CN103784970A - Tnf受体相关因子1（tarf1）及其抑制剂在肝脏缺血疾病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种TRAF1的抑制剂在肝缺血疾病中的应用，属于生物医药领域。本发明以TRAF1基因敲除小鼠和肝细胞特异性TRAF1转基因小鼠为实验对象，通过肝缺血再灌注损伤模型，结果表明与野生型C57小鼠对比，TRAF1基因敲除小鼠肝脏坏死明显被抑制，肝功能也明显好转，而肝细胞特异性TRAF1转基因小鼠的肝脏坏死则明显增加，且肝功能明显恶化。因此TRAF1基因具有恶化肝功能的作用，特别是TRAF1基因能够恶化肝缺血疾病的作用。针对TRAF1的上述功能，提供TRAF1作为肝缺血疾病治疗的药物靶标在研制肝缺血疾病药物中应用。

Description

TNF 受体相关因子 1 （ TARF 1 ）及其抑制剂在肝脏缺血疾病中的应用

技术领域

本发明属于基因的功能与应用领域，特别涉及一种肿瘤坏子因子（TNF）受体相关因子1（TNF receptor-associated factor 1，TRAF1）作为药物靶标在筛选治疗肝缺血疾病药物中的应用, 以及TRAF1的抑制剂在制备治疗肝缺血疾病药物中的应用。

背景技术

缺血-再灌注损伤（ischemia/reperfusion injury，I/R）是现今研究的热点问题之一，是肝脏移植、肝脏瘤切除术以及失血性休克等疾病和手术所共同经历的一个病理过程，其机制相当复杂，多种因素参与其中。现在的理论研究和临床实践都证实，在血液供应阻断30min以上就会引起各细胞器超微结构的改变和功能障碍，导致细胞不可逆的损伤乃至死亡，及时恢复血液供应被视为挽救这部分组织的重要措施。

缺血再灌注损伤是指组织缺血缺氧达到一定的时间和程度引起细胞发生病理改变，在恢复血液供应后不一定使病变的细胞恢复功能，反而在一定条件下进一步加重的现象。导致缺血再灌注损伤的原因很多，确切的发病机制仍不十分清楚。目前，对于肝脏缺血再灌注损伤发生机制的研究己成为移植界关注的热点。在肝脏，肝脏缺血再灌注后肝窦内皮细胞和枯否(Kupffer cells)细胞活化，释放出多种炎性因子如氧自由基、细胞因子等，引起中性粒细胞趋化，粘附聚集，变形穿过肝窦内皮并浸润至肝细胞之间，然后活化释放出多种效应介质，最终引起肝脏细胞的坏死和凋亡。

众多文献资料表明缺血再灌注损伤可能与下列因素有关：1．氧自由基的生成；2．钙超载；3．细胞因子的参与；4．Kupffer细胞及中性粒细胞激活；5．内皮素(Endothelin，ET)和一氧化氮(NO)浓度的失衡。肝脏缺血过程中由于肝细胞内ATP迅速耗尽，导致乳酸酮体等的堆积，及线粒体氧化磷酸化功能低下，引发代谢性酸中毒，缺血过程中细胞缺氧使ATP含量下降，导致肝细胞内外Ca²⁺重新分布，即Ca²⁺内流，引起线粒体的损伤。再灌注过程中由于氧自由基的爆发性增多，中性粒细胞的聚集，kupffer细胞的激活，细胞凋亡及其他多种细胞因子的作用，使得肝细胞膜损伤，内皮细胞损伤及肝脏微循环障碍等导致肝脏功能代谢障碍及结构破坏。总之，肝脏缺血再灌注损伤是由各种机制相互影响，综合作用的结果，进一步了解及明确其作用机制，将对临床防治肝脏缺血再灌注损伤有着重要的意义。

肿瘤坏子因子（TNF）受体相关因子家族（TNF receptor-associated factor，TRAF）是一类结构相似的衔接蛋白，作为细胞内信号分子在 TNFR超家族、Toll 样/白介素1受体（Toll/IL-1 receptor, TIR）超家族和 RIG样受体（RLR）家族上游信号传导中发挥重要作用。目前哺乳动物中 TRAF 家族共有7个成员，分别为 TRAF1-7。TRAF包含一个大约230氨基酸长的C末端特征性TRAF结构域，介导TRAF蛋白形成同源或异源二聚体或结合其他衔接分子及信号传导分子。该结构域可分为高度保守的近C端（TRAF-C）和差异较大的近N端（TRAF-N）两个亚结构域，这种差异决定TRAF在特定环境和细胞类型下结合不同的受体或信号活化物。除TRAF1以外，TRAF2-7还包含一个高度保守的N末端指环结构域（RING finger domain）。TRAF具有调控宿主防御、炎症、和自身免疫等重要生物学功能，并在细胞分化、增殖、凋亡发挥重要作用。TRAF1最早通过酵母双杂交筛选作为 TNFR2的信号传导分子被发现。尽管其他TRAF家族成员在不同组织细胞中广泛分布，TRAF1的mRNA仅能在脾、肺、睾丸等少数组织中检测到。但是研究表明，多种刺激如白介素1（IL-1）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、CD40 配体和EB病毒感染均可显著诱导TRAF1表达。体内和体外实验证明抗-CD3、抗CD40、脂多糖等刺激T细胞和 B 细胞表达TRAF1。

发明内容

为解决上述现有技术的缺陷和不足，本发明的首要目的在于提供TRAF1作为药物靶标在筛选治疗肝缺血疾病药物中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种TRAF1的抑制剂在制备治疗肝缺血疾病药物中的应用。

一种治疗肝缺血疾病的药物，包含TRAF1。

所述的TRAF1的抑制剂优选为TRAF1基因的siRNA、TRAF1基因的RNA干扰载体、TRAF1的抗体及其他能够抑制TRAF1表达的抑制剂中的一种。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明以TRAF1基因敲除小鼠和肝细胞特异性TRAF1转基因小鼠为实验对象，通过肝缺血再灌注损伤模型，结果表明与野生型C57小鼠对比，TRAF1基因敲除小鼠肝脏坏死面积明显被抑制，而肝细胞特异性TRAF1转基因小鼠的肝脏坏死面积则明显增加。这提示TRAF1基因具有恶化肝功能的作用，为TRAF1在研究防治肝缺血的新靶点和新策略中所发挥的作用提供了理论依据和临床基础。

一种TRAF1在肝缺血疾病中的功能，主要体现在TRAF1具有恶化肝功能的作用，特别是TRAF1基因能够恶化肝缺血疾病的作用。

针对TRAF1的上述功能，提供一种TRAF1作为药物靶标在筛选治疗肝缺血疾病的药物中应用。

针对TRAF1的上述功能，提供一种TRAF1的抑制剂在制备治疗肝缺血疾病的药物中应用。

所述的TRAF1的抑制剂优选为TRAF1基因的干扰载体，TRAF1的抗体及其他能够抑制TRAF1表达的抑制剂中的一种。

本发明的研究成果表明，TRAF1- KO小鼠在肝脏缺血再灌注引起的损伤中，小鼠肝脏坏死面积明显减少，炎症反应明显改善，肝细胞凋亡也明显减少。证明TRAF1基因在肝缺血疾病模型中有着重要的恶化作用。抑制TRAF1表达可以改善肝组织缺血/再灌注损伤，且可能与肝细胞凋亡密切相关。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1.本发明发现TRAF1基因的新功能，即TRAF1基因能够恶化肝缺血疾病的作用。

2. TRAF1在恶化肝缺血疾病中的作用，为研制肝缺血疾病的药物提供靶标。

附图说明

图1是肝细胞特异性TRAF1转基因小鼠的构建及鉴定结果图

A为TRAF1载体的构建图；

B为肝细胞特异性TRAF1转基因小鼠的鉴定结果图。

图2小鼠在不同时间点肝脏的坏死情况对比图。

A为WT和TRAF1-KO小鼠在不同时间点肝脏HE染色图及坏死面积统计柱状图；

B为NTG和TRAF1-TG小鼠在不同时间点肝脏HE染色图及坏死面积统计柱状图。

图3小鼠在不同时间点血清中ALT及AST的含量统计比较图。

A为WT和TRAF1-KO小鼠在不同时间点肝脏血清中ALT及AST的含量统计柱状图；

B为NTG和TRAF1-TG小鼠在不同时间点肝脏血清中ALT及AST的含量统计柱状图。

图4为WT，TRAF1-KO，NTG和TRAF1-TG小鼠缺血在再灌注12h时TUNEL细胞数的柱状统计图。

A为WT和TRAF1-KO小鼠在再灌注12h时TUNEL免疫荧光柱状统计图；

B为NTG和TRAF1-TG小鼠在再灌注12h时TUNEL免疫荧光柱状统计图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实验用动物及饲养

实验动物：选用8-10周龄、体重在24g-27g，背景为雄性C57BL/6品系的野生型小鼠（WT，C57BL/6背景，购自北京华阜康生物科技有限公司）、TRAF1基因敲除小鼠（KO，购自美国缅因州 Jackson实验室，为C57BL/6 背景，货号：008076）、非转基因小鼠（NTG，C57BL/6背景，）及肝细胞特异性TRAF1转基因小鼠（TG，肝细胞特异性TRAF1转基因小鼠由武汉大学心血管病研究所李红良教授实验室构建）为实验对象。

饲养环境：所有实验小鼠均饲养在武汉大学心血管病研究所SPF级实验动物中心。小鼠专用饲料由中国军事医学科学院动物中心提供。饲养条件：室温在22-24℃之间，湿度在40-70%之间，明暗交替照明时间为12h，自由饮水摄食。

【实施例1】肝细胞特异性TRAF1转基因小鼠的构建

为进一步研究 TRAF1 过表达对于肝脏缺血/再灌注损伤的影响，我们构建了几株肝细胞特异性 TRAF1 转基因小鼠（TRAF1-TG）。转基因载体构建信息：用TRAF1基因上游引物，即5’-GAACTCGAGCCACCATGGCCTCCAGCTCAGCCCC-3’ （SEQ ID NO. 1） ；TRAF1基因下游引物，即5’-GAATGCGGCCGCCTAAGCACTAGTGTCCACAA-3’ （SEQ ID NO. 2），扩增小鼠TRAF1全长基因(NCBI, Gene ID: 22029, XM_006497845.1)，把 cDNA插入pGEM-T载体(Promega公司产品,货号A1360）Albumin启动子下游，将构建的载体通过显微注射构造成受精胚胎(C57BL/6背景)，得到肝细胞特异性TRAF1转基因老鼠。转基因小鼠通过剪尾巴取基因组DNA，使用PCR鉴定，检测其中的外源基因结构，PCR鉴定引物信息为：检测正向引物5’- GCGGTCTGGCAGTAAAAACTATC-3’ （SEQ ID NO. 3），检测反向引物5’- GTGAAACAGCAT TGCTGTCACTT-3’ （SEQ ID NO. 4）。

通过蛋白质印迹法(Western Blot )实验鉴定不同转基因鼠肝脏中TRAF1蛋白的表达量：提取不同转基因鼠肝脏组织蛋白，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。

肝细胞 TRAF1的表达由Albumin启动子驱动（图1A），并通过 Western Blot 实验验证 TRAF1过表达（图1B）。为了反映病理生理状态下TRAF1的改变，我们选择了TRAF1-TG4小鼠，Western Blot及定量分析显示，其肝脏组织中 TRAF1 表达量约为正常组织5.1 倍。

【实施例2】 小鼠肝缺血再灌注损伤模型（ischemia/reperfusion injury，I/R）获得

1. 实验动物分组：雄性C57BL/6品系野生型小鼠、TRAF1基因敲除小鼠及TRAF1转基因小鼠和非转基因小鼠，通过肝脏缺血再灌注建立肝缺血模型（I/R）。随机分为8组：C57BL/6J品系野生型小鼠假手术组（WT SHAM）及I/R手术组（WT I/R）、TRAF1基因敲除小鼠假手术组（KO SHAM）及I/R手术组（KO I/R）、非转基因小鼠假手术组（NTG SHAM）及I/R手术组（NTG I/R）、肝细胞特异性TRAF1转基因小鼠假手术组（TG SHAM）及I/R手术组（TG I/R）。

2. 肝缺血再灌注损伤模型I/R手术（采用无创血管夹夹闭中叶和左叶的门静脉和肝动脉，使约70%的肝脏缺血）模型操作流程：

1）手术前12 h给小鼠禁食，可自由饮水。

2）手术前用3%戊巴比妥钠成功麻醉小鼠后，将其平卧固定肢体，用剃毛器将小鼠腹部术区毛刮净 ，用10％碘酒和75％乙醇对术区消毒。

3）取腹正中切口进腹，暴露肝脏左、中叶之肝蒂。

4）用无创血管夹夹闭中叶和左叶的门静脉和肝动脉，使约70%的肝脏缺血，以防止发生严重肠系膜静脉淤血。0.5min后，与非阻断的右叶相比，可见阻断叶变白，说明阻断成功。此时，注意记录缺血开始时间，维持缺血约60分钟，期间用湿的盐水纱布覆盖切口，并注意小鼠的保温（Sham组的小鼠在阻断成功即刻去除血管夹，恢复缺血肝血流）。

5）缺血60分钟后去除血管夹，恢复缺血的肝脏血流，然后关闭腹腔，分两层关腹，先把内层缝好，再缝皮，将手术后的小鼠置于干净的笼子中单独饲养，观察。

【实施例3】肝脏坏死面积及肝功能指标测定

肝脏缺血/再灌注损伤严重程度的评估指标主要包括肝脏坏死面积和肝功能指标（AST，ALT），这些指标均与肝脏缺血/再灌注损伤严重程度正相关。

1.取材

术后分别在假手术组（Sham），以及缺血再灌注12h，24h，48h时颈椎脱臼处死小鼠，立即自下腔静脉取血1mL，分离血清。同时统一取缺血区肝左叶组织大小约1.5cm×1cm×0.2cm于10%中性福尔马林中固定24h后脱水，包埋，进行石蜡切片后进行HE染色。（分离血清：收集血液的EP管于室温下静置1-2h使血液自然凝固。4℃，4000rpm/min，离心30min，充分分离血清。用微量移液器分别吸取血清20μL，20μL，30μL，30μL置0.2mL无菌EP管中，对EP管进行标记，随后保存于-80°冰箱）。

2.制备石蜡标本切片

1）制备石蜡标本切片，主要操作程序包括：包埋框处理→流水冲洗→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→摊片→晾干或烘烤后备用。

2）用石蜡切片机的标准程序切5μm的石蜡切片备用。

3.HE染色

主要步骤大致为：55°C烘烤30min→二甲苯5min，3次→100%酒精1min→95%酒精1min→70%酒精1min→双蒸水1min→苏木素溶液5min→水洗1min→1%盐酸酒精1-3s→水洗1min→Scott液（碳酸氢钠0.35g，硫酸镁2g，蒸馏水100ml）1min→水洗1min→伊红溶液3-5min→蒸馏水洗去浮色→70%酒精1s→95%酒精1s→100%酒精30s，3次→二甲苯2min，3次→趁二甲苯未干立即封片→通风橱内吹干，显微镜拍照。

4.小鼠血清ALT、AST含量测定

① 从-80℃冰箱中取出血清样本，迅速置于冰上，在室温下待样品融化；

② 在室温下，4000转/分钟离心1分钟，让EP管壁的血清聚集至管底。

③ 按照操作流程，打开全自动生化分析仪（Sysmex，Chemix 180i），清洗加样器。

④ 按照全自动生化分析仪样品盘的标记顺序，逐一放入待测的EP 管。

⑤准确安装试剂检测盘，开始使用全自动生化分析仪检测ALT、AST水平。

WT和KO组HE染色见图2A：显微镜下可见SHAM组肝组织基本正常，肝组织结构整齐，无明显的纤维组织增生。I/R组随着再灌注的时间的延长，肝组织结构模糊，排列紊乱。其内有大小不等、形状不规则的坏死灶，坏死灶内肝细胞结构模糊，排列紊乱，离断，甚至肝细胞与肝索脱离而单个存在，与正常肝脏比较，坏死肝脏的肝小叶内见大片坏死灶，坏死组织边缘可见炎性反应带，中性粒细胞聚集，肝细胞核发生典型的坏死改变，可见核固缩。这种现象在缺血再灌注后24h达到高峰。实验结果表明，TRAF1在肝脏缺血再灌注引起的损伤中可能起到重要作用，我们发现给予TRAF1-KO 小鼠I/R后的梗死面积明显低于WT组小鼠（A），同样TRAF1-TG小鼠I/R后的梗死面积明显大于NTG组小鼠（图2B）。

血清中ALT及AST的含量统计结果见图3。经血清ALT、血清AST检测水平表明，在I/R组各时间点ALT、AST水平均明显高于Sham组，在再灌注后12h达到高峰，随后下降，TRAF1- KO 小鼠I/R后的ALT、AST水平显低于WT组小鼠（3A），TRAF1- TG 小鼠I/R后的ALT、AST水平显高于NTG组小鼠（3B）。

【实施例4】 缺血再灌注后肝细胞凋亡情况测定

用TUNEL试剂盒染色检测凋亡。 (TUNEL试剂盒：ApopTag® Plus In Situ Apoptosis Fluorescein Detection Kit （S7111，Chemicon）):

1）将石蜡切片置于烤箱中，60℃烤片30分钟；

2）二甲苯，5分钟×3次；

3）100%乙醇，5分钟×2次；95%乙醇，5分钟；70%乙醇，5分钟；

4）ddH₂O漂洗，5分钟×2次；

5）蛋白酶K 37℃孵育15分钟；

6）PBS漂洗5min×2次；

7）直接滴加Equilibration Buffer于组织上（13μL/cm²），室温孵育至少10s；

8）弃去Equilibration Buffer，滴加TdT Enzyme工作液（77μlReaction Buffer +33μlTdT Enzyme）于组织上（11μl/cm²），于湿盒于37℃孵育1h；

9）将切片置于盛有Stop/Wash Buffer工作液(1mL Stop/Wash Buffer+34mlLddH₂O)的染色缸中振荡15s后室温孵育10min（等待过程中，将适当量的Anti-Digoxigenin Conjugate吸出，至于EP管中，避光放置在室温下，使其平衡至室温）；

10）PBS漂洗1min×3次；

11）轻轻甩去组织多余残留的液体，将组织周围液体吸3滴加Anti-Digoxigenin Fluorescein工作液（53%Blocking Solution+47%Anti-Digoxigenin Conjugate））于组织上（13μL/cm²），于湿盒中室温避光孵育30min；

12）PBS漂洗2min×4次(每次换新的PBS)；

13）SlowFade Gold antifade reagent with DAPI（Invitrogen ，S36939）封片；荧光镜下观察，拍照。若需保存，于暗湿盒中4℃保存。

肝组织细胞凋亡情况测定结果见图4所示，我们检测了TRAF1-KO小鼠和野生型小鼠I/R术后12小时肝细胞凋亡情况。TUNEL 细胞凋亡检测显示，TRAF1-KO小鼠肝细胞凋亡明显比野生型小鼠降低，TRAF1-TG小鼠肝细胞凋亡明显比野生型小鼠增加，进一步提示TRAF1与肝细胞缺血/再灌注时细胞凋亡相关。这些结果表明，抑制TRAF1表达可以改善肝组织缺血/再灌注损伤，且可能与肝细胞凋亡密切相关。

结果表明，TRAF1- KO小鼠在肝脏缺血再灌注引起的损伤中，发现TRAF1敲除后，小鼠肝脏坏死面积显著减少，肝功能明显改善，肝细胞凋亡也明显减少。证明TRAF1基因在脑缺血疾病模型中有着重要的恶化作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉大学

<120> TNF受体相关因子1（TARF1）及其抑制剂在肝脏缺血疾病中的应用

<130> 1

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial

<223> TRAF1基因上游引物

<400> 1

gaactcgagccaccatggcctccagctcagcccc 34

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial

<223> TRAF1基因下游引物

<400> 2

gaatgcggccgcctaagcactagtgtccacaa 32

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<223> 正向引物

<400> 3

gcggtctggcagtaaaaactatc 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<223> 反向引物

<400> 4

gtgaaacagcattgctgtcactt 23

Claims (4)

1.TRAF1作为药物靶标在筛选治疗肝缺血疾病的药物中的应用。

2.TRAF1的抑制剂在制备治疗肝缺血疾病的药物中的应用。

3.一种治疗肝缺血疾病的药物，其特征在于：包含TRAF1。

4.根据权利要求2所述的应用或权利要求3所述的药物，其特征在于：所述的TRAF1的抑制剂为TRAF1基因的siRNA、TRAF1基因的RNA干扰载体或TRAF1的抗体中的一种。

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