CN103784961B - Irf9在支架及内膜剥脱术后再狭窄中的功能及其抑制剂的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种IRF9在支架及内膜剥脱术后再狭窄中的功能及其抑制剂的应用，属于基因的功能与应用领域。本发明以IRF9基因敲除小鼠和野生型C57小鼠为实验对象，通过血管损伤模型，进行了小鼠内膜新生、血管壁细胞增殖水平和平滑肌细胞表型的检测，结果表明与野生型C57小鼠对比，IRF9基因敲除小鼠表现出抑制内膜新生及细胞增殖。这提示一种IRF9基因在支架及内膜剥脱术后再狭窄中的功能，主要体现在IRF9基因具有促进内膜新生及细胞增殖的功能。针对IRF9的上述功能，IRF9可作为药物靶标用于筛选治疗血管狭窄疾病的药物，IRF9的抑制剂可用于制备治疗支架及内膜剥脱术后再狭窄的药物。

Description

IRF9在支架及内膜剥脱术后再狭窄中的功能及其抑制剂的应用

技术领域

本发明属于基因的功能与应用领域，涉及一种IRF9在支架及内膜剥脱术后再狭窄中的功能及其抑制剂的应用。

背景技术

在目前中国，随着饮食结构的变化和人口的老龄化进程，动脉粥样硬化闭塞性病变呈现逐年增高的趋势并成为我们国家主要的致死原因之一。目前对这类疾病尚无根治办法，血管外科的治疗手段包括球囊扩张、支架置入及动脉旁路等方式，但是血管重建后再狭窄极大地影响了治疗效果。有关血管再狭窄的研究已进行了多年，但是迄今为止还没有明确。已有研究表明，在损伤形成的过程中，新生内膜及中膜组织过度增生以及同时伴随的细胞外基质形成，是造成再狭窄的主要病理基础。生理状态下，血管内皮细胞（vascular endothelialcell，EC）可以产生多种促进与抑制血管平滑肌细胞（vascular smooth muscel cell，VSMC）生长的物质，且两者保持动态平衡，维持VSMC处于相对静化状态。促进VSMC生长的物质主要有血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF），内皮素（endomthelin，ET），和血管紧张素U（angiotonin Ⅱ，AngⅡ）等，而抑制VSMC增殖的物质主要有批氮（nitrogen monoxidum，NO），前列腺环素（prostacyclin，PGl2）等。在血管内皮损伤后，促进VSMC增殖的生长因子增多而抑制VSMC增殖的因子减少，这种动态平衡被打破，导致VSMC大量的增殖。

血管的内膜新生是血管在各种损伤因素刺激下发生的病理改变，是多种心血管系统疾病共有的病理过程。血管壁中的平滑肌细胞在这个过程中起着重要的作用，它的增殖、凋亡和表型改变在内膜增生的过程中扮演着重要的角色。血管损伤后，血管平滑肌细胞由中膜向内膜迁移，平滑肌细胞的增殖凋亡失平衡，表型由收缩型向合成型转变，血管壁不适重塑，从而引起内膜增生。近年来，对于内膜增生过程中信号传导通路的研究越来越引起人们的关注。

对这类疾病目前尚无根治方法，血管外科的主要治疗手段是闭塞段血管重建，包括球囊扩张、支架置入以及动脉旁路手术等，但是血管重建后再狭窄的发生率较高（30%～60%），极大地影响了治疗效果，迄今为止血管重建后再狭窄依然是一个临床难题。

IRF9（interferon regulatory factor 9，IRF9）又称为P48、ISGF3γ （IFN-stimulated gene factor 3γ)。目前有IRF-9的研究主要集中在抗病毒，IRF-9和HBV（乙型肝炎病毒）干扰素刺激应答元件样结构域结合后，其表达迅速上调可以增强IFN-α诱导的HBV mRNA水平的显著抑制。最近有报道，小鼠在IRF9基因敲除（Knockout，KO）后，表现为增加小肠粘液和淋巴结里的T细胞及中性粒细胞数目，这提示IRF9与炎症有着密切联系。

发明内容

为解决上述现有技术的缺陷和不足，本发明的目的在于提供一种IRF9及其抑制剂在制备治疗支架及内膜剥脱术后再狭窄药物中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明以野生型C57小鼠与IRF9基因敲除小鼠（IRF9-KO小鼠）为实验对象，通过颈动脉导丝损伤模型诱导获得小鼠血管损伤模型（vascular injury，VI），进行了血管损伤模型（VI）小鼠内膜新生测定、血管壁细胞增殖水平的检测和平滑肌细胞表型的检测的研究，结果表明：与野生型C57小鼠对比，IRF9基因敲除小鼠表现出内膜新生及细胞增殖明显低于WT小鼠；IRF9基因敲除可以抑制细胞增殖核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA）和细胞周期蛋白（Cyclin D1）的表达，可抑制平滑肌细胞的增殖和内膜增生；IRF9基因敲除可以促进平滑肌细胞分化特异性抗原（Smoothelin）、平滑肌肌动蛋白（Smooth Muscle Actin，SMA）和平滑肌22α（smooth muscle 22 alpha，SM22α）的表达，抑制骨桥蛋白（osteopontin，OPN）的表达，可抑制平滑肌细胞由收缩型向合成型的表型转换，从而抑制内膜增生。上述结果提示IRF9基因敲除会改善血管再狭窄的发生，IRF9基因能够促进支架及内膜剥脱术后再狭窄的发生。

一种IRF9基因的新功能，具体体现在IRF9具有在支架及内膜剥脱术后再狭窄中促进内膜新生及细胞增殖的功能。

针对IRF9具有促进内膜新生及细胞增殖的功能，提供IRF9作为药物靶标在筛选治疗血管狭窄疾病的药物中的应用。

针对IRF9具有促进内膜新生及细胞增殖的功能，提供IRF9作为药物靶标在筛选治疗支架后再狭窄的药物中的应用。

针对IRF9具有促进内膜新生及细胞增殖的功能，提供IRF9作为药物靶标在筛选治疗内膜剥脱术后再狭窄的药物中的应用。

针对IRF9具有促进内膜新生及细胞增殖的功能，提供IRF9的抑制剂在制备治疗血管狭窄疾病的药物中的应用。

一种治疗血管狭窄疾病的药物，包含IRF9的抑制剂。

针对IRF9的上述功能，提供IRF9的抑制剂在制备治疗支架后再狭窄的药物中的应用。

一种治疗支架后再狭窄的药物，包含IRF9的抑制剂。

针对IRF9的上述功能，提供IRF9的抑制剂在制备治疗内膜剥脱术后再狭窄的药物中的应用。

一种治疗内膜剥脱术后再狭窄的药物，包含IRF9的抑制剂。

所述的IRF9的抑制剂优选为IRF9基因的siRNA、IRF9基因的RNA干扰载体、IRF9的抗体及其他能够抑制IRF9表达的抑制剂中的一种。

在本发明研究中，野生型小鼠和IRF9-KO小鼠在血管损伤模型（VI）的诱导下均发生血管损伤，与野生型小鼠相比，IRF9-KO小鼠内膜新生及细胞增殖受到抑制。这些结果提示，IRF9对促进内膜新生及细胞增殖具有强大的影响，具有促进血管狭窄和支架及内膜剥脱术后再狭窄形成的能力。本发明证明了IRF9基因在血管损伤疾病模型中有着重要的恶化作用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

（1）本发明发现IRF9基因的新功能，即IRF9基因具有促进支架及内膜剥脱术后再狭窄的作用。

（2）基于IRF9在促进支架及内膜剥脱术后再狭窄中的作用，IRF9的抑制剂可用于制备治疗支架及内膜剥脱术后再狭窄的药物。

附图说明

图1是WT和IRF9-KO小鼠的HE染色及内膜面积结果统计柱状图；其中，A：HE染色图（KO代表IRF9-KO小鼠），B：柱状图。

图2是WT和IRF9-KO小鼠术后14d、28d 血管壁细胞增殖水平标志物PCNA、CyclinD1表达的免疫荧光染色及结果统计柱状图；其中，A：免疫荧光染色，B：柱状图。

图3是WT和IRF9-KO小鼠术后14d、28d平滑肌细胞表型标志物Smoothelin、SMA、SM22α和OPN表达的免疫荧光染色及结果统计柱状图；其中，A：免疫荧光染色，B：柱状图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实验用动物及饲养：

实验动物种属，性别，周龄及来源：C57BL/6小鼠（WT小鼠）和IRF9基因敲除小鼠（IRF9-KO小鼠），雄性，8-10 周龄，体重24-27g，C57BL/6小鼠购自北京华阜康生物科技有限公司；IRF9基因敲除小鼠（IRF9-KO，C57BL/6J背景）购自RIKEN BRC公司，BRC编号：RBRC00916。

动物饲养及环境条件：所有的实验小鼠均饲养在武汉大学心血管病研究所SPF级动物房（许可证号：SYXK（鄂）：2009-0053）。每12小时交替照明，温度24±2℃，湿度40%-70%，小鼠自由饮水进食。

实施例1  小鼠血管损伤模型（VI）获得

1. 实验动物分组：使用8-10周龄，体重24-27g的WT和IRF9-KO小鼠，共分为四组：WT血管损伤组；WT假手术组；IRF9-KO血管损伤组；IRF9-KO假手术组，每组各60只小鼠。分别在手术后7天、14天、28天每组各处死20只小鼠，取损伤节段血管进行分析。

2. 小鼠血管损伤模型操作流程：

1）用电子天平于动态模式下准确称取小鼠体重（g），用双蒸水准确配置3%戊巴比妥钠溶液，轻轻摇动使其充分溶解，采用80mg/kg体重剂量，计算所需戊巴比妥钠溶液体积后用1mL注射器准确抽取相应体积溶液，行腹腔注射麻醉小鼠，待小鼠充分麻醉倒（约3min）后，8%硫化钠颈部脱毛。

2）分离颈内和颈外动脉。

3）在颈内动脉和颈外动脉分叉处用8-0线结扎颈外动脉，同时用血管夹（WPI, 501784-G）暂时性阻断颈内动脉及颈总动脉供血。

4）用显微剪（WPI, 501839）在颈外动脉结扎线的上方横向剪一个小口。经此血管切口插入直径0.015英寸的导丝（No. C-SF-15-15, Cook, Bloomington, Indiana），旋转导丝进退5-6次。

5）在切口近心端结扎颈外动脉，松开颈内及颈总动脉置留的血管夹，剪断线头，清理术野，缝合颈部切口（假手术除不进行导丝插入和旋转进退以外，其他操作均相同）。

实施例2  血管损伤模型（VI）小鼠内膜新生测定

1. 小鼠取材

1）麻醉小鼠，剪破心脏放血。

2）从颈动脉近分叉处剪下颈动脉，取0.5-0.6cm长，保留颈外动脉线结。

3）将颈动脉放入PBS中，用显微镊轻柔排干管腔内的残血。

4）将血管放入装有1mL 4%多聚甲醛的1.5mL EP管中固定。

2. 病理学检测

2.1 制备石蜡标本切片

由实验室专业病理工作人员制备石蜡标本切片，主要操作程序包括修剪心脏→包埋框处理→流水冲洗→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片（3μm）→摊片→晾干或烘烤后备用。

2.2 苏木精-伊红（HE）染色

主要步骤为：55℃烘烤30min→二甲苯5min，3次→100%酒精1min→95%酒精1min→70%酒精1min→双蒸水1min→苏木素溶液（珠海贝索，BA-4021）5min→水洗1min→1%盐酸酒精（取3mL浓盐酸与297mL 70%酒精充分混合均匀）1-3s→水洗1min→Scott液（碳酸氢钠0.35g，硫酸镁2g，蒸馏水100mL）1min→水洗1min→伊红溶液（珠海贝索，BA-4024）3-5min→蒸馏水洗去浮色→70%酒精1s→95%酒精1s→100%酒精30s，3次→二甲苯2min，3次→趁二甲苯未干立即封片→通风橱内吹干，显微镜拍照。

以血管内弹力纤维和外弹力纤维为界，内弹力板以内为血管内膜，外弹力板以外为血管外膜，内外弹力板之间为血管中膜。用Image-Pro Plus 6.0软件分别圈各血管管腔面积。

内膜面积大小的计算参照公式如下：

新生内膜面积=内弹力板面积-管腔面积；

中膜面积=外弹力板面积-内弹力板面积。

小鼠HE染色后的血管内膜新生的结果如图1。通过HE染色可以观察到，假手术组（Sham组）血管壁结构完整，排列整齐，血管内膜为单层内皮细胞，结构完整，中膜平滑肌细胞排列整齐。血管损伤组（VI组）血管壁结构不完整，血管内皮细胞缺失，新生内膜增生明显，并伴有大量炎细胞浸润；IRF9-KO组在术后14d新生内膜面积明显比WT小鼠要低，这种保护作用在术后28d更明显。同样，内膜面积/中膜面积的比值在VI术后IRF9-KO组要低于WT组，这种作用在28d要更显著。

实施例3  血管壁细胞增殖水平的检测

免疫荧光染色检测细胞增殖核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA）、细胞周期蛋白（Cyclin D1）的表达。所需一抗信息：PCNA (#2586; 1:100; mouse; Cell Signaling Technology)，cyclin D1 (#2978; 1:25; rabbit; Cell Signaling Technology)；所需二抗信息：Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rabbit IgG (A11011; Invitrogen, Carlsbad, CA)，Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-mouse IgG (A11004; Invitrogen, Carlsbad, 150 d, CA)。

主要步骤为：

1）烤片：将石蜡切片置于烤箱中30min以上。

2）脱蜡：二甲苯5min×3。

3）水合：100%乙醇5min×2；95%乙醇5min；70%乙醇5min；ddH₂O浸洗5min×2。

4）柠檬酸盐组织抗原修复（高压修复）：取一定量的pH6.0柠檬酸盐抗原修复工作液于修复盒中，修复工作液的量必须能足够浸没整张切片，将修复盒放入已加入适量自来水的高压锅中，大火加热至沸腾，将脱蜡水合后的组织切片置于耐高温染色架上，再将染色架缓慢放入修复盒中，盖上锅盖，扣上压力阀，继续加热至喷气，开始计时5min后，压力锅断开电源，去阀开盖，取出修复盒；室温放置20min自然冷却后取出切片。

5）ddH₂O漂洗5min×2次，PBS漂洗5min×2次。

6）组化笔划圈，滴加10%羊血清（GTX27481，GeneTex）封闭，于湿盒中37℃封闭60min。

7）弃封闭液，滴加适当比例稀释的一抗，4℃孵育过夜，37℃复温30min，弃去一抗，PBS洗10min×3次。

8）滴加二抗，于湿盒中37℃孵育60min，弃去二抗，PBS浸洗5min×3次。

9）SlowFade Gold antifade reagent with DAPI（S36939，Invitrogen）封片。

10）荧光镜下观察，拍照。若需保存，于暗湿盒中4℃保存。

荧光统计方法：PCNA免疫荧光染色统计采用IPP软件计数，PCNA阳性细胞百分比=PCNA阳性细胞个数/（内膜+中膜）的总DAPI个数*100%；CyclinD1免疫荧光染色统计采用IPP软件直接测阳性吸光度。

免疫荧光发观察PCNA、CyclinD1在WT和IRF9-KO小鼠血管损伤后的表达变化，结果见图2。PCNA、CyclinD1在血管组织中有表达，IRF9-KO小鼠在术后14d、28d PCNA的阳性细胞个数及CyclinD1的荧光强度均要小于同组的WT小鼠，表明IRF9基因敲除可以抑制PCNA、CyclinD1的表达，可抑制平滑肌细胞的增殖和内膜增生。

实施例4  平滑肌细胞表型的检测

免疫荧光染色检测平滑肌细胞表型标志物：平滑肌肌动蛋白（Smooth Muscle Actin，SMA）、平滑肌细胞分化特异性抗原（Smoothelin）、平滑肌22α（smooth muscle 22 alpha，SM22α）、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）的表达。所需一抗信息：SMA (ab5694; 1:100; rabbit; Abcam)，Smoothelin (sc-28562; 1:100; rabbit; Santa Cruz)，OPN (BS1264; 1:100; rabbit; Bioworld) and SM22α (ab14106; 1:100; rabbit; Abcam)；所需二抗信息：Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (A11008; Invitrogen, Carlsbad, CA)。

主要步骤为：

1）烤片：将石蜡切片置于烤箱中30min以上。

2）脱蜡：二甲苯5min×3次。

3）水合：100%乙醇5min×2次；95%乙醇5min；70%乙醇5min；ddH₂O浸洗5min×2次。

4）柠檬酸盐组织抗原修复（高压修复）：取一定量的pH6.0柠檬酸盐抗原修复工作液于修复盒中，修复工作液的量必须能足够浸没整张切片，将修复盒放入已加入适量自来水的高压锅中，大火加热至沸腾，将脱蜡水合后的组织切片置于耐高温染色架上，再将染色架缓慢放入修复盒中，盖上锅盖，扣上压力阀，继续加热至喷气，开始计时5min后，压力锅断开电源，去阀开盖，取出修复盒；室温放置20min自然冷却后取出切片。

5）ddH₂O漂洗5min×2次，PBS漂洗5min×2次。

6）组化笔划圈，滴加10%羊血清（GTX27481，GeneTex）封闭，于湿盒中37℃封闭60min。

7）弃封闭液，滴加适当比例稀释的一抗，4℃孵育过夜，37℃复温30min。

8）弃去一抗，PBS洗10min×3次。

9）滴加二抗，于湿盒中37℃孵育60min，弃去二抗，PBS浸洗5min×3次。

10）SlowFade Gold antifade reagent with DAPI（S36939，Invitrogen）封片。

11）荧光镜下观察，拍照。若需保存，于暗湿盒中4℃保存。

荧光统计方法：采用IPP软件直接测阳性吸光度。

血管损伤后，血管平滑肌细胞由中膜向内膜迁移，平滑肌细胞的增殖凋亡失平衡，表型由收缩型向合成型转变，血管壁不适重塑，从而引起内膜增生。免疫荧光发观察SMA、Smoothelin、SM22α和OPN在WT和KO小鼠血管损伤后的表达变化，结果见图3。SMA、Smoothelin、SM22α和OPN在血管组织中有表达，IRF9-KO小鼠在术后14d、28d SMA、Smoothelin、SM22α的荧光强度均要高于同组的WT小鼠，OPN的荧光强度均要低于同组的WT小鼠，表明IRF9基因敲除可以促进SMA、Smoothelin、SM22α的表达，抑制OPN的表达，可抑制平滑肌细胞由收缩型向合成型的表型转换，从而抑制内膜增生。

上述实施例结果显示，野生型小鼠和IRF9-KO小鼠在血管损伤模型（VI）的诱导下均发生血管损伤，与野生型小鼠相比，IRF9-KO小鼠内膜新生及细胞增殖受到抑制。这些结果提示，IRF9对促进内膜新生及细胞增殖具有强大的影响，具有促进血管狭窄和支架及内膜剥脱术后再狭窄形成的能力。证明了IRF9基因在血管损伤疾病模型中有着重要的恶化作用，其抑制剂可用于制备治疗血管狭窄疾病的药物。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.IRF9作为药物靶标在筛选治疗血管狭窄疾病的药物中的应用。

2.IRF9作为药物靶标在筛选治疗支架后再狭窄的药物中的应用。

3.IRF9作为药物靶标在筛选治疗内膜剥脱术后再狭窄的药物中的应用。