CN103766256A - 一种提高香港牡蛎天然采苗效率的预报方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高香港牡蛎天然采苗效率的预报方法。本发明通过幼虫样品采集、表型分类、分子识别、综合评估和适时采苗等环节,在天然海区能够成功获取大量香港牡蛎稚贝。不但提高了天然采苗数量,保证了苗种质量,而且解决了以往盲目性采苗存在的数量不稳、种类混杂、多次复采等问题,这为香港牡蛎资源恢复及其养殖产业发展提供了充足的苗种来源。
Description
技术领域:
本发明属于海洋农业中贝类苗种繁育领域,具体涉及一种提高香港牡蛎天然采苗效率的预报方法。
背景技术:
香港牡蛎Crassostreahongkongensis是我国华南沿海养殖的主要养殖经济种,喜欢生活在近河口或附近有淡水注入的地方,主要分布在广东、广西等地,年产量在130多万吨,产值在80-100亿元(中国渔业年鉴,2013)。
香港牡蛎在我国已有近千年的养殖历史,传统上蚝民们是以天然采作为苗种的唯一来源。学者们很早就开始研究牡蛎的天然采苗,包括对近江牡蛎(胡家财等,1994;陈振汉&李友,1997;莫新,2004,钟方杰等,2012)、葡萄牙牡蛎(宋传福,2013)、长牡蛎等采苗技术研究。但由于采苗预报精确度不足,往往会导致采苗失败,存在稳定性差,苗种相对混杂等缺陷。尤其是与香港牡蛎生活在一起近江牡蛎,俗称红肉,是一种经济价值低劣的废品蚝,在香港牡蛎采苗时,很有可能会有不同比例近江牡蛎苗种混淆,如果混淆比例过高,大大影响了香港牡蛎苗种的经济价值。为此,采苗预报非常重要,传统的牡蛎采苗主要是靠定期观测,在牡蛎繁殖季节到来之前,早早投放附着基,担心采不到牡蛎幼虫。这种做法实际上存在着一些问题,牡蛎幼虫是否可以采得到,需要有天时地利人和,更要有科学的采苗预报技术。
发明内容:
本发明的目的是为了打破香港牡蛎苗种长期匮乏局面;提高香港牡蛎天然采苗效率;保证采苗数量、质量;回避多次复采所带来的劳动力及其资源浪费;来提高采苗效率的一种预报方法。
本发明提高香港牡蛎天然采苗效率的预报方法,其特征在于,包括以下步骤:
a、幼虫采集:在天然海区,当香港牡蛎进入繁殖季节时,定期采集牡蛎样品,观测是否产卵排精,当发现牡蛎受刺激后消瘦,经过10~15天后,受精卵发育至眼点前期幼虫,采集海区表层0.5~1m处的贝类幼虫作为样本;
b、表型分类:对采集的样品,首先通过显微镜观察分类,将牡蛎幼虫、其他双壳贝类幼虫和藤壶幼虫进行区分,确定牡蛎幼虫的占比、牡蛎眼点前期幼虫的占比以及藤壶幼虫的占比;
c、分子识别:随机提取若干个单个牡蛎眼点前期幼虫的DNA,用4种巨蛎属牡蛎的复合COI引物进行复合PCR扩增(Wang&Guo,2008),再经过特异性识别,即可得知牡蛎眼点前期幼虫的种类,确定香港牡蛎眼点前期幼虫/牡蛎幼虫的比例,以及其密度;
所述的4种巨蛎属牡蛎的复合COI引物具体为:
COI引物1:AAAAAAGATTATAACTAATGCATGTCG(T)G
COI引物2:AGTTACCAAACCCCCCAATTATCAG(C)G
COI引物3:GGAGTAAGTGGATAAGGGTGGATAG
COI引物4:AAGTAACCTTAATAGATCAGGGAAC(A)C
LCO1490:GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG
HC02198:TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA
LCO1490和HC02198是巨蛎属牡蛎的通用引物,只要是巨蛎属牡蛎,用COI基因组DNA作为模板的话,都能扩增出一条都有的条带;
d、综合评估:当香港牡蛎眼点前期幼虫/牡蛎幼虫的比例≥70%,香港牡蛎眼点前期幼虫的密度≥50个/m3,敌害生物藤壶幼虫/牡蛎幼虫的比例≤10%时,即达到采苗要求;
e、适时采苗:当香港牡蛎眼点前期幼虫发育至眼点后期阶段时,发送采苗预报,投放附着基至海区,即可采收到大量天然香港牡蛎苗种。
步骤a所述的刺激为台风或者暴雨等刺激。
所述的采集海区表层0.5~1m处的贝类幼虫作为样本,采用300目筛绢网进行优选取样。
本发明的4种巨蛎属牡蛎的复合COI引物及其鉴定4种巨蛎属牡蛎的方法公开于Wang,H.,Guo,X.,2008a.IdentificationofCrassostreaariakensisandrelatedoystersbymultiplespecies-specificPCR.JournalofShellfishResearch27,481–487。
本发明通过幼虫样品采集、表型分类、分子识别、综合评估和适时采苗等环节,在天然海区能够成功获取大量香港牡蛎稚贝。不但提高了天然采苗数量,保证了苗种质量,而且解决了以往盲目性采苗存在的数量不稳、种类混杂、多次复采等问题,这为香港牡蛎资源恢复及其养殖产业发展提供充足的苗种来源。
附图说明:
图1实线部分是本发明的技术路线图,虚线部分为传统采苗工艺。
图2是不同发育时期牡蛎幼虫示意图。A:面盘初期幼虫;B:面盘中期幼虫;C:面盘后期幼虫(眼点前期幼虫);D:眼点后期幼虫。
图3是参照Wang&Guo方法利用复合COI识别牡蛎幼虫种类,A:PCR产物琼脂糖电泳图;B:示意图。注:M是2000bpDNAmarker;粗线条表示每种牡蛎的特异性片段;Ar近江牡蛎幼虫产生183bp特异片段;An葡萄牙牡蛎幼虫产生222bp特异片段;Hk香港牡蛎幼虫产生387bp特异片段;Si熊本牡蛎幼虫产生546bp特异片段。
具体实施方式
以香港牡蛎天然采苗为实施例进一步说明本发明,但不构成对本发明的限制。
实施例1
本实施例提高香港牡蛎天然采苗效率的预报方法,其技术方案如图1所示,具体步骤为:
(a)、幼虫采集:于2013年6-7月,香港牡蛎繁殖季节时,在湛江官渡定期采集牡蛎样品,观测是否产卵排精。于6月20日,台风过后,发现牡蛎消瘦,海区中就存在牡蛎幼虫,经过15d,幼虫即发育至眼点前期幼虫,利用300目筛绢网在海区表层0.5-1.0m处收集贝类幼虫,经过浓缩,放置于采样瓶中作为样本。
(b)、表型分类:对于采集到的样品,首先通过显微镜观察进行分类。根据牡蛎幼虫在壳顶中后期左右壳不等大,而绝大部分其他双壳贝类幼虫左右壳大小相等这一特点进行区分。结果发现,该海区中,大部分牡蛎幼虫已经进入眼点前期幼虫阶段,还有部分处于壳顶初期及中期阶段(图2);样品里面有少部分双壳类幼虫及其藤壶幼虫。应用视野法进行计数发现,牡蛎幼虫所占比例为90%,牡蛎眼点前期幼虫所占比例为75%左右,藤壶幼虫的占比约为8%。
(c)、分子识别:对这些大个体的牡蛎眼点前期幼虫,参考包振民等的专利方法(专利号:ZL03112331.7,发明名称:贝类遗传图谱的快速构建方法)提取单个牡蛎眼点前期幼虫的DNA,之后按照Wang&Guo方法(Wang,H.,Guo,X.,2008a.IdentificationofCrassostreaariakensisandrelatedoystersbymultiplexspecies-specificPCR.JournalofShellfishResearch27,481–487),应用4种巨蛎属牡蛎的复合COI引物进行复合PCR扩增,再经过特异性片段大小差异,即可得知牡蛎幼虫的种类,估算香港牡蛎幼虫所占比例(图3)以及密度。结果发现,所用的100个牡蛎眼点前期幼虫中,有87个是香港牡蛎眼点前期幼虫、9个是近江牡蛎眼点前期幼虫、4个为熊本牡蛎眼点前期幼虫,也就是说,香港牡蛎眼点前期幼虫比例为87%,是优势群体,且存在着一些杂蚝幼虫(图3)。
所述的4种巨蛎属牡蛎的复合COI引物具体为:
COI引物1:AAAAAAGATTATAACTAATGCATGTCG(T)G
COI引物2:AGTTACCAAACCCCCCAATTATCAG(C)G
COI引物3:GGAGTAAGTGGATAAGGGTGGATAG
COI引物4:AAGTAACCTTAATAGATCAGGGAAC(A)C
LCO1490:GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG
HC02198:TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA
LCO1490和HC02198是巨蛎属牡蛎的通用引物,如图3所示,靠近750bp附近,Ar、An、Hk、Si都有一个条带,就是LCO1490和HC02198扩增出来的。
(d)、综合评估:经过计算,香港牡蛎眼点前期幼虫/牡蛎幼虫的比例为72.5%,牡蛎幼虫的密度是107个/m3,香港牡蛎眼点前期幼虫密度为93个/m3,敌害生物藤壶幼虫/牡蛎幼虫的比例较低≤10%。总体上来讲,基本达到了采苗要求。
(e)、适时采苗:当香港牡蛎眼点前期幼虫发育至眼点后期阶段,即眼点又黑、又大、又圆时,发送预报,投放附着基至海区。大约经过20-30d,即可看见附着基上采集到的香港牡蛎稚贝,密度约在1.5-3.0个/cm2,比传统采苗的0.5-1.5个/cm2提高了2-3倍。
实施例2
(a)、幼虫采集:于2013年7-8月,香港牡蛎繁殖季节时,在湛江官渡采完实施例1苗之后,牡蛎性腺逐步恢复。于7月17日,热带风暴过后,发现牡蛎性腺再次消瘦,按照图1所示,经过13d,幼虫即发育至眼点前期幼虫,利用300目筛绢网在海区表层0.5-1.5m处收集贝类幼虫,经过浓缩,放置于采样瓶中作为样本。
(b)、表型分类:按照实施例1中方法,发现该海区中,大部分牡蛎幼虫已经进入眼点前期幼虫,还有少数处于壳顶初期及中期(图2);样品里面有少量藤壶幼虫。应用视野法进行计数发现,牡蛎幼虫所占比例为95%,牡蛎眼点前期幼虫比例在82%左右,藤壶幼虫的占比约为5%。
(c)、分子识别:对这些大个体的牡蛎眼点前期幼虫,参考包振民等的专利方法(专利号:ZL03112331.7,发明名称:贝类遗传图谱的快速构建方法)提取单个牡蛎眼点前期幼虫的DNA,之后按照Wang&Guo方法(Wang,H.,Guo,X.,2008a.IdentificationofCrassostreaariakensisandrelatedoystersbymultiplexspecies-specificPCR.JournalofShellfishResearch27,481–487),应用5种巨蛎属牡蛎的复合COI引物进行复合PCR扩增,再经过特异性片段大小差异,即可得知牡蛎幼虫的种类,估算香港牡蛎幼虫所占比例(图3)以及密度。结果发现,所用的100个牡蛎眼点前期幼虫中,有35个是香港牡蛎幼虫、62个是近江牡蛎幼虫、3个为熊本牡蛎幼虫,即近江牡蛎幼虫是优势群体(图3)。
(d)、综合评估:经过计算,香港牡蛎眼点前期幼虫/牡蛎幼虫的比例为30.2%,牡蛎幼虫密度是96个/m3,香港牡蛎眼点前期幼虫密度为34个/m3,敌害生物藤壶幼虫/牡蛎幼虫的比例为5.3%。由于香港牡蛎眼点前期幼虫的密度较低,且牡蛎幼虫中近江牡蛎占据比例较大,而近江牡蛎被蚝民们成为废品蚝(红肉),经济价值远远低于香港牡蛎,养殖效益差,未达到采苗要求,所以不能投放附着基采苗。由于近江牡蛎与香港牡蛎常常生活在一起,通常会带来近江牡蛎被当做香港牡蛎来采苗,结果当蚝民们发现了附着基上采到是近江牡蛎的时候,已经过了采香港牡蛎苗种时节,给蚝民的采苗工作带来了很大麻烦。
为此,等到下一批次牡蛎产卵排精以后,重复实施例1中步骤,进行综合评估,如果达到采苗标准,及时投放附着基。如果尚未达到标准,就暂时不投放附着基,免得还的将附着基拿上来,晒干,重下,浪费人力、物力、财力等资源。
Claims (3)
1.一种提高香港牡蛎天然采苗效率的预报方法,其特征在于,包括以下步骤:
a、幼虫采集:在天然海区,当香港牡蛎进入繁殖季节时,定期采集牡蛎样品,观测是否产卵排精,当发现牡蛎受刺激后消瘦,经过10~15天后,受精卵发育至眼点前期幼虫,采集海区表层0.5~1m处的贝类幼虫作为样本;
b、表型分类:对采集的样品,首先通过显微镜观察分类,将牡蛎幼虫、其他双壳贝类幼虫和藤壶幼虫进行区分,确定牡蛎幼虫的占比、牡蛎眼点前期幼虫的占比以及藤壶幼虫的占比;
c、分子识别:随机提取若干个单个牡蛎眼点前期幼虫的DNA,用4种巨蛎属牡蛎的复合COI引物进行复合PCR扩增,再经过特异性识别,即可得知牡蛎眼点前期幼虫的种类,确定香港牡蛎眼点前期幼虫/牡蛎幼虫的比例,以及其密度;
所述的4种巨蛎属牡蛎的复合COI引物具体为:
COI引物1:AAAAAAGATTATAACTAATGCATGTCG(T)G;
COI引物2:AGTTACCAAACCCCCCAATTATCAG(C)G;
COI引物3:GGAGTAAGTGGATAAGGGTGGATAG;
COI引物4:AAGTAACCTTAATAGATCAGGGAAC(A)C;
d、综合评估:当香港牡蛎眼点前期幼虫/牡蛎幼虫的比例≥70%,香港牡蛎眼点前期幼虫的密度≥50个/m3,敌害生物藤壶幼虫/牡蛎幼虫的比例≤10%时,达到采苗要求;
e、适时采苗:当香港牡蛎眼点前期幼虫发育至眼点后期阶段时,发送采苗预报,投放附着基至海区,即可采收到大量天然香港牡蛎苗种。
2.根据权利要求1所述的预报方法,其特征在于,步骤a所述的刺激为台风或者暴雨。
3.根据权利要求1所述的预报方法,其特征在于,所述的采集海区表层0.5~1m处的贝类幼虫作为样本是采用300目筛绢网进行取样。
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