CN103760202B - 一种使用制备的电化学传感器对dna碱基同时检测的方法 - Google Patents
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Abstract
一种使用制备的电化学传感器对DNA碱基同时检测的方法，它涉及DNA的电化学检测。本发明是要解决现有电化学传感器难以实现对四种DNA碱基的同时灵敏分析和稳定检测，现有方法存在的易受样品污染，仪器复杂昂贵，操作繁琐问题，以及电位窗较窄，对嘧啶碱基响应电流较低，稳定性较差问题。本发明步骤如下：一：制备氧化石墨烯及溴甲酚紫溶液；二：制备石墨烯修饰电极；三：制备溴甲酚紫/石墨烯复合修饰电极；四：使用复合修饰电极检测四种碱基混合液的电化学信号，分析并确定其电化学信号所在的峰位；步骤五：对碱基混合液进行电化学检测，得到其随浓度变化的差分脉冲伏安图；建立四种DNA碱基电化学信号变化规律图。本发明适用于电化学传感器领域。
Description
技术领域
本发明涉及脱氧核糖核酸(DNA)的电化学检测，尤其是四种DNA碱基的电化学检测。
背景技术
脱氧核糖核酸(DNA)是染色体的主要化学成分，其基本构成是脱氧核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸又由磷酸、D-2脱氧核糖和碱基构成。其中碱基包括腺嘌呤(Adenine)、鸟嘌呤(Guanine)、胸腺嘧啶(Thymine)和胞嘧啶(Cytosine)。DNA作为传递遗传信息的载体，与生命的正常活动如繁殖、遗传、细胞分化等紧密相关。同时，DNA的氧化损伤和变异与生命的异常活动如肿瘤、遗传病和代谢病等有密切联系。DNA的氧化性损伤通常发生在碱基上，通过检测体液中碱基的变化可以预测DNA的损伤程度，指示某些疾病的发生，同时对于研究DNA的代谢过程及其损伤机理具有重要意义。
早期用于DNA分析测定的方法有经典的定磷法、定糖法及流式细胞技术等。近些年发展起来的分析检测方法有分光光度法、荧光光谱法、化学发光法、共振光散射法和毛细管电泳法等。然而，以上这些方法容易受到样品混浊、溶血、黄疸的干扰，而且大多数仪器复杂昂贵，操作繁琐。将电化学传感器用于对DNA，尤其是两种嘌呤碱基的分析是近年来的一个新的研究方向。然而，由于嘧啶碱基的氧化电位较高，电化学响应较弱，现有的电化学传感器难以实现对四种DNA碱基的同时灵敏分析和稳定检测。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有电化学传感器难以实现对四种DNA碱基的同时灵敏分析和稳定检测，现有方法存在的易受样品混浊、溶血、黄疸干扰，仪器复杂昂贵，操作繁琐等问题，以及现有电化学传感器电位窗较窄，对嘧啶碱基响应电流较低，稳定性较差等问题，而提供的一种使用制备的电化学传感器对DNA碱基同时检测的方法。
本发明提供的一种使用制备的电化学传感器对DNA碱基同时检测的方法，是按以下步骤进行：
步骤一：将利用Hummer方法制备的氧化石墨烯粉末，于双蒸水中超声分散10～15min，得到浓度为0.2～0.5mg/mL的氧化石墨烯悬浊液；将溴甲酚紫于浓度为0.01M的NaNO3溶液中分散，得到浓度为1.0×10-3～2.0×10-3M的溴甲酚紫溶液；
步骤二：取5～10μL步骤一得到的氧化石墨烯悬浊液，滴涂到玻碳电极表面，置于红外灯下干燥，干燥后冷却至室温，得到氧化石墨烯修饰的玻碳电极；将氧化石墨烯修饰的玻碳电极置于pH＝5～7的PBS溶液中进行恒电位还原，还原电位为-1.0～-1.5V，还原时间为360～720s，即得石墨烯修饰电极，室温晾干待用；
步骤三：将步骤二中制得的石墨烯修饰电极置于步骤一得到的溴甲酚紫溶液中进行循环伏安扫描，其中，电位为-1.0～+1.5V，扫描速率为50～100mVs-1，循环次数为10～15圈，即得溴甲酚紫/石墨烯复合修饰电极；
步骤四：用步骤三制备的溴甲酚紫/石墨烯复合修饰电极检测四种碱基混合溶液的电化学信号，确定四种碱基电化学信号所在的峰位；其中，所述的溴甲酚紫/石墨烯复合修饰电极检测的工作条件如下：温度为22～25℃、脉冲高度为0.01～0.1V，脉冲宽度为0.01～0.1s，电位增量为0.005～0.015V；所述的四种碱基混合溶液由浓度为0.20～200.0μM的鸟嘌呤、浓度为0.20～220.0μM的腺嘌呤、浓度为2.0～700.0μM的胸腺嘧啶、浓度为2.50～650.0μM的胞嘧啶和pH＝7.0～7.4、浓度为0.1～0.2M的PBS缓冲液制成；
步骤五：对待测的四种碱基混合液采用进行步骤三制备的溴甲酚紫/石墨烯复合修饰电极进行电化学检测，得到鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶随浓度变化的差分脉冲伏安图；然后分别以碱基浓度为横坐标，以电化学检测的电流信号为纵坐标，建立四种DNA碱基电化学信号变化规律图；其中，所述的溴甲酚紫/石墨烯复合修饰电极检测的工作条件如下：温度为22～25℃、脉冲高度为0.01～0.1V，脉冲宽度为0.01～0.1s，电位增量为0.005～0.015V；所述的四种碱基混合溶液由浓度为0.20～200.0μM的鸟嘌呤、浓度为0.20～220.0μM的腺嘌呤、浓度为2.0～700.0μM的胸腺嘧啶、浓度为2.50～650.0μM的胞嘧啶和pH＝7.0～7.4、浓度为0.1～0.2M的PBS缓冲液制成。
本发明包含以下有益效果：
本发明提出的电化学传感器，是一种用于四种DNA碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶)同时检测的简单、快速、无标记的新型电化学传感器。
本发明的电化学传感器，以DNA碱基含量为检测指标，可同时观察到鸟嘌呤(0.66V左右)、腺嘌呤(0.92V左右)、胸腺嘧啶(1.12V左右)及胞嘧啶(1.29V左右)四个电化学信号的变化，实现对四种DNA碱基的定量检测。该电化学传感器对腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶及胞嘧啶的线性检测范围分别为0.20-220.0μM，0.20-200.0μM，2.0-700.0μM，2.50-650.0μM，最低检出限分别可达0.05μM，0.06μM，0.3μM及0.9μM。
本发明提出的一种DNA碱基同时检测的电化学传感器通过检测电化学信号来指示DNA碱基的变化情况，是一种简单、快速、灵敏、快速的新型传感器，而且不需要添加任何荧光或放射性标记物，样品不易受污染，操作非常安全。
附图说明
图1为不同修饰电极检测含50.0μM鸟嘌呤、50.0μM腺嘌呤、200.0μM胸腺嘧啶和200.0μM胞嘧啶的pH＝7.4的PBS溶液的差分脉冲伏安图，其中，a为玻碳电极电极伏安曲线，b为溴甲酚紫/玻碳电极伏安曲线，c为石墨烯/玻碳电极伏安曲线，d为溴甲酚紫/石墨烯/玻碳电极伏安曲线；
图2为鸟嘌呤随浓度变化的差分脉冲伏安图；
图3为鸟嘌呤的浓度-电化学信号变化规律图；
图4为腺嘌呤随浓度变化的差分脉冲伏安图；
图5为腺嘌呤的浓度-电化学信号变化规律图；
图6为胸腺嘧啶随浓度变化的差分脉冲伏安图；
图7为胸腺嘧啶的浓度-电化学信号变化规律图；
图8为胞嘧啶随浓度变化的差分脉冲伏安图；
图9为胞嘧啶的浓度-电化学信号变化规律图；
图10为鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶同时随浓度变化的差分脉冲伏安图。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式的一种使用制备的电化学传感器对DNA碱基同时检测的方法，其特征在于它是按以下步骤进行：
步骤一：将利用Hummer方法制备的氧化石墨烯粉末，于双蒸水中超声分散10～15min，得到浓度为0.2～0.5mg/mL的氧化石墨烯悬浊液；将溴甲酚紫于浓度为0.01M的NaNO3溶液中分散，得到浓度为1.0×10-3～2.0×10-3M的溴甲酚紫溶液；
步骤二：取5～10μL步骤一得到的氧化石墨烯悬浊液，滴涂到玻碳电极表面，置于红外灯下干燥，干燥后冷却至室温，得到氧化石墨烯修饰的玻碳电极；将氧化石墨烯修饰的玻碳电极置于pH＝5～7的PBS溶液中进行恒电位还原，还原电位为-1.0～-1.5V，还原时间为360～720s，即得石墨烯修饰电极，室温晾干待用；
步骤三：将步骤二中制得的石墨烯修饰电极置于步骤一得到的溴甲酚紫溶液中进行循环伏安扫描，其中，电位为-1.0～+1.5V，扫描速率为50～100mVs-1，循环次数为10～15圈，即得溴甲酚紫/石墨烯复合修饰电极；
步骤四：用步骤三制备的溴甲酚紫/石墨烯复合修饰电极检测四种碱基混合溶液的电化学信号，确定四种碱基电化学信号所在的峰位；其中，所述的溴甲酚紫/石墨烯复合修饰电极检测的工作条件如下：温度为22～25℃、脉冲高度为0.01～0.1V，脉冲宽度为0.01～0.1s，电位增量为0.005～0.015V；所述的四种碱基混合溶液由浓度为0.20～200.0μM的鸟嘌呤、浓度为0.20～220.0μM的腺嘌呤、浓度为2.0～700.0μM的胸腺嘧啶、浓度为2.50～650.0μM的胞嘧啶和pH＝7.0～7.4、浓度为0.1～0.2M的PBS缓冲液制成；
步骤五：对待测的四种碱基混合液采用进行步骤三制备的溴甲酚紫/石墨烯复合修饰电极进行电化学检测，得到鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶随浓度变化的差分脉冲伏安图；然后分别以碱基浓度为横坐标，以电化学检测的电流信号为纵坐标，建立四种DNA碱基电化学信号变化规律图；其中，所述的溴甲酚紫/石墨烯复合修饰电极检测的工作条件如下：温度为22～25℃、脉冲高度为0.01～0.1V，脉冲宽度为0.01～0.1s，电位增量为0.005～0.015V；所述的四种碱基混合溶液由浓度为0.20～200.0μM的鸟嘌呤、浓度为0.20～220.0μM的腺嘌呤、浓度为2.0～700.0μM的胸腺嘧啶、浓度为2.50～650.0μM的胞嘧啶和pH＝7.0～7.4、浓度为0.1～0.2M的PBS缓冲液制成。
本实施方式提出的电化学传感器，以DNA碱基含量为检测指标，可同时观察到鸟嘌呤(0.66V左右)、腺嘌呤(0.92V左右)、胸腺嘧啶(1.12V左右)及胞嘧啶(1.29V左右)四个电化学信号的变化，实现对四种DNA碱基的定量检测。该电化学传感器对腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶及胞嘧啶的线性检测范围分别为0.20-220.0μM，0.20-200.0μM，2.0-700.0μM，2.50-650.0μM，最低检出限分别可达0.05μM，0.06μM，0.3μM及0.9μM。
本实施方式提出的一种DNA碱基同时检测的电化学传感器通过检测电化学信号来指示DNA碱基的变化情况，是一种简单、快速、灵敏、快速的新型传感器，而且不需要添加任何荧光或放射性标记物，样品不易受污染，操作非常安全。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中所述的于双蒸水中超声分散为12～15min。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤一中所述的于双蒸水中超声分散为15min。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤一中所述的氧化石墨烯悬浊液浓度为0.3～0.5mg/mL。其它与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤一中所述的氧化石墨烯悬浊液浓度为0.5mg/mL。其它与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤一中所述的溴甲酚紫溶液浓度为1.5×10-3～2.0×10-3M。其它与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤一中所述的溴甲酚紫溶液浓度为2.0×10-3M。其它与具体实施方式一至六之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤二中所述的取5～8μL步骤一得到的氧化石墨烯悬浊液，滴涂到玻碳电极表面。其它与具体实施方式一至七之一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是：步骤二中所述的取5μL步骤一得到的氧化石墨烯悬浊液，滴涂到玻碳电极表面。其它与具体实施方式一至八之一相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是：步骤二中所述的的PBS的pH＝5～6。其它与具体实施方式一至九之一相同。
具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式一至十之一不同的是：步骤二中所述的的PBS的pH＝5。其它与具体实施方式一至十之一相同。
具体实施方式十二：本实施方式与具体实施方式一至十一之一不同的是：步骤二中所述的还原电位为-1.3～-1.5V。其它与具体实施方式一至十一之一相同。
具体实施方式十三：本实施方式与具体实施方式一至十二之一不同的是：步骤二中所述的还原电位为-1.5V。其它与具体实施方式一至十二之一相同。
具体实施方式十四：本实施方式与具体实施方式一至十三之一不同的是：步骤二中所述的还原时间为400～720s。其它与具体实施方式一至十三之一相同。
具体实施方式十五：本实施方式与具体实施方式一至十四之一不同的是：步骤二中所述的还原时间为500～720s。其它与具体实施方式一至十四之一相同。
具体实施方式十六：本实施方式与具体实施方式一至十五之一不同的是：步骤二中所述的还原时间为600～720s。其它与具体实施方式一至十五之一相同。
具体实施方式十七：本实施方式与具体实施方式一至十六之一不同的是：步骤二中所述的还原时间为720s。其它与具体实施方式一至十六之一相同。
具体实施方式十八：本实施方式与具体实施方式一至十七之一不同的是：步骤三中所述的聚合溴甲酚紫扫描速率为60～100mVs-1。其它与具体实施方式一至十七之一相同。
具体实施方式十九：本实施方式与具体实施方式一至十七之一不同的是：步骤三中所述的聚合溴甲酚紫扫描速率为70～100mVs-1。其它与具体实施方式一至十七之一相同。
具体实施方式二十：本实施方式与具体实施方式一至十九之一不同的是：步骤三中所述的聚合溴甲酚紫扫描速率为80～100mVs-1。其它与具体实施方式一至十九之一相同。
具体实施方式二十一：本实施方式与具体实施方式一至二十之一不同的是：步骤三中所述的聚合溴甲酚紫扫描速率为90～100mVs-1。其它与具体实施方式一至二十之一相同。
具体实施方式二十二：本实施方式与具体实施方式一至二十一之一不同的是：步骤三中所述的聚合溴甲酚紫扫描速率为100mVs-1。其它与具体实施方式一至二十一之一相同。
具体实施方式二十三：本实施方式与具体实施方式一至二十二之一不同的是：步骤三中所述的聚合溴甲酚紫循环次数为12～15圈。其它与具体实施方式一至二十二之一相同。
具体实施方式二十四：本实施方式与具体实施方式一至二十三之一不同的是：步骤三中所述的聚合溴甲酚紫循环次数为15圈。其它与具体实施方式一至二十三之一相同。
具体实施方式二十五：本实施方式与具体实施方式一至二十四之一不同的是：步骤四中所述的溴甲酚紫/石墨烯复合修饰电极工作条件如下：温度为25℃、脉冲高度为0.05V，脉冲宽度为0.05s，电位增量为0.01V。其它与具体实施方式一至二十四之一相同。
具体实施方式二十六：本实施方式与具体实施方式一至二十五之一不同的是：步骤四中所述的用作碱基溶剂的PBS缓冲液pH＝7.1～7.4。其它与具体实施方式一至二十五之一相同。
具体实施方式二十七：本实施方式与具体实施方式一至二十六之一不同的是：步骤四中所述的用作碱基溶剂的PBS缓冲液pH＝7.2～7.4。其它与具体实施方式一至二十六之一相同。
具体实施方式二十八：本实施方式与具体实施方式一至二十七之一不同的是：步骤四中所述的用作碱基溶剂的PBS缓冲液pH＝7.3～7.4。其它与具体实施方式一至二十七之一相同。
具体实施方式二十九：本实施方式与具体实施方式一至二十八之一不同的是：步骤四中所述的用作碱基溶剂的PBS缓冲液pH＝7.4。其它与具体实施方式一至二十八之一相同。
具体实施方式三十：本实施方式与具体实施方式一至二十九之一不同的是：步骤四中所述的四种碱基混合溶液由浓度为0.20～100.0μM的鸟嘌呤、浓度为0.20～100.0μM的腺嘌呤、浓度为2.0～500.0μM的胸腺嘧啶、浓度为2.50～400.0μM的胞嘧啶和pH＝7.0～7.4、浓度为0.1～0.2M的PBS缓冲液混合制成。其它与具体实施方式一至二十九之一相同。
具体实施方式三十一：本实施方式与具体实施方式一至三十之一不同的是：步骤四中所述的四种碱基混合溶液由浓度为0.20～50.0μM的鸟嘌呤、浓度为0.20～50.0μM的腺嘌呤、浓度为2.0～300.0μM的胸腺嘧啶、浓度为2.50～200.0μM的胞嘧啶和pH＝7.0～7.4、浓度为0.1～0.2M的PBS缓冲液混合制成。其它与具体实施方式一至三十之一相同。
具体实施方式三十二：本实施方式与具体实施方式一至三十一之一不同的是：步骤四中所述的四种碱基混合溶液由浓度为0.20～20.0μM的鸟嘌呤、浓度为0.20～20.0μM的腺嘌呤、浓度为2.0～100.0μM的胸腺嘧啶、浓度为2.50～100.0μM的胞嘧啶和pH＝7.0～7.4、浓度为0.1～0.2M的PBS缓冲液混合制成。其它与具体实施方式一至三十一之一相同。
具体实施方式三十三：本实施方式与具体实施方式一至三十二之一不同的是：步骤四中所述的四种碱基混合溶液由浓度为0.20～5.0μM的鸟嘌呤、浓度为0.20～5.0μM的腺嘌呤、浓度为2.0～50.0μM的胸腺嘧啶、浓度为2.50～50.0μM的胞嘧啶和pH＝7.0～7.4、浓度为0.1～0.2M的PBS缓冲液混合制成。其它与具体实施方式一至三十二之一相同。
具体实施方式三十四：本实施方式与具体实施方式一至三十三之一不同的是：步骤四中所述的四种碱基混合溶液由浓度为0.20～2.0μM的鸟嘌呤、浓度为0.20～2.0μM的腺嘌呤、浓度为2.0～10.0μM的胸腺嘧啶、浓度为2.50～10.0μM的胞嘧啶和pH＝7.0～7.4、浓度为0.1～0.2M的PBS缓冲液混合制成。其它与具体实施方式一至三十三之一相同。
具体实施方式三十五：本实施方式与具体实施方式一至三十四之一不同的是：步骤四中所述的四种碱基混合溶液由浓度为0.20～1.0μM的鸟嘌呤、浓度为0.20～1.0μM的腺嘌呤、浓度为2.0～5.0μM的胸腺嘧啶、浓度为2.50～5.0μM的胞嘧啶和pH＝7.0～7.4、浓度为0.1～0.2M的PBS缓冲液混合制成。其它与具体实施方式一至三十四之一相同。
具体实施方式三十六：本实施方式与具体实施方式一至三十五之一不同的是：步骤四中所述的四种碱基混合溶液由浓度为0.20～0.8μM的鸟嘌呤、浓度为0.20～0.8μM的腺嘌呤、浓度为2.0～3.0μM的胸腺嘧啶、浓度为2.50～3.0μM的胞嘧啶和pH＝7.0～7.4、浓度为0.1～0.2M的PBS缓冲液混合制成。其它与具体实施方式一至三十五之一相同。
具体实施方式三十七：本实施方式与具体实施方式一至三十六之一不同的是：步骤四中所述的四种碱基混合溶液由浓度为0.20～0.5μM的鸟嘌呤、浓度为0.20～0.5μM的腺嘌呤、浓度为2.0～2.5μM的胸腺嘧啶、浓度为2.50～2.8μM的胞嘧啶和pH＝7.0～7.4、浓度为0.1～0.2M的PBS缓冲液混合制成。其它与具体实施方式一至三十六之一相同。
具体实施方式三十八：本实施方式与具体实施方式一至三十七之一不同的是：步骤五中所述的四种碱基混合溶液由浓度为0.06～100.0μM的鸟嘌呤、浓度为0.05～100.0μM的腺嘌呤、浓度为0.3～500.0μM的胸腺嘧啶、浓度为0.9～400.0μM的胞嘧啶和pH＝7.0～7.4、浓度为0.1～0.2M的PBS缓冲液混合制成。其它与具体实施方式一至三十七之一相同。
具体实施方式三十九：本实施方式与具体实施方式一至三十八之一不同的是：步骤五中所述的四种碱基混合溶液由浓度为0.06～50.0μM的鸟嘌呤、浓度为0.05～50.0μM的腺嘌呤、浓度为0.3～200.0μM的胸腺嘧啶、浓度为0.9～200.0μM的胞嘧啶和pH＝7.0～7.4、浓度为0.1～0.2M的PBS缓冲液混合制成。其它与具体实施方式一至三十八之一相同。
具体实施方式四十：本实施方式与具体实施方式一至三十九之一不同的是：步骤五中所述的四种碱基混合溶液由浓度为0.06～20.0μM的鸟嘌呤、浓度为0.05～20.0μM的腺嘌呤、浓度为0.3～100.0μM的胸腺嘧啶、浓度为0.9～100.0μM的胞嘧啶和pH＝7.0～7.4、浓度为0.1～0.2M的PBS缓冲液混合制成。其它与具体实施方式一至三十九之一相同。
具体实施方式四十一：本实施方式与具体实施方式一至四十之一不同的是：步骤五中所述的四种碱基混合溶液由浓度为0.06～10.0μM的鸟嘌呤、浓度为0.05～10.0μM的腺嘌呤、浓度为0.3～50.0μM的胸腺嘧啶、浓度为0.9～50.0μM的胞嘧啶和pH＝7.0～7.4、浓度为0.1～0.2M的PBS缓冲液混合制成。其它与具体实施方式一至四十之一相同。
具体实施方式四十二：本实施方式与具体实施方式一至四十一之一不同的是：步骤五中所述的四种碱基混合溶液由浓度为0.06～5.0μM的鸟嘌呤、浓度为0.05～5.0μM的腺嘌呤、浓度为0.3～10.0μM的胸腺嘧啶、浓度为0.9～10.0μM的胞嘧啶和pH＝7.0～7.4、浓度为0.1～0.2M的PBS缓冲液混合制成。其它与具体实施方式一至四十一之一相同。
具体实施方式四十三：本实施方式与具体实施方式一至四十二之一不同的是：步骤五中所述的四种碱基混合溶液由浓度为0.06～1.0μM的鸟嘌呤、浓度为0.05～1.0μM的腺嘌呤、浓度为0.3～5.0μM的胸腺嘧啶、浓度为0.9～5.0μM的胞嘧啶和pH＝7.0～7.4、浓度为0.1～0.2M的PBS缓冲液混合制成。其它与具体实施方式一至四十二之一相同。
具体实施方式四十四：本实施方式与具体实施方式一至四十三之一不同的是：步骤五中所述的四种碱基混合溶液由浓度为0.06～0.5μM的鸟嘌呤、浓度为0.05～0.5μM的腺嘌呤、浓度为0.3～2.0μM的胸腺嘧啶、浓度为0.9～2.0μM的胞嘧啶和pH＝7.0～7.4、浓度为0.1～0.2M的PBS缓冲液混合制成。其它与具体实施方式一至四十三之一相同。
具体实施方式四十五：本实施方式与具体实施方式一至四十四之一不同的是：步骤五中所述的四种碱基混合溶液由浓度为0.06～0.1μM的鸟嘌呤、浓度为0.05～0.1μM的腺嘌呤、浓度为0.3～1.0μM的胸腺嘧啶、浓度为0.9～1.0μM的胞嘧啶和pH＝7.0～7.4、浓度为0.1～0.2M的PBS缓冲液混合制成。其它与具体实施方式一至四十四之一相同。
通过以下实施例验证本发明的有益效果：
实施例1
本实施例的一种使用制备的电化学传感器对DNA碱基同时检测的方法，按以下步骤进行：
步骤一：将利用Hummer方法得到的氧化石墨烯粉末，于双蒸水中超声分散15min，得0.5mg/mL的氧化石墨烯水悬浊液；将溴甲酚紫于0.01MNaNO3溶液中分散，得到1.0×10-3～2.0×10-3M的溴甲酚紫混合溶液；
其中，所用溴甲酚紫属于分析纯；
步骤二：用微量移液器吸取5μL氧化石墨烯悬浊液，滴涂到氧化石墨烯表面，置于红外灯下干燥，干燥后冷却至室温，得到氧化石墨烯修饰的玻碳电极；将氧化石墨烯修饰的玻碳电极置于pH＝5的PBS溶液中进行恒电位还原，还原电位为-1.5V，还原时间为720s，即得石墨烯修饰电极，室温晾干；
其中，红外灯照射时间根据玻碳电极表面石墨烯薄膜完全干燥确定；
步骤三：将步骤二中制得的石墨烯修饰电极置于溴甲酚紫溶液中进行循环伏安扫描，电位-1.0～+1.5V，扫描速率100mVs-1，循环次数15圈，即得溴甲酚紫/石墨烯复合修饰电极；
步骤四：用步骤三制备的溴甲酚紫/石墨烯复合修饰电极检测四种碱基混合溶液的电化学信号，确定四种碱基电化学信号所在的峰位；其中，溴甲酚紫/石墨烯复合修饰电极工作条件为温度25℃、脉冲高度0.05V，脉冲宽度0.05s，电位增量0.01V；所述的四种碱基混合溶液由浓度为0.20～200.0μM的鸟嘌呤、浓度为0.20～220.0μM的腺嘌呤、浓度为2.0～700.0μM的胸腺嘧啶、浓度为2.50～650.0μM的胞嘧啶和pH＝7.4、浓度为0.1～0.2M的PBS缓冲液混合后制成；
其中，鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶购自百灵威科技有限公司；
步骤五：对待测定的四种碱基混合液采用骤三制备的溴甲酚紫/石墨烯复合修饰电极进行电化学检测，得到鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶随浓度变化的差分脉冲伏安图；然后分别以碱基浓度为横坐标，以电化学检测的电流信号为纵坐标，建立四种DNA碱基电化学信号变化规律图；其中，溴甲酚紫/石墨烯复合修饰电极工作条件为温度25℃、脉冲高度0.05V，脉冲宽度0.05s，电位增量0.01V；所述的待测定的四种碱基混合溶液由浓度为0.20～200.0μM的鸟嘌呤、浓度为0.20～220.0μM的腺嘌呤、浓度为2.0～700.0μM的胸腺嘧啶、浓度为2.50～650.0μM的胞嘧啶和pH＝7.4、浓度为0.1～0.2M的PBS缓冲液混合后制成。
本实施例得到的4种DNA碱基随浓度变化的差分脉冲伏安图如图2、4、6、8所示，鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶同时随浓度变化的差分脉冲伏安图如图2、4、6、8所示，其中，图3、5、7、9是将图2、4、6、8的数据参数转化为浓度-电化学信号得到的变化规律图；图10为为鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶同时随浓度变化的差分脉冲伏安图。
由图1至图10可知，本实施例提出的电化学传感器，以DNA碱基含量为检测指标，可同时观察到鸟嘌呤(0.66V左右)、腺嘌呤(0.92V左右)、胸腺嘧啶(1.12V左右)及胞嘧啶(1.29V左右)四个电化学信号的变化，实现对四种DNA碱基的定量检测。该电化学传感器对腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶及胞嘧啶的线性检测范围分别为0.20-220.0μM，0.20-200.0μM，2.0-700.0μM，2.50-650.0μM，最低检出限分别可达0.05μM，0.06μM，0.3μM及0.9μM。
本实施例提出的一种DNA碱基同时检测的电化学传感器通过检测电化学信号来指示DNA碱基的变化情况，是一种简单、快速、灵敏、快速的新型传感器，而且不需要添加任何荧光或放射性标记物，操作非常安全。
实施例2
本实施例的一种使用制备的电化学传感器对DNA碱基同时检测的方法，按以下步骤进行：
步骤一：将利用Hummer方法得到的氧化石墨烯粉末，于双蒸水中超声分散15min，得0.5mg/mL的氧化石墨烯水悬浊液；将溴甲酚紫于0.01MNaNO3溶液中分散，得到1.0×10-3～2.0×10-3M的溴甲酚紫混合溶液；
其中，所用溴甲酚紫属于分析纯；
步骤二：用微量移液器吸取6μL氧化石墨烯悬浊液，滴涂到氧化石墨烯表面，置于红外灯下干燥，干燥后冷却至室温，得到氧化石墨烯修饰的玻碳电极；将氧化石墨烯修饰的玻碳电极置于pH＝5的PBS溶液中进行恒电位还原，还原电位为-1.5V，还原时间为720s，即得石墨烯修饰电极，室温晾干；
其中，红外灯照射时间根据玻碳电极表面石墨烯薄膜完全干燥确定；
步骤三：将步骤二中制得的石墨烯修饰电极置于溴甲酚紫溶液中进行循环伏安扫描，电位-1.0～+1.5V，扫描速率100mVs-1，循环次数15圈，即得溴甲酚紫/石墨烯复合修饰电极；
步骤四：用步骤三制备的溴甲酚紫/石墨烯复合修饰电极检测四种碱基混合溶液的电化学信号，确定四种碱基电化学信号所在的峰位；其中，溴甲酚紫/石墨烯复合修饰电极工作条件为温度25℃、脉冲高度0.05V，脉冲宽度0.05s，电位增量0.01V；所述的四种碱基混合溶液由浓度为0.20～200.0μM的鸟嘌呤、浓度为0.20～220.0μM的腺嘌呤、浓度为2.0～700.0μM的胸腺嘧啶、浓度为2.50～650.0μM的胞嘧啶和pH＝7.4、浓度为0.1～0.2M的PBS缓冲液混合后制成；
其中，鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶购自百灵威科技有限公司；
步骤五：对待测定的四种碱基混合液采用骤三制备的溴甲酚紫/石墨烯复合修饰电极进行电化学检测，得到鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶随浓度变化的差分脉冲伏安图；然后分别以碱基浓度为横坐标，以电化学检测的电流信号为纵坐标，建立四种DNA碱基电化学信号变化规律图；其中，溴甲酚紫/石墨烯复合修饰电极工作条件为温度25℃、脉冲高度0.05V，脉冲宽度0.05s，电位增量0.01V；所述的四种碱基混合溶液由浓度为0.20～200.0μM的鸟嘌呤、浓度为0.20～220.0μM的腺嘌呤、浓度为2.0～700.0μM的胸腺嘧啶、浓度为2.50～650.0μM的胞嘧啶和pH＝7.4、浓度为0.1～0.2M的PBS缓冲液混合后制成。
本实施例提出的电化学传感器，以DNA碱基含量为检测指标，可同时观察到鸟嘌呤(0.66V左右)、腺嘌呤(0.92V左右)、胸腺嘧啶(1.12V左右)及胞嘧啶(1.29V左右)四个电化学信号的变化，实现对四种DNA碱基的定量检测。该电化学传感器对腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶及胞嘧啶的线性检测范围分别为0.20-220.0μM，0.20-200.0μM，2.0-700.0μM，2.50-650.0μM，最低检出限分别可达0.05μM，0.06μM，0.3μM及0.9μM。
本实施例提出的一种DNA碱基同时检测的电化学传感器通过检测电化学信号来指示DNA碱基的变化情况，是一种简单、快速、灵敏、快速的新型传感器，而且不需要添加任何荧光或放射性标记物，操作非常安全。
实施例3
本实施例的一种使用制备的电化学传感器对DNA碱基同时检测的方法，按以下步骤进行：
步骤一：将利用Hummer方法得到的氧化石墨烯粉末，于双蒸水中超声分散15min，得0.5mg/mL的氧化石墨烯水悬浊液；将溴甲酚紫于0.01MNaNO3溶液中分散，得到1.0×10-3～2.0×10-3M的溴甲酚紫混合溶液；
其中，所用溴甲酚紫属于分析纯；
步骤二：用微量移液器吸取5μL氧化石墨烯悬浊液，滴涂到氧化石墨烯表面，置于红外灯下干燥，干燥后冷却至室温，得到氧化石墨烯修饰的玻碳电极；将氧化石墨烯修饰的玻碳电极置于pH＝5的PBS溶液中进行恒电位还原，还原电位为-1.5V，还原时间为700s，即得石墨烯修饰电极，室温晾干；
其中，红外灯照射时间根据玻碳电极表面石墨烯薄膜完全干燥确定；
步骤三：将步骤二中制得的石墨烯修饰电极置于溴甲酚紫溶液中进行循环伏安扫描，电位-1.0～+1.5V，扫描速率100mVs-1，循环次数15圈，即得溴甲酚紫/石墨烯复合修饰电极；
步骤四：用步骤三制备的溴甲酚紫/石墨烯复合修饰电极检测四种碱基混合溶液的电化学信号，确定四种碱基电化学信号所在的峰位；其中，溴甲酚紫/石墨烯复合修饰电极工作条件为温度25℃、脉冲高度0.05V，脉冲宽度0.05s，电位增量0.01V；所述的四种碱基混合溶液由浓度为0.20～200.0μM的鸟嘌呤、浓度为0.20～220.0μM的腺嘌呤、浓度为2.0～700.0μM的胸腺嘧啶、浓度为2.50～650.0μM的胞嘧啶和pH＝7.4、浓度为0.1～0.2M的PBS缓冲液混合后制成；
其中，鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶购自百灵威科技有限公司；
步骤五：对待测定的四种碱基混合液采用骤三制备的溴甲酚紫/石墨烯复合修饰电极进行电化学检测，得到鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶随浓度变化的差分脉冲伏安图；然后分别以碱基浓度为横坐标，以电化学检测的电流信号为纵坐标，建立四种DNA碱基电化学信号变化规律图；其中，溴甲酚紫/石墨烯复合修饰电极工作条件为温度25℃、脉冲高度0.05V，脉冲宽度0.05s，电位增量0.01V；所述的四种碱基混合溶液由浓度为0.20～200.0μM的鸟嘌呤、浓度为0.20～220.0μM的腺嘌呤、浓度为2.0～700.0μM的胸腺嘧啶、浓度为2.50～650.0μM的胞嘧啶和pH＝7.4、浓度为0.1～0.2M的PBS缓冲液混合后制成。
本实施例提出的电化学传感器，以DNA碱基含量为检测指标，可同时观察到鸟嘌呤(0.66V左右)、腺嘌呤(0.92V左右)、胸腺嘧啶(1.12V左右)及胞嘧啶(1.29V左右)四个电化学信号的变化，实现对四种DNA碱基的定量检测。该电化学传感器对腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶及胞嘧啶的线性检测范围分别为0.20-220.0μM，0.20-200.0μM，2.0-700.0μM，2.50-650.0μM，最低检出限分别可达0.05μM，0.06μM，0.3μM及0.9μM。
本实施例提出的一种DNA碱基同时检测的电化学传感器通过检测电化学信号来指示DNA碱基的变化情况，是一种简单、快速、灵敏、快速的新型传感器，而且不需要添加任何荧光或放射性标记物，操作非常安全。
实施例4
本实施例的一种使用制备的电化学传感器对DNA碱基同时检测的方法，按以下步骤进行：
步骤一：将利用Hummer方法得到的氧化石墨烯粉末，于双蒸水中超声分散15min，得0.5mg/mL的氧化石墨烯水悬浊液；将溴甲酚紫于0.01MNaNO3溶液中分散，得到1.0×10-3～2.0×10-3M的溴甲酚紫混合溶液；
其中，所用溴甲酚紫属于分析纯；
步骤二：用微量移液器吸取5μL氧化石墨烯悬浊液，滴涂到氧化石墨烯表面，置于红外灯下干燥，干燥后冷却至室温，得到氧化石墨烯修饰的玻碳电极；将氧化石墨烯修饰的玻碳电极置于pH＝5的PBS溶液中进行恒电位还原，还原电位为-1.5V，还原时间为720s，即得石墨烯修饰电极，室温晾干；
其中，红外灯照射时间根据玻碳电极表面石墨烯薄膜完全干燥确定；
步骤三：将步骤二中制得的石墨烯修饰电极置于溴甲酚紫溶液中进行循环伏安扫描，电位-1.0～+1.4V，扫描速率100mVs-1，循环次数15圈，即得溴甲酚紫/石墨烯复合修饰电极；
步骤四：用步骤三制备的溴甲酚紫/石墨烯复合修饰电极检测四种碱基混合溶液的电化学信号，确定四种碱基电化学信号所在的峰位；其中，溴甲酚紫/石墨烯复合修饰电极工作条件为温度25℃、脉冲高度0.05V，脉冲宽度0.05s，电位增量0.01V；所述的四种碱基混合溶液由浓度为0.20～200.0μM的鸟嘌呤、浓度为0.20～220.0μM的腺嘌呤、浓度为2.0～700.0μM的胸腺嘧啶、浓度为2.50～650.0μM的胞嘧啶和pH＝7.4、浓度为0.1～0.2M的PBS缓冲液混合后制成；
其中，鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶购自百灵威科技有限公司；
步骤五：对待测定的四种碱基混合液采用骤三制备的溴甲酚紫/石墨烯复合修饰电极进行电化学检测，得到鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶随浓度变化的差分脉冲伏安图；然后分别以碱基浓度为横坐标，以电化学检测的电流信号为纵坐标，建立四种DNA碱基电化学信号变化规律图；其中，溴甲酚紫/石墨烯复合修饰电极工作条件为温度25℃、脉冲高度0.05V，脉冲宽度0.05s，电位增量0.01V；所述的四种碱基混合溶液由浓度为0.20～200.0μM的鸟嘌呤、浓度为0.20～220.0μM的腺嘌呤、浓度为2.0～700.0μM的胸腺嘧啶、浓度为2.50～650.0μM的胞嘧啶和pH＝7.4、浓度为0.1～0.2M的PBS缓冲液混合后制成。
本实施例提出的电化学传感器，以DNA碱基含量为检测指标，可同时观察到鸟嘌呤(0.66V左右)、腺嘌呤(0.92V左右)、胸腺嘧啶(1.12V左右)及胞嘧啶(1.29V左右)四个电化学信号的变化，实现对四种DNA碱基的定量检测。该电化学传感器对腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶及胞嘧啶的线性检测范围分别为0.20-220.0μM，0.20-200.0μM，2.0-700.0μM，2.50-650.0μM，最低检出限分别可达0.05μM，0.06μM，0.3μM及0.9μM。
本实施例提出的一种DNA碱基同时检测的电化学传感器通过检测电化学信号来指示DNA碱基的变化情况，是一种简单、快速、灵敏、快速的新型传感器，而且不需要添加任何荧光或放射性标记物，操作非常安全。
实施例5
本实施例的一种使用制备的电化学传感器对DNA碱基同时检测的方法，按以下步骤进行：
步骤一：将利用Hummer方法得到的氧化石墨烯粉末，于双蒸水中超声分散15min，得0.5mg/mL的氧化石墨烯水悬浊液；将溴甲酚紫于0.01MNaNO3溶液中分散，得到1.0×10-3～2.0×10-3M的溴甲酚紫混合溶液；
其中，所用溴甲酚紫属于分析纯；
步骤二：用微量移液器吸取5μL氧化石墨烯悬浊液，滴涂到氧化石墨烯表面，置于红外灯下干燥，干燥后冷却至室温，得到氧化石墨烯修饰的玻碳电极；将氧化石墨烯修饰的玻碳电极置于pH＝5的PBS溶液中进行恒电位还原，还原电位为-1.5V，还原时间为720s，即得石墨烯修饰电极，室温晾干；
其中，红外灯照射时间根据玻碳电极表面石墨烯薄膜完全干燥确定；
步骤三：将步骤二中制得的石墨烯修饰电极置于溴甲酚紫溶液中进行循环伏安扫描，电位-1.0～+1.5V，扫描速率100mVs-1，循环次数14圈，即得溴甲酚紫/石墨烯复合修饰电极；
步骤四：用步骤三制备的溴甲酚紫/石墨烯复合修饰电极检测四种碱基混合溶液的电化学信号，确定四种碱基电化学信号所在的峰位；其中，溴甲酚紫/石墨烯复合修饰电极工作条件为温度25℃、脉冲高度0.05V，脉冲宽度0.05s，电位增量0.01V；所述的四种碱基混合溶液由浓度为0.20～200.0μM的鸟嘌呤、浓度为0.20～220.0μM的腺嘌呤、浓度为2.0～700.0μM的胸腺嘧啶、浓度为2.50～650.0μM的胞嘧啶和pH＝7.4、浓度为0.1～0.2M的PBS缓冲液混合后制成；
其中，鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶购自百灵威科技有限公司；
步骤五：对待测定的四种碱基混合液采用骤三制备的溴甲酚紫/石墨烯复合修饰电极进行电化学检测，得到鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶随浓度变化的差分脉冲伏安图；然后分别以碱基浓度为横坐标，以电化学检测的电流信号为纵坐标，建立四种DNA碱基电化学信号变化规律图；其中，溴甲酚紫/石墨烯复合修饰电极工作条件为温度25℃、脉冲高度0.05V，脉冲宽度0.05s，电位增量0.01V；所述的四种碱基混合溶液由浓度为0.20～200.0μM的鸟嘌呤、浓度为0.20～220.0μM的腺嘌呤、浓度为2.0～700.0μM的胸腺嘧啶、浓度为2.50～650.0μM的胞嘧啶和pH＝7.4、浓度为0.1～0.2M的PBS缓冲液混合后制成。
本实施例提出的电化学传感器，以DNA碱基含量为检测指标，可同时观察到鸟嘌呤(0.66V左右)、腺嘌呤(0.92V左右)、胸腺嘧啶(1.12V左右)及胞嘧啶(1.29V左右)四个电化学信号的变化，实现对四种DNA碱基的定量检测。该电化学传感器对腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶及胞嘧啶的线性检测范围分别为0.20-220.0μM，0.20-200.0μM，2.0-700.0μM，2.50-650.0μM，最低检出限分别可达0.05μM，0.06μM，0.3μM及0.9μM。
本实施例提出的一种DNA碱基同时检测的电化学传感器通过检测电化学信号来指示DNA碱基的变化情况，是一种简单、快速、灵敏、快速的新型传感器，而且不需要添加任何荧光或放射性标记物，操作非常安全。
需要指出的是，以上说明及优选实施例不可解释为限定本发明的设计思想。在本发明的技术领域里持有相同知识者可以将本发明的技术性思想以多样的形态改良变更，这样的改良及变更应理解为属于本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种使用制备的电化学传感器对DNA碱基同时检测的方法，其特征在于它是按以下步骤进行：
步骤一：将利用Hummer方法制备的氧化石墨烯粉末，于双蒸水中超声分散10～15min，得到浓度为0.2～0.5mg/mL的氧化石墨烯悬浊液；将溴甲酚紫于浓度为0.01M的NaNO3溶液中分散，得到浓度为1.0×10-3～2.0×10-3M的溴甲酚紫溶液；
步骤二：取5～10μL步骤一得到的氧化石墨烯悬浊液，滴涂到玻碳电极表面，置于红外灯下干燥，干燥后冷却至室温，得到氧化石墨烯修饰的玻碳电极；将氧化石墨烯修饰的玻碳电极置于pH＝5～7的PBS溶液中进行恒电位还原，还原电位为-1.0～-1.5V，还原时间为360～720s，即得石墨烯修饰电极，室温晾干待用；
步骤三：将步骤二中制得的石墨烯修饰电极置于步骤一得到的溴甲酚紫溶液中进行循环伏安扫描，其中，电位为-1.0～+1.5V，扫描速率为50～100mVs-1，循环次数为10～15圈，即得溴甲酚紫/石墨烯复合修饰电极；
步骤四：用步骤三制备的溴甲酚紫/石墨烯复合修饰电极检测四种碱基混合溶液的电化学信号，确定四种碱基电化学信号所在的峰位；其中，所述的溴甲酚紫/石墨烯复合修饰电极检测的工作条件如下：温度为22～25℃、脉冲高度为0.01～0.1V，脉冲宽度为0.01～0.1s，电位增量为0.005～0.015V；所述的四种碱基混合溶液由浓度为0.20～200.0μM的鸟嘌呤、浓度为0.20～220.0μM的腺嘌呤、浓度为2.0～700.0μM的胸腺嘧啶、浓度为2.50～650.0μM的胞嘧啶和pH＝7.0～7.4、浓度为0.1～0.2M的PBS缓冲液制成；
步骤五：对待测的四种碱基混合液采用进行步骤三制备的溴甲酚紫/石墨烯复合修饰电极进行电化学检测，得到鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶随浓度变化的差分脉冲伏安图；然后分别以碱基浓度为横坐标，以电化学检测的电流信号为纵坐标，建立四种DNA碱基电化学信号变化规律图；其中，所述的溴甲酚紫/石墨烯复合修饰电极检测的工作条件如下：温度为22～25℃、脉冲高度为0.01～0.1V，脉冲宽度为0.01～0.1s，电位增量为0.005～0.015V；所述的待测定的四种碱基混合溶液由浓度为0.20～200.0μM的鸟嘌呤、浓度为0.20～220.0μM的腺嘌呤、浓度为2.0～700.0μM的胸腺嘧啶、浓度为2.50～650.0μM的胞嘧啶和pH＝7.0～7.4、浓度为0.1～0.2M的PBS缓冲液制成。
2.根据权利要求1所述的一种使用制备的电化学传感器对DNA碱基同时检测的方法，其特征在于步骤一中所述的氧化石墨烯悬浊液浓度为0.5mg/mL。
3.根据权利要求1所述的一种使用制备的电化学传感器对DNA碱基同时检测的方法，其特征在于步骤一中所述的溴甲酚紫溶液浓度为2.0×10-3M。
4.根据权利要求1所述的一种使用制备的电化学传感器对DNA碱基同时检测的方法，其特征在于步骤二中所述的取5μL步骤一得到的氧化石墨烯悬浊液，滴涂到玻碳电极表面。
5.根据权利要求1所述的一种使用制备的电化学传感器对DNA碱基同时检测的方法，其特征在于步骤二中所述的氧化石墨烯的还原电位为-1.5V。
6.根据权利要求1所述的一种使用制备的电化学传感器对DNA碱基同时检测的方法，其特征在于步骤二中所述的氧化石墨烯的还原时间为720s。
7.根据权利要求1所述的一种使用制备的电化学传感器对DNA碱基同时检测的方法，其特征在于步骤三中所述的进行循环伏安扫描时所用的扫描速率为100mVs-1。
8.根据权利要求1所述的一种使用制备的电化学传感器对DNA碱基同时检测的方法，其特征在于步骤三中所述的进行循环伏安扫描的循环次数为15圈。
9.根据权利要求1所述的一种使用制备的电化学传感器对DNA碱基同时检测的方法，其特征在于步骤四中所述的PBS缓冲液pH＝7.4。
10.根据权利要求1所述的一种使用制备的电化学传感器对DNA碱基同时检测的方法，其特征在于步骤五中所述的所述的四种碱基混合溶液由浓度为0.20～50.0μM的鸟嘌呤、浓度为0.20～50.0μM的腺嘌呤、浓度为2.0～200.0μM的胸腺嘧啶、浓度为2.50～100.0μM的胞嘧啶和pH＝7.2～7.4、浓度为0.1～0.2M的PBS缓冲液制成。
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