大学学报，2011,34(2):38-46. 

姜雪婷, 杜玉虎, 张绍铃, 吴俊. 梨43个品种花粉生活力及4种测定方法的比较. 果树学报, 2006, 23( 2) : 178-181.

田路明, 曹玉芬, 董星光. 二十世纪梨“家族”资源极其育种价值. 中国南方果树, 2010, 39 (2): 62-65.

 Zhang MY, Fan lian, Liu Qingzhong, Song yue, Wei Shuwei, Zhang Shaoling, Wu Jun. A novel set of EST-derived SSR markers for pear and cross-species transferability in Rosaseae. Plant Mol Biol Rep. 2013, 10 1007. 

表2. 8条IRAP标记引物信息及其在10份梨品种材料中的扩增多态性

注释：h 代表Nei’s (1973) 基因多样性, I 代表香浓信息指数 (Lewontin 1972)

表3. 8条IRAP标记引物区分无性系芽变品种情况 

接上表

注：（1）‘+’表示该引物对可以区分该无性系芽变品种；‘-’表示该引物对无法区分相应无性系芽变品种。

（2）引物PbrRE6-11和引物PbrRE8-1扩增图谱可以用来鉴定除了 ‘考密斯’无性系外所有的无性系芽变品种，而‘考密斯’无性系的3个品种需要通过引物PbrRE6-和PbrRE1-4的扩增图谱来进行区分鉴定。 

SEQUENCE LISTING

 

 

<110>  南京农业大学

 

 

<120>  基于梨基因组开发的IRAP标记及其应用

 

 

<130>  说明书

 

 

<160>  8    

 

 

<170>  PatentIn version 3.1

 

 

<210>  1

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  PbrRE1-2

<222>  (1)..(21)

<223> 

 

 

 

<400>  1

tcaaaccaaa caatgtggtc a                                               21

 

 

<210>  2

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  PbrRE1-4

<222>  (1)..(22)

<223> 

 

 

 

<400>  2

tgattggaag aatgcgatct aa                                              22

 

 

<210>  3

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  PbrRE2-2

<222>  (1)..(20)

<223> 

 

 

 

<400>  3

accgtgatgg aatggtaagc                                                 20

 

 

<210>  4

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  PbrRE4-1

<222>  (1)..(20)

<223> 

 

 

 

<400>  4

gataattgat ccggcccata                                                 20

 

 

<210>  5

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  PbrRE5-1

<222>  (1)..(20)

<223> 

 

 

 

<400>  5

aaatacccaa gtccccaagc                                                 20

 

 

<210>  6

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  PbrRE6-1

<222>  (1)..(23)

<223> 

 

 

 

<400>  6

aaggaatatg gttggagtcc ttc                                             23

 

 

<210>  7

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  PbrRE7-1

<222>  (1)..(21)

<223> 

 

 

 

<400>  7

tgttggagag ttgacctttt g                                               21

 

 

<210>  8

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  PbrRE8-1

<222>  (1)..(20)

<223> 

 

 

 

<400>  8

gcatgggcaa agttttcaat                                                 20

 

 

Claims (3)

1.基于梨基因组开发的IRAP标记引物，是指以下8条引物中的一条或任意两条或任意多条引物：

PbrRE1-2  5’-TCAAACCAAACAATGTGGTCA-3’；

PbrRE1-4  5’- TGATTGGAAGAATGCGATCTAA-3’； 

PbrRE2-2  5’- ACCGTGATGGAATGGTAAGC-3’； 

PbrRE4-1  5’-GATAATTGATCCGGCCCATA-3’； 

PbrRE5-1  5’-AAATACCCAAGTCCCCAAGC-3’； 

PbrRE6-1  5’- AAGGAATATGGTTGGAGTCCTTC-3’； 

PbrRE7-1  5’- TGTTGGAGAGTTGACCTTTTG-3； 

PbrRE8-1  5’- GCATGGGCAAAGTTTTCAAT-3’。

2.权利要求1所述基于梨基因组开发的IRAP标记引物的应用，其特征在于：

1）以提取的待测2份以上梨品种样品DNA为模板，用权利要求1所述8条引物中的一条或任意两条或任意多条引物进行PCR扩增，上下游引物为同一条引物；

PCR反应体系是：20μl的总体系中含有1.0μl 浓度为100 ng/μl的模板DNA，2.5μl 10×Buffer 包含Mg²⁺， 1.5μl 2.5 mM dNTP，3μl 的浓度为10 pmol/μl引物，0.3μl 浓度为5 U/μl Taq DNA聚合酶；

PCR反应程序是：94℃预变性4min，然后94℃ 15s，56℃ 40s，72℃ 2min，共37个循环，72℃ 延伸 10min 后在 10℃ 条件下保存；

PCR产物加入4.0μl 6 X loading buffer，95℃ 变性5min，冰浴5min，采用质量比8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；

2）以2000bp Marker为DNA分子量标准，统计各待测样品的扩增条带数，各条带进行编号后，使用软件POPGENE v.1.32计算待测两两品种间的DICE遗传相似系数；

3）利用NTSYS pc V 2.1 软件的SHAN模块对两两品种间的DICE遗传相似系数矩阵进行基于UPGMA法的聚类分析，得到的聚类结果显示品种间遗传关系远近。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：根据权利要求2步骤3）所述的聚类结果进行梨无性系芽变品种真实性鉴定或品种资源的遗传多样性评价。

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