CN103784401A - 一种治疗呼吸道疾病的溶液型定量吸入气雾剂及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种溶液型格隆溴铵或其衍生物的定量吸入气雾剂和制备方法，含有主药、潜溶剂、表面活性剂、抛射剂。该气雾剂细微粒子分数（FPF）高，在长期留样条件和加速条件下放置稳定性好，FPF没有明显变化、药效学试验结果显示起效快，可用于治疗支气管哮喘和慢性阻塞性肺病，具有良好的抗气道炎症、气道纤维化和气道重塑作用。

Description

一种治疗呼吸道疾病的溶液型定量吸入气雾剂及制备方法

技术领域

本发明涉及药物制剂技术领域一种吸入气雾剂，特别涉及一种治疗呼吸道疾病溶液型定量吸入气雾剂及其制备方法。

背景技术

自从1956年Riker Laboratories的Charles Thiel发明压力定量吸入气雾剂(pressurized metered doseinhaler,pMDI)以来，在过去的50多年中，由于具有快速、定位和避免胃肠道首过效应、以及体积小、给药方便、价格低、患者易于使用、没有如干粉吸入剂在使用前装载药物或因环境等因素而致装置内粉末吸潮等缺点而被广泛应用。随着人们环保意识的增强，1987年40个国家在加拿大蒙特利尔签订了《关于消耗臭氧层物质的蒙特利尔议定书》，pMDI中的抛射剂-氟利昂（CFC），因其为温室效应气体，且具有较强臭氧层破坏作用，因而必须替代。我国于1993年1月编制了《中国消耗臭氧层物质逐步淘汰国家方案》。

具有式I结构的化合物是一种季铵类抗胆碱能药物，口服给药生物利用度低，仅10%～25%吸收，因此在气雾吸入时吞咽进入胃肠道的药物很少进入系统循环。本品早期用于胃及十二指肠溃疡、慢性胃炎、胃酸分泌过多等症。疗效与普鲁苯辛相仿或更好，明显强于阿托品，但不良反应明显少于阿托品和普鲁苯辛。本品静注或肌注可用于麻醉前给药，以抑制气管腺体分泌，作用可持续约7小时。胃肠道疾病口服每次1～2mg，1日3～4次，饭后及睡前服。维持量每次1mg，每日2次。1次极量为4mg，1日极量为12mg。麻醉前给药，静注或肌注0.2～0.4mg。

式I化合物中的代表化合物格隆溴铵在气道疾病中的应用最早是在1984年，从此以后有许多研究证明它的潜在功用。Schroeckenstein等人公开了使用格隆溴铵气雾剂用于治疗哮喘，单次使用量的格隆溴铵气雾剂实现支气管扩张作用超过12小时（J.Allergy Clin.Immunol.,1988;82(1):115-119）。Leckie等的一般性综述提到格隆溴铵可作为COPD的治疗药物，但没有提供有效剂量和持续时间数据（Exp.Opin.Inest.Drugs，2000；9（1）：3-23）。Skorodin披露了使用格隆溴铵气雾剂治疗哮喘和COPD，作用时间为6-12小时，剂量为200-1000μg（Arch Intern.Med,1993;153:814-828）。

近期的基础研究表明，格隆溴铵对胆碱能M₃受体的选择性明显强于M₂，格隆溴铵阻断M₃和M₁受体，对支气管平滑肌有明显的长时间的扩张作用。阻断M₂可促进胆碱能节后神经释放更多的乙酰胆碱从而减弱M受体阻断药的支气管扩张作用，由此可见格隆溴铵对胆碱能M₃受体的选择性有利于增加其气管扩张作用，也有利于减少心率加快等不良事件（心率加快主要由M₂支配）(Vogelmeier C,Banerji D.NVA237,along-acting muscarinic antagonist,as an emerging therapy for chronic obstructive pulmonary disease.Ther AdvRespir Dis.2011;5(3):163-73.)。与噻托溴铵比较，格隆溴铵对M₃:M₂的选择性比值为5，噻托溴铵为2。格隆溴铵对M₃:M₂的动态选择性比值为9，噻托溴铵为4.3。此外，与格隆溴铵比较，噻托溴铵需要多花4-5倍的时间来平衡M₃受体，这就意味着格隆溴铵更短的M₃平衡时间导致它的起效时间比噻托溴铵快4.4倍(Sykes,D.A.,et al(2010).A potential role for dissociation rate from the M3 muscarinic receptor in the onset ofaction of NVA237 and tiotropium.European Respiratory Society Conference,Barcelona,Spain,18_22 September:abstract 252830.)。

近期的临床实验研究表明，格隆溴铵干粉吸入剂（NVA237）应用于Ⅱ期COPD临床试验数据显示，格隆溴铵干粉吸入剂是一种每天给药1次的长效支气管扩张剂，NVA237与噻托溴铵干粉吸入剂（Spiriva）等效，但副作用更少（主要副作用是口干），且用药之后起效更快。NVA237单剂量480μg吸入给药支气管扩张作用持续时间长达32小时。近期的动物实验研究表明，格隆溴铵3～12μg/kg气道内滴入给药呈剂量依赖抑制乙酰胆碱引起的犬支气管收缩反应；气道内滴入格隆溴铵3nmol/kg抑制乙酰胆碱引起的豚鼠支气管收缩反应（抑制率为88±4%）。以上的临床和动物试验结果均证明了格隆溴铵是一个作用强、持续时间长的支气管扩张剂。

WO01/76575描述了一种用于肺部递送的包含M₃受体阻断剂的组合物，可用于治疗哮喘、COPD或囊性纤维化，格隆溴铵为首选成份，与硬脂酸镁混合制成干粉吸入剂。2005年中国专利CN1972730A公开了格隆溴铵用于治疗儿童哮喘，剂型也是干粉吸入剂，其最优选剂量为小于或等于1000μg。然而，干粉吸入剂成本相对较高、制备工艺较复杂且易吸潮，而且稳定性也有待于进一步改善。

WO97/39758描述了用于治疗呼吸系统炎症的药物组合物，在23页提到溶液中加入格隆溴铵作为组分，其是一种混悬型定量吸入剂，有效剂量为200-1000μg。CN1953745A也公开了格隆溴铵和β₂肾上腺素受体激动剂的组合物，用于气道炎症或COPD的治疗，剂型也包括悬浮性定量吸入剂，其格隆溴铵的最优选剂量为小于或等于20-500μg。然而，格隆溴铵混悬型吸入剂的细微粒子分数（Fine ParticleFraction,FPF）值较低，导致进入肺部的有效剂量降低，而且混悬型定量吸入气雾剂还存在很多其它问题，例如：（1）水分要控制极低，以免药物微粒粘合聚集；（2）药物在抛射剂中的溶解度越小越好，避免储存过程中药物微晶变粗；（3）药物粒径应在5μm以下，不得超过10μm，这对增强、防止阻塞阀门和保持阀门密闭性能等都是必须的；（4）必须添加HLB值较低的表面活性剂等适宜的赋型剂，以起湿润、分散和润滑等作用，防止药物凝聚和重结晶化；（5）需要调节抛射剂和混悬固体的密度，尽量使二者相等，这样不利于单一抛射剂的使用。

因此，现有技术仍然需要一种成本低、制备工艺简单、使用方便、FPF值相对较高且稳定性好的格隆溴铵吸入剂。

发明内容

式I化合物水中不稳定，在有机溶剂中溶解度较低，制备溶液型的吸入剂（pMDI）存在相当的技术难度，因此，现有技术中还没有其溶液型的吸入剂（pMDI）存在。本发明的发明人在经过大量创造性劳动后，制备出了式I化合物溶液型的吸入剂，具有成本低、制备工艺简单、使用方便、FPF值相对较高且稳定性好等特点。特别是其FPF值明显大于现有技术的式I化合物混悬型吸入气雾剂和干粉吸入剂的FPF，在储存过程中同样是溶液型式I化合物的气雾剂pMDI最稳定，FPF没有发生明显变化，与干粉型气雾剂相比，具有明显优势。并且，式I化合物溶液型吸入剂临床使用时比现有技术吸入剂的剂量明显降低，副作用少，显著提高左右两肺药物沉积的均匀性，其药效也优于现有技术的干粉型及混悬型气雾剂，产生了意想不到的良好效果。

因此，本发明提供了一种可用于治疗哮喘和慢性阻塞性肺病（COPD）溶液型的定量吸入气雾剂，其为澄明均匀的溶液和抛射剂气体所组成的二相气雾剂形式。气雾剂包含式I化合物或其光学异构体、潜溶剂、表面活性剂、抛射剂。

本发明中的式I化合物具有如下结构：

M^-为适宜的有机或无机药用阴离子，可以选自但不限于溴离子、氟离子、氯离子、碘离子、硝酸根、硫酸根、磷酸根、甲酸根、乙酸根、三氟乙酸根、丙酸根、丁酸根、乳酸根、柠檬酸根、酒石酸跟、苹果酸根、马来酸根、琥珀酸根、苯甲酸根、对氯苯甲酸根、二苯基乙酸根、三苯基乙酸根、邻-羟基苯甲酸根、对-羟基苯甲酸根、1-羟基萘-2-甲酸根、3-羟基萘-2-甲酸根、甲磺酸根或对甲苯磺酸根。式I化合物具有两个手性中心，因此存在四种光学异构体形式，这些均在本发明的范围之内。

式I化合物的代表化合物是格隆溴铵，分子式为C₁₉H₂₈BrNO₃，分子量为398.34，CAS号是596-51-0，其结构如下：

它具有两个手性中心，因此存在四种光学异构体形式，即（3R，2R）-、（3S，2R）-、（3R，2S）-和（3S，2S）-3-[环戊基-羟基苯基乙酰基]氧基]-1，1-二甲基吡咯烷溴化物，这一点正如美国专利说明书US6307060和US6613795中所描述的那样。本发明中所述的格隆溴铵，是指以上这些异构体形式中的一种或多种，特别是（3S，2R）异构体、（3R，2S）异构体或（3R，2R）异构体，或者外消旋体，特别是（3S，2R/3R，2S）外消旋体（除非特殊说明，本发明使用的式I化合物均为外消旋体）。

M-为其他药用阴离子的化合物的制备是现有技术中已知的，如可采用本领域常规的离子交换法，采用阴离子交换树脂与格隆溴铵进行离子交换将溴离子转换成氢氧根离子，然后与相应的酸进行中和反应制备得到。也可采用将格隆溴铵在水溶液中与氧化银反应，生成（3R，2R）-、（3S，2R）-、（3R，2S）-和（3S，2S）-3-[环戊基-羟基苯基乙酰基]氧基]-1，1-二甲基吡咯烷氢氧化物，此氢氧化物与酸反应获得相应的式I化合物。

本发明的吸入气雾剂中，所述的潜溶剂包括无水乙醇、甘油、二醇类中的一种或一种以上的混合物，其中的二醇类包括但不限于乙二醇、丙二醇、聚乙二醇200、聚乙二醇300、聚乙二醇400、聚乙二醇600、聚乙二醇800等。

本发明的吸入气雾剂中，所述的抛射剂包括四氟乙烷(HFA-134a)、七氟丙烷(HFA-227ea)中的一种或它们的混合物。

本发明的吸入气雾剂中，所述的表面活性剂包括油酸；寡聚乳酸(OLA)；脱水山梨醇类，如span20、span65、span80、span85；聚氧乙烯脱水山梨醇类，如吐温20、吐温80；聚氧乙烯脂肪醇类，如Bri j30、Bri j35、Cremophor；聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物，如Pluronic F-68；聚乙二醇硬脂酸酯类，如Solutol HS15；磷脂类，如大豆磷脂、卵磷脂中的一种或几种。优选油酸、卵磷脂或二者的混合物。

本发明的吸入气雾剂中，所述式I化合物含量按重量百分比为0.005～1%，优选为0.02～0.5%。吸入气雾剂中的潜溶剂含量按重量百分比为5～40%，优选10-30%。吸入气雾剂中的表面活性剂含量按重量百分比为0～5%，优选0.005～2%。吸入气雾剂中的抛射剂含量按重量百分比为50～90%，优选70～80%。

任选地，本发明的吸入气雾剂中还可以进一步加入其它可用于治疗支气管哮喘和慢性阻塞性肺病的活性成分，包括但不限于抗炎药、支气管扩张药、抗组胺药、解充血药和镇咳药，例如用于治疗呼吸系统疾病。优选β₂-肾上腺素受体激动剂、其它M受体阻断剂、甾类、PDE4抑制剂、A2a激动剂等。

适宜的β₂-肾上腺素受体激动剂包括但不限于（左旋）沙丁胺醇、奥西那林、特布他林、美沙特罗、菲诺特罗、茚达特罗、丙卡特罗、福莫特罗以及卡莫特罗。

适宜的M受体阻断剂包括包括但不限于异丙托溴铵、氧托溴铵、噻托溴铵、苯环喹溴铵、CHF4226和SVT-40776等。

适宜的甾类包括包括但不限于糖皮质激素，例如布地奈德、倍氯米松、氟替卡松、环索奈德或莫米松等。

适宜的PDE4抑制剂包括包括但不限于西洛司特、罗氟司特、阿罗茶碱等。

适宜的A2a激动剂包括但不限于EP409595A2、EP1052264、EP1241176、WO94/17090、WO04/046083中描述的激动剂。

本发明的溶液型气雾剂，可用于治疗支气管哮喘和慢性阻塞性肺病（COPD)，具有良好的支气管扩张、抗气道炎症、气道纤维化和气道重塑作用。

本发明的另一目的是提供一种定量吸入气雾剂的制备方法，包括将式I化合物或其光学异构体、潜溶剂和/或表面活性剂溶解后灌装并充入抛射剂的步骤。

其中，灌装可采用本领域常规的方法，包括但不限于一步压力灌装法、两步压力灌装法、一步冷冻灌装法和盖下灌装法制备而成。这里需要指出的是，不同的灌装法仅是灌装工艺有差异，并不会影响产品的组成和效果。以上的灌装方法均属于本领域常规技术，记载于本领域教科书内，这些教科书均引入本发明作为参考。

本发明所述的一步压力灌装法，在这种方法中，全部处方被置于调剂罐中，于高压条件下，使调剂罐温度远低于挥发性最强的抛射剂组分的沸点。调剂罐中的产品必须搅拌，以保证处方的均匀性，然后被泵入一个与灌装嘴相连的具有恒定上部体积的容器中，最后，经由一个由时间控制的螺线四型阀门将所需要的产品定量灌装入具有一定体积的压力容器中。

本发明所述的两步压力灌装法所使用的设备是过去市场上最容易购得的标准设备，这种方法为早年最常用的灌装定量吸入气雾剂的生产工艺。它包含了对处方的两次充填过程，先将主药与处方中的非挥发性成份混合后充填入容器中，压盖后再将挥发性抛射剂压入容器中以组成完整处方。

本发明所述的一步冷冻灌装法是现存生产工艺中最早的一种，早在十八世纪50年代末就被开发，并生产出了第一种商用定量吸入气雾剂产品。在这种方法中，全部处方被置于调剂罐中，于-50℃～-60℃的条件下冷冻，使调剂罐温度远低于挥发性最强抛射剂组分的沸点。调剂罐中的产品必须搅拌，以保证处方的均匀性，然后被泵入与灌装嘴相连的具有恒定上部体积的容器中，最后，经由一个由时间控制的螺线型阀门将所需要的产品定量灌装入具有一定体积的压力容器中。

本发明所述的盖下灌装法是近年在国外发展起来的灌装新技术。盖下灌装从原理上亦属于两步压力灌装法，但它又具有自己的特点，即盖下灌装工艺是将主药与处方中的非挥发性成份混合后充填入容器中，压盖和抛射剂充填是同时进行的，此刻，抛射剂是通过阀与容器间隙而不是阀杆进入容器的，该工艺能够在瞬间完成抽真空、抛射剂灌装和封盖3个工序。

附图说明

图1.对照实施例7、对照实施例1和实施例2样品给哮喘模型小鼠气雾吸入后减轻气道炎症细胞聚集。

图2.对照实施例7、对照实施例1和实施例2样品给哮喘模型小鼠气雾吸入后抑制肺组织细胞因子和趋化因子mRNA表达。

图3.对照实施例7、对照实施例1和实施例2样品给哮喘模型小鼠气雾吸入后抑制肺组织细胞因子和趋化因子蛋白水平。

图4.对照实施例7、对照实施例1和实施例2样品给哮喘模型小鼠气雾吸入后抑制乙酰甲胆碱引起的气道高反应。

图5.对照实施例5、对照实施例8和实施例4样品格隆溴铵拮抗CCh收缩离体豚鼠气管平滑肌作用强度的比较（离体试验）。

图6.对照实施例10、对照实施例2和实施例1样品格隆溴铵阻断Mch诱导豚鼠支气管收缩的作用（整体试验）。

具体实施方式

以下通过具体实施方式对本发明进行进一步说明。这里需要指出的是，下面的具体实施方式仅用来说明本发明，本领域技术人员在理解本发明精神的前提下，可以根据本技术领域的现有技术和公知知识对本发明进行相应变换，这些技术方案均落入本发明的范围之内。如无特殊说明，实施例中所采用的格隆溴铵是格隆溴铵（3S，2R/3R，2S）外消旋体，其是使用描述于美国专利US2956062的方法制备获得的。

化合物A：（R）-5-[2-（5，6-二乙基-茚满-2-基氨基）-1-羟基-乙基]-8-羟基-1H-喹啉-2-酮马来酸盐，使用描述于美国专利US2000/075114的方法进行制备。

化合物B：4-羟基-7-1-羟基-2-{2-[4-（4-苯基-丁氧基）-苯基]-乙基氨基}-3H-苯并噻唑-2-酮。

化合物C：4-羟基-7-{（R）-1-羟基-2-[2-（5，6，7，8-四氢萘-2-基）-乙基氨基]-乙基}-3H-苯并噻唑-2-酮加酸盐。

化合物B、C使用描述于美国专利US2004/016601的方法进行制备。

实施例1

将格隆溴铵、Cremophor EL与乙醇溶解后，两步法灌装充入HFA-134a即得。

实施例2

将格隆溴铵与乙醇和油酸溶解后，一步法灌装充入HFA-134a即得。

实施例3

将格隆溴铵、PEG1000、大豆磷脂和乙醇溶解后，一步法灌装充入HFA-134a即得。

实施例4

将格隆溴铵、Span85、Tween20和乙醇溶解后，一步法灌装充入HFA-134a即得。

实施例5

将格隆溴铵、Solutol HS15和乙醇溶解后，冷罐法灌装充入HFA-227即得。

实施例6

将格隆溴铵、大豆磷脂、寡聚乙酸和乙醇溶解后，冷罐法灌装充入HFA-227即得。

实施例7

将格隆溴铵、PEG400和Cremophor EL溶解后，两步法灌装充入HFA-227和HFA-134a即得。

实施例8

将格隆溴铵、Bri J30、Fluronic F-68和乙醇溶解后，一步法灌装充入HFA-227和HFA-134a即得。

实施例9

将格隆溴铵和乙醇溶解后，一步法灌装充入HFA-227和HFA-134a即得。

实施例10

将格隆溴铵、寡聚乙酸和乙醇溶解后，冷罐法灌装充入HFA-227即得。

实施例11

（3R，2R）-、（3S，2R）-、（3R，2S）-和（3S，2S）-3-[环戊基-羟基苯基乙酰基]氧基]-1，1-二甲基吡咯烷甲磺酸盐(格隆甲磺酸铵)的制备。

将格隆溴铵39.8g溶于200ml水中，加氧化银粉末124g，在室温条件下搅拌5小时，滤除沉淀，取滤液，加入1M的甲磺酸溶液100ml，浓缩后获得格隆甲磺酸铵结晶，干燥重量为27.4g，产率为67.99%。

溶液型气雾剂的制备

将格隆甲磺酸铵与乙醇和油酸溶解后，一步法灌装充入HFA-134a即得。

实施例12

（3R，2R）-、（3S，2R）-、（3R，2S）-和（3S，2S）-3-[环戊基-羟基苯基乙酰基]氧基]-1，1-二甲基吡咯烷氯化物(格隆氯铵的制备)。

将格隆溴铵39.8g溶于200ml水中，加氧化银粉末124g，在室温条件下搅拌5小时，滤除沉淀，取滤液，加入1M的盐酸溶液100ml，浓缩后获得格隆氯铵结晶，干燥重量为26.2g，产率为74.1%。

溶液型气雾剂的制备

将格隆氯铵与乙醇和油酸溶解后，一步法灌装充入HFA-134a即得。

对照实施例1

组分        重量（份）

格隆溴铵    20

化合物A     100

乳糖        19880

对照实施例2

组分        重量（份）

格隆溴铵    100

乳糖        19800

对照实施例3

组分        重量（份）

格隆溴铵    500

化合物A     100

乳糖        19400

上述对照实施例1和3如中国专利CN1953745A所描述，制备使用于胶囊吸入器的方法是按照US3991761和EP1270034中所描述的胶囊吸入器的明胶胶囊，每个胶囊包含干燥粉末，该粉末通过将粉碎至平均粒径为1-5μm的格隆溴铵和化合物A与粒径低于212μm的乳糖一水化合物进行混合而得到。对照实施例2是对照实施例1去掉化合物A的格隆溴铵单方，制备方法同对照实施例1。

对照实施例4

组分        重量（份）

格隆溴铵    20

化合物B     100

乳糖        4880

对照实施例5

组分        重量（份）

格隆溴铵    100

化合物B     100

乳糖        4800

对照实施例6

组分        重量（份）

格隆溴铵    500

乳糖        19400

上述对照实施例4-5如中国专利CN1953745A所描述，通过将粉碎至平均粒径为1-5μm的格隆溴铵和化合物B与粒径低于212μm的乳糖一水化合物进行混合，制备如WO 97/20589所述的多剂量吸入器储库即成。对照实施例6是对照实施例5去掉化合物A的格隆溴铵单方，制备方法同对照实施例5。

对照实施例7

对照实施例8

对照实施例9

对照实施例10

上述对照实施例7-9如中国专利CN1953745A所描述，通过将微粉化的活性成份格隆溴铵和化合物C和填充剂乳糖（需要时）分装入小瓶中，用计量阀门封闭小瓶，通过阀将预先混合的乙醇抛射剂和任选的表面活性剂注入小瓶，并将小瓶用超声波分散固体颗粒而制得气雾剂。对照实施例10是对照实施例5去掉化合物A的格隆溴铵单方，制备方法同对照实施例9。

实验例1 样品中药物含量和有关物质的测定：

实施例1-12的药物溶液为澄明液体，将该液体经过0.22μm微孔滤膜过滤，经过HPLC测定，滤液中药物含量与过滤前的溶液相同。

对照实施例1-6外观为白色或类白色粉末，不能过滤。

对照实施例7-10性状为混悬液的形式，其是药物颗粒混悬于乙醇和油酸混合溶媒中，经过0.22μm微孔滤膜过滤，经HPLC进行含量测定，在滤液中的格隆溴铵不足5%。

HPLC含量测定方法的色谱条件如下：

色谱柱：C₁₈色谱柱；流动相：A,30%:B,70%混合液，A：HFBA(15mM)-ammonium formate buffer(20mM)用甲酸校正到pH3.30；B：甲醇。检测波长：238nm；流速100μl/min；进样量：20μl。

含量测定对照品溶剂配制：精密称取格隆溴铵对照品适量，加甲醇溶解，制成每1ml含20ng格隆溴铵溶液作为对照品溶液。

有关物质测定对照品溶剂配制：精密称取格隆溴铵对照品适量，加甲醇溶解，制成每1ml含0.2ng格隆溴铵溶液作为1%对照品溶液。

实验例2 各种气雾剂的FPF值和气雾剂在长期留样及加速条件下的稳定性研究

TI粒径分布的测定

FPF作为衡量吸入制剂质量控制中一个重要的参数，与制剂的疗效有着很大的相关性。实施例样品1～12和混旋型样品对照实施例7-10，分别选择20瓶样品，照美国和英国药典，采用Andersen Cascade Impactor测定样品的细微粒子（＜5μm）分数（FPF）。粉雾吸入型样品胶囊型对照实施例1-3和对照实施例4-6照中国药典2010版，二部附录XH中收载的吸入气雾剂滴(粒)分布测定法及仪器进行。具体测定方法如下：

（1）溶液型（混悬型）气雾剂的FPF：试验环境相对湿度应为45%～55%。调节流速至30L/min。分别取本品20瓶。在22±2℃至少放置1小时；充分振荡后，弃去4喷，用水冲洗阀门与驱动器，晾干，再弃去2喷，开启真空泵，振摇5秒钟，将本品插入专用橡胶接口，立即喷射1次，取下驱动器和铝罐，振摇5秒钟，重新插入橡胶接口，立即喷射2次，重复此过程，直至完成5次，最后一次喷射后，等待1分钟，取下铝罐，关闭电源。用水洗涤橡胶接口和导管，撞击器各沉积杯；滤纸，各部分洗液定容至刻度，摇匀，精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按照外标法以峰面积计算，从撞击器第四层沉积杯至滤纸所收集药物除以各部分收集药物的总和，即得样品的FPF值。

（2）胶囊型吸入粉雾剂的FPF：取供试品胶囊1粒，置吸入装置内，用手指揿压装置两侧按钮。将胶囊两端刺破，开启真空泵，吸入装置经适宜橡胶接口与模拟喉部B呈水平紧密相接，10秒钟后取下吸入器。重复上述操作，共测定20粒胶囊，在最后一次操作后，取下驱动器和铝罐，计时，等待5秒钟，撤除装置。用水洗涤驱动器；橡胶套和喉部；喉管和一级分布瓶；滤器、F接口及导入下部锥形瓶的导管内壁及垫片凸出物的表面和第二级分布瓶（三角烧瓶）。各部分洗液定容至刻度、摇匀，精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按照外标法以峰面积计算。滤器、F接口及导入下部锥形瓶的导管内外壁及垫片凸出物的表面和第二级分布所收集药物量除以各部分收集药物的总和、即得样品的FPF值。

（3）储库型吸入粉雾剂的FPF：旋转装置，将供试品一个剂量的药物释放至储库中，开启真空泵，吸入装置经适宜橡胶接口与模拟喉部B呈水平紧密相接，10秒钟后取下吸入器。重复上述操作，共测定20个剂量，在最后一次操作后，取下驱动器和铝罐，计时，等待5秒钟，撤除装置。用水洗涤驱动器；橡胶套和喉部；喉管和一级分布瓶；滤器、F接口及导入下部锥形瓶的导管内壁及垫片凸出物的表面和第二级分布瓶（三角烧瓶）。各部分洗液定容至刻度、摇匀，精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按照外标法以峰面积计算。滤器、F接口及导入下部锥形瓶的导管内外壁及垫片凸出物的表面和第二级分布所收集药物量除以各部分收集药物的总和、即得样品的FPF值。

将上述实施例样品和对照实施例样品进行长期留样（25、60%RH）和加速（40℃、75%RH）试验，在6个月内选定不同的时间点进行FPF测定，结果见表1和表2。

表1 制剂稳定性长期留样FPF结果（100μg，储存在25℃/60%RH）

表2 制剂加速试验FPF结果（100μg，储存在40℃/75%RH）

从实施例样品和对照实施例样品长期留样和加速试验FPF的稳定性研究中可以发现，溶液型气雾剂处方在长期稳定性储存条件下（25℃/60%RH）和加速条件下（40℃/75%RH），溶液型气雾剂FPF值的稳定性优于混悬型气雾剂和粉雾型气雾剂，溶液型在各种条件下FPF基本不变，混悬型有一定的下降，而粉雾型下降非常明显。

实验例3 实施例气雾剂在加速条件下的稳定性研究

在加速条件下（40℃/75%RH）样品，采用实验例1的方法，测定各实施例的有关物质，结果见表3。

表3 格隆溴铵或衍生物制剂加速试验有关物质结果（100μg，储存在40℃/75%RH）

实验例4 抗慢性阻塞性气道炎症和气道纤维化作用（格隆溴铵对吸烟诱导小鼠气道炎症和气道纤维化的作用）

1.小鼠吸烟模型制备：小鼠放入45cm(L)×45cm(W)×20cm(H)≈40L的有机玻璃盒子中，密闭，点燃香烟后，用泵把烟雾抽入有机玻璃盒子中。每支香烟吸入10min，每支烟抽完10min后，打开有机玻璃盖子，吹入空气10min。第一天吸烟7支，第二天吸烟7支，第三天吸烟9支，第四天吸烟11支。应用的香烟为研究级香烟（Research Cigarettes.CODE 3R4F,Tobacco-Health Research University ofKentucky.）

2.分组和给药：雌性ICR小鼠100只分5组为：每组动物数20只。即溶媒对照组（模型组）、相同剂量格隆溴铵实施例2（溶液型）、对照实施例2（粉雾型，胶囊）、对照实施例10（混悬型）样品（所有样品均储存于25℃/60%RH条件下3个月）吸入2min各一组。另设一组空白对照组。小鼠于吸烟前放置上述有机玻璃盒内，盒的侧面有一个孔，插入橡胶接口，接口与气雾罐喷嘴连接。向钟罩内连续喷射实施例2样品、对照实施例2样品、对照实施例10样品2min，每喷的间隔时间为10秒钟，重复此过程，直至完成，最后一次喷射后，等待1分钟，取下钟罩。以上试验每天给药2次，间隔12h，连续4天。

3.BALF白细胞计数：小鼠麻醉后开胸，右下叶肺结扎，行支气管肺泡灌洗，取部分BALF与白细胞计数液1:1混合，做白细胞计数。其余BALF4℃，3000rpm/min离心10min。沉淀用于涂片，瑞士-吉姆萨染色后做白细胞分类计数。

4.肺组织肿瘤坏死因子（TNF）-α、IL-1β、单核细胞趋化蛋白（MCP）-1、IL-8和KC mRNA表达的测定：总RNA提取：100mg组织中加入1.0ml TRIZOL，经氯仿，异丙醇处理，75%乙醇洗涤，挥干后溶于DEPC处理的水中。经核酸紫外分析仪检测，测定A260/A280比值和总RNA含量。逆转录：取4g总RNA，用M-MLV逆转录酶，置PCR仪中逆转录为cNDA。TNF-α、IL-1β和IL-8用RT-PCR法测定，PCR扩增产物用1.5%琼脂糖电泳检测。结果以光密度比值表示（IOD_Sample/IOD_β-actin）。MCP-1和KC用荧光定量PCR测定。

5.肺组织髓过氧化物酶（MPO）、超氧化物歧化酶（SOD）、TNF-α、IL-8和IL-1β含量的测定：称量小鼠肺组织，PBS制成10%的匀浆。12000rpm×10min离心后，上清液用于测定MPO、SOD、TNF-α、IL-8和IL-1β。

6.肺组织病理切片制备与观察：小鼠麻醉后开胸，取右下叶肺组织浸泡于4%甲醛中，7天后取材，石蜡包埋，切5μm薄片，铺于玻片，以HE染色观察肺泡的中性粒细胞和巨噬细胞浸润。

7.结果

7.1 实施例2、对照实施例2、对照实施例10样品对小鼠吸烟模型BALF中炎症细胞的影响:结果小鼠吸烟4d后，模型组小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中白细胞总数、中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞数目均较对照组显著增加（P<0.05～0.001）。与模型组比较，对照实施例7样品、对照实施例1样品和实施例2样品2min气雾吸入给药抑制BALF中白细胞总数（P<0.05～0.001）抑制率分别为21.1%、40.3%（P<0.001）和47.4%（P<0.001）。对中性粒细胞的抑制率分别为57.1%、76.7%（P<0.01）和84.0%（P<0.001）；对巨噬细胞数抑制率分别为0.26%、24.5%和30.0%（P<0.05）；对淋巴细胞的升高无明显作用，见表4。

表4 实施例2和对照实施例2、10样品对小鼠吸烟模型BALF中炎症细胞的影响

表注：^###P<0.001vs对照组；^*P<0.05,^**P<0.01,^***P<0.05vs模型组。

7.2 实施例2、对照实施例2、对照实施例10样品对小鼠吸烟模型肺组织中TNF-α、IL-1β和IL-8 mRNA表达的影响：结果见表5，小鼠吸烟4d后，RT-PCR法测得模型组小鼠肺组织中TNF-α、IL-1β和IL-8mRNA的表达均较对照组显著升高（P<0.001），与模型组比较，对照实施例2、10和实施例2样品均抑制TNF-α、IL-1β和IL-8 mRNA表达(P<0.05)。

表5 实施例2和对照实施例2、10样品气雾吸入对吸烟小鼠肺组织中TNF-α、IL-1β和IL-8mRNA表达的影响

表注：同表4

7.3 实施例2、对照实施例2、对照实施例10样品对吸烟小鼠肺组织中KC和MCP-1 mRNA表达的影响：结果见表6，小鼠吸烟4d后，荧光定量PCR法测得模型组小鼠肺组织中KC和MCP-1 mRNA表达较对照组显著升高（P<0.001），与模型组比较，对照实施例1、7和实施例2样品均显著抑制肺组织KC和MCP-1mRNA表达（P<0.01～0.001）。

表6 实施例2和对照实施例2、10样品气雾吸入对吸烟小鼠肺组织中KC和MCP-1mRNA表达的影响

表注：同表4

7.4 实施例2、对照实施例2、对照实施例10样品对吸烟小鼠肺组织中TNF-α、IL-8和IL-1β蛋白含量的影响：结果见表7，小鼠吸烟4d后，ELISA法测得模型组小鼠肺组织中TNF-α、IL-8和IL-1β蛋白含量较对照组显著升高（P<0.01），与模型组比较，对照实施例2和实施例2样品显著抑制肺组织TNF-α、IL-8和IL-1β蛋白含量（P<0.05～0.01），对照实施例10样品没有显著抑制肺组织TNF-α、IL-8和IL-1β蛋白含量（P>0.05）。

表7 实施例2和对照实施例1、7样品气雾吸入对吸烟小鼠肺组织中TNF-α、IL-8和IL-1β蛋白含量的影响

表注：同表4

7.5 实施例2、对照实施例2、对照实施例10样品对小鼠吸烟模型肺组织中MPO、SOD的影响：结果见表8，小鼠吸烟4d后，模型组小鼠肺组织中MPO含量较对照组显著上升（P<0.01），SOD较对照组显著下降（P<0.01）。与模型组相比，对照实施例2、10和实施例2样品均呈显著抑制肺组织中的MPO含量（P<0.05）和升高SOD含量(P<0.05)。

表8 实施例2和对照实施例2、10样品气雾吸入对小鼠吸烟模型肺组织中MPO和SOD的影响

表注：同表4

7.6 实施例2、对照实施例2、对照实施例10样品对吸烟小鼠肺组织中炎症细胞浸润的影响：小鼠吸烟4d后，模型组小鼠气道周围中性粒炎症细胞和肺泡腔巨噬细胞浸润明显增加。与模型组比较，对照实施例2、10和实施例2样品均显著抑制中性粒细胞和巨噬细胞浸润。但在同等给药剂量下，实施例2样品比对照实施例2、10作用更强。

实验例5 抗哮喘作用（格隆溴铵对致敏小鼠抗原攻击后气道炎症、气道高反应和气道重塑的作用）

1.致敏小鼠：以卵白蛋白作为过敏源，以氢氧化铝凝胶为佐剂。致敏21天后用于试验。

2.分组：分5组，每组动物数10-12只。即溶媒对照组（模型组）、相同剂量格隆溴铵对照实施例6（粉雾型，储库）、10（混悬型）和实施例4（溶液型）样品（所有样品均储存于25℃/60%RH条件下3个月）吸入8min各一组。另设一组空白对照组。

3.抗原攻击：致敏21天后将致敏小鼠放置45cm(L)×45cm(W)×20cm(H)≈40L的有机玻璃盒子中，盒子的侧面有一个孔，插入橡胶接口，接口与气雾罐喷嘴连接。向钟罩内连续喷射8min，每喷的间隔时间为10秒钟，重复此过程，直至完成，最后一次喷射后，等待1分钟，取下钟罩。试验样品为对照实施例6、10和实施例4；溶媒为乙醇和油酸，充HFA-134a。给药后5分钟，小鼠再次放置有机玻璃盒子内，用10mg/ml卵白蛋白气雾吸入30min（雾化吸入器：PARI TurboBOY，由德国百瑞公司生产）。以上试验每天重复1次，共计7天。

4.支气管肺泡灌洗（bronchoalveolar lavegar fluid，BALF）：测定BALF液中的白细胞总数和嗜酸性粒细胞（eosinophil，EOS）数目，测定BALF中的细胞因子白介素（IL）-4、IL-5、嗜酸性粒细胞趋化因子（CCL-11）和γ-干扰素（IFN-γ）水平。

5.气道高反应测定：以小鼠肺功能测定仪测定气道阻力（R_L）和动态肺顺应性（C_dyn）；

6.蛋白和mRNA表达测定：肺组织匀浆后用蛋白质印迹（western blot）法测定RhoA-GTPase表达，以逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）法测定肺组织匀浆中的CCL-11、IL-4、IL-5和IFN-γmRNA的表达。

7.肺组织形态学检查：组织切片，以苏木精和伊红（H&E）染色观察评价肺组织炎症细胞的浸润；以高碘酸-希夫（PAS）染色观察评价肺上皮细胞增生和分泌；以马森三色（Masson trichrome）染色观察评价黏膜下胶原沉积。

8.结果：格隆溴铵对照实施例6、对照实施例10和实施例4样品吸入8min预处理均可明显地减少BALF中白细胞总数和嗜酸性粒细胞数目（见图1）；可显著地抑制肺组织匀浆中的CCL-11、IL-4和IL-5的表达mRNA，但对IFN-γmRNA的表达无明显影响（见图2）；可显著地抑制BALF中的CCL-11、IL-4、IL-5、和IFN-γ水平（见图3）；可显著地抑制氨甲酰胆碱诱导的气道高反应（见图4）；可显著地抑制肺组织炎症细胞特别是嗜酸性粒细胞的浸润（H&E染色）；可显著地抑制气道上皮细胞增生和分泌（PAS染色）；可显著地抑制黏膜下胶原沉积（Masson trichrome染色）。结果显示：由于粉雾型、混悬型和溶液型样品FPF值有差异，而且在放置过程中溶液型最稳定，混悬型其次，粉雾型最不稳定，导致同样给药剂量的样品抗哮喘气道炎症、气道高反应和气道重塑作用的强度有所不同，格隆溴铵实施例4样品具有最强的抗哮喘气道炎症、气道高反应和气道重塑作用，结果与FPF的测定值和稳定性研究的数据较一致。

实施验例6 气管扩张作用

一、离体研究：

1.方法：豚鼠离体气管：所有的离体气管都取自雄性Dunkin–Hartley豚鼠(250–350g)。从气管平滑肌反面纵向切开，横切成两段标本（每份取4-5小段）。每份标本置于含有通5%CO₂和95%O₂的克-亨10的浴槽中，恒温37℃。气管条上接张力换能器，初始静息张力为1g。采用MedLab系统记录实验数据。平衡60分钟后，加入0.3μM卡巴胆碱（CCh）,预实验证明在这个浓度下平滑肌能够达到最大收缩的80-90%。在标本收缩稳定后，通过加入0.3μM异丙肾上腺素（ISO）使标本松弛。在完全洗脱掉CCh和ISO后，再次给予CCh，直到达到具有重复性的收缩反应的效果。结果表示：以ISO诱导的最大舒张作为100%效应参照，格隆溴铵和噻托溴铵累积浓度加入浴槽引起的松弛反应以松弛百分率表示。松弛50%的浓度（IC₅₀）浓度采用poms软件计算。

2.结果：格隆溴铵拮抗CCh收缩离体豚鼠气管平滑肌作用强度的比较：结果见图5，本发明单位自主合成的格隆溴铵（Gly-CPS）和美国购买的格隆溴铵（Gly-UPS）以及阳性对照药噻托溴铵（Tio）对CCh引起的离体豚鼠气管平滑肌收缩均呈剂量依赖地松弛。Tio松弛50%的浓度（IC₅₀）为0.9×10^-9mol，Gly-CPS IC₅₀为2.07×10^-8mol，Gly-UPS IC₅₀为2.09×10^-8mol，溶媒无明显作用。

二、整体研究：麻醉豚鼠的Ach诱导的气管收缩反应：

1.方法：所有的实验使用Hartley豚鼠（350-400g），雌雄不限。动物用乌拉坦（1.2g/kg,腹腔注射）麻醉。气管进行插管，用小动物肺功能测定仪测定气道阻力。动物的气管收缩反应由气雾吸入不同浓度的乙酰甲胆碱（Mch，3.125～12.5mmol/L）诱导。分组和给药：40只豚鼠分4组：每组动物数10只。即溶媒对照组（模型组）、相同剂量格隆溴铵对照实施例10（混悬型）、对照实施例2（粉雾型，胶囊）和实施例1（溶液型）样品（试验所有样品均储存于25℃/60%RH条件下3个月）吸入2min各一组。豚鼠放置上述有机玻璃盒内，盒的侧面有一个孔，插入橡胶接口，接口与气雾罐喷嘴连接。向钟罩内连续喷射对照实施例10、对照实施例2和实施例1样品2min，每喷的间隔时间为10秒钟，重复此过程，直至完成，最后一次喷射后，等待1分钟，取下钟罩。以上试验为单次剂量给药。

2.结果：对照组豚鼠气雾吸入生理盐水后，以不同浓度Mch（3.125～12.5mmol/L）激发后的肺功能测定，结果显示跨肺压呈对照实施例10、对照实施例2和实施例1样品依次增高，潮气量和气道流速呈对照实施例10、对照实施例2和实施例1样品依次下降，经计算R_L增加，C_dyn降低。实施例1样品气雾吸入2min几乎完全抑制Mch气雾吸入诱导的R_L增加和C_dyn降低（图6）。对照实施例10、对照实施例2抑制Mch气雾吸入诱导的R_L增加和C_dyn降低作用强度不及实施例1。实施例1最强，对照实施例2次之，对照实施例10最弱，这与样品的FPF值测定结果相一致。

Claims (14)

1.一种溶液型定量吸入气雾剂，含有式I所示的药学可接受的季铵盐型化合物或其光学异构体化合物、潜溶剂、表面活性剂和抛射剂，其中式I化合物具有如下结构：

M^-为有机或无机阴离子。

2.根据权利要求1所述气雾剂，所述M^-选自溴离子、氟离子、氯离子、碘离子、硝酸根、硫酸根、磷酸根、甲酸根、乙酸根、三氟乙酸根、丙酸根、丁酸根、乳酸根、柠檬酸根、酒石酸跟、苹果酸根、马来酸根、琥珀酸根、苯甲酸根、对氯苯甲酸根、二苯基乙酸根、三苯基乙酸根、邻-羟基苯甲酸根、对-羟基苯甲酸根、1-羟基萘-2-甲酸根、3-羟基萘-2-甲酸根、甲磺酸根或对甲苯磺酸根。

3.根据权利要求2所述气雾剂，所述M^-选自溴离子，即式I化合物为格隆溴铵，具有如下结构：

4.根据以上任一项权利要求的气雾剂，其式I化合物或其光学异构体含量按重量百分比为0.005-1%，优选0.02～0.5%。

5.根据权利要求1-3中任一项的气雾剂，其潜溶剂包含无水乙醇、甘油、二醇类中的一种或一种以上的混合物。

6.根据权利要求5所述的气雾剂，其潜溶剂含量按重量百分比为5-40%，优选10-30%。

7.根据权利要求1-3中任一项的气雾剂，其表面活性剂包含油酸；寡聚乳酸；脱水山梨醇类；聚氧乙烯脂肪醇类；聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物；聚乙二醇硬脂酸酯类；磷脂类中的一种或一种以上的混合物。

8.根据权利要求7的气雾剂，其表面活性剂含量按重量百分比为0-3%，优选0.005～2%。

9.根据权利要求1-3中任一项的气雾剂，所述抛射剂包含四氟乙烷、七氟丙烷中的一种或它们的混合物。

10.根据权利要求9的气雾剂，其抛射剂含量按重量百分比为50-90%，优选70～80%。

11.根据权利要求1-3中任一项的气雾剂，还进一步含有其他活性成分。

12.根据权利要求11的气雾剂，其他活性成分包含抗炎药、支气管扩张药、抗组胺药、解充血药和镇咳药的一种或几种。

13.根据权利要求1-3中任一项的气雾剂的制备方法，其是将式I化合物或其光学异构体、潜溶剂和表面活性剂溶解后，经一步压力灌装法、两步压力灌装法、一步冷冻灌装法和盖下灌装法灌装后充入抛射剂制备而成。

14.权利要求1-3所述的吸入气雾剂在制备治疗慢性阻塞性肺病和支气管哮喘的药物中的用途。

Images