CN103757114A - 利用核糖体dna序列构建核苷酸分子式鉴定植物品种的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鉴定植物品种的方法。本发明提供了鉴定紫薇品种的方法，包括如下步骤：1）以待测紫薇的基因组DNA为模板，用由序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；2）将所述PCR产物测序，根据测序结果列出所述待测紫薇的核苷酸分子式；3）将步骤2）所得的核苷酸分子式与对应的若干个紫薇品种的核苷酸分子式进行比对，从而确定所述待测紫薇的品种。实验证明，该方法精确、操作简捷，可以提高相关产业的生产效率和质量监控水平，有效弥补以往方法的不足；另外，该方法同时实现了非花期（如苗期）的鉴定。本方法对于促进紫薇的新品种选育、紫薇花木产业和城市园林绿化的发展以及环境保护具有重要意义。

Description

利用核糖体DNA序列构建核苷酸分子式鉴定植物品种的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种鉴定或辅助鉴定植物品种的方法，特别涉及一种利用核糖体DNA序列构建核苷酸分子式鉴定植物品种的方法。
背景技术
植物品种是指经过人工选育而形成的种性基本一致、遗传性比较稳定、具有人类需要的某些经济性状：如观赏性状、药用性状或其它经济性状，作为特殊生产资料用的栽培植物群体。如牡丹品种、核桃品种、苹果品种、紫薇品种等。
植物品种一般利用表型性状进行鉴定和识别。但是，植物品种在特征表现上存在季节差异，在有的季节可能表现不出品种间有差异的性状。例如，紫薇品种通常按照花型、花色和花期进行分类，花期以外的时间存在品种鉴定难的问题。
品种的准确鉴定和纯度分析一直是经济植物和资源植物（如花卉）产业发展上的重要课题。在规模化生产领域，以某种具体植物品种为生产资料和/或产品进行大规模生产的企业等，需要借助灵敏度高的DNA分子分形检测技术进行精确鉴定和分析。
紫薇是千屈菜科Lythraceae紫薇属Lagerstroemia L.的灌木或乔木。紫薇属植物在全球共有约55种，分布于亚洲东部、东南部和南部的热带、亚热带地区、新几内亚岛、菲律宾以及澳大利亚等地，具有较宽的生态适应性。中国目前原生的紫薇属植物有19种，引入栽培4种，一共23种。紫薇具有吸收SO2等工业污染气体、降尘及消除雾霾等生态作用，是重要环保树种、资源植物和城市绿化花木。人工杂交和选育优良特用紫薇品种是重要研究方向之一。紫薇是炎热夏季花期最长的重要观赏花木之一，在中国已报道有100多个紫薇园艺栽培品种。然而，由于品种资源缺乏整理，限制了紫薇品种的生产、推广和育种。传统紫薇品种的来源记载不详、存在同物异名和异物同名现象等，导致了市场的不规范，影响了紫薇花木的正常交易和相关产业经济规模的增长。形态标记和DNA分子标记的不足以及缺乏可靠的鉴定技术体系严重制约着紫薇种质资源的遗传评价、保护与利用。为了适应国内和国际市场需求，迫切需要品种鉴定的标准化、规范化和科学化。
在细胞核基因组内，核糖体DNA是编码核糖体RNA的基因。核基因组核糖体DNA内转录间隔区（nuclear ribosomal internal transcribed spacer，简称nrITS）是指生物的细胞核基因组上编码核糖体小亚基的18S rRNA基因和编码核糖体大亚基的26SrRNA基因之间的间隔区。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测紫薇品种的方法。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定待测紫薇品种的方法，是利用核糖体DNA序列中一段含有细胞核ITS区和部分26S rRNA基因区域的变异位点构建核苷酸分子式进而鉴定或辅助鉴定待测紫薇品种的方法，具体包括如下步骤：
（1）以待测紫薇的基因组DNA为模板，用由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；
（2）将所述PCR产物测序，根据测序结果列出所述待测紫薇的核苷酸分子式；
所述待测紫薇的核苷酸分子式的通式为：
B15B16B99B102B339B346B467；
在所述通式中，所述B15、所述B16、所述B99、所述B102、所述B339、所述B346和所述B467，依次表示在所述PCR产物的核苷酸序列中，将所述PCR产物的核苷酸序列自5’端的第126个碱基记为第1个碱基，沿着所述PCR产物的核苷酸序列向3’端方向顺次计数的第15、16、99、102、339、346和467个碱基；
在所述通式中，每一个B为A、T、C和G四种碱基中的一种或两种的叠加；
（3）将步骤（2）所得所述待测紫薇的核苷酸分子式与核苷酸分子式组I进行比对；
所述核苷酸分子式组I由如下a1）-a10）共10种核苷酸分子式组成：
a1）G15C16T99T102T339A346G467；
a2）G15C16Y99T102Y339A346G467；
a3）G15C16Y99Y102Y339A346K467；
a4）G15C16Y99T102Y339R346G467；
a5）R15S16Y99W102Y339R346G467；
a6）R15S16T99W102Y339R346G467；
a7）G15C16T99W102Y339R346G467；
a8）G15C16T99Y102Y339R346G467；
a9）R15S16T99Y102Y339R346G467；
a10）R15S16T99T102Y339R346G467；
在a1）-a10）中，Y表示碱基T和C；K表示G和T；W表示碱基A和T；S表示C和G；R表示碱基A和G；
（4）根据步骤（3）的比对结果，按照如下方法对所述待测紫薇进行品种鉴定：
若所述待测紫薇的核苷酸分子式为a1）所示的核苷酸分子式，则所述待测紫薇为或候选为紫薇品种‘红环直枝紫’；
若所述待测紫薇的核苷酸分子式为a2）所示的核苷酸分子式，则所述待测紫薇为或候选为紫薇品种‘绿爪红蝶’；
若所述待测紫薇的核苷酸分子式为a3）所示的核苷酸分子式，则所述待测紫薇为或候选为紫薇品种‘白密香’；
若所述待测紫薇的核苷酸分子式为a4）所示的核苷酸分子式，则所述待测紫薇为或候选为紫薇品种‘黄药粉晶’；
若所述待测紫薇的核苷酸分子式为a5）所示的核苷酸分子式，则所述待测紫薇为或候选为紫薇品种‘皱瓣堇薇’；
若所述待测紫薇的核苷酸分子式为a6）所示的核苷酸分子式，则所述待测紫薇为或候选为紫薇品种‘建民红’；
若所述待测紫薇的核苷酸分子式为a7）所示的核苷酸分子式，则所述待测紫薇为或候选为紫薇品种‘直萼红爪粉’；
若所述待测紫薇的核苷酸分子式为a8）所示的核苷酸分子式，则所述待测紫薇为或候选为紫薇品种‘宝庆紫’；
若所述待测紫薇的核苷酸分子式为a9）所示的核苷酸分子式，则所述待测紫薇为或候选为紫薇品种‘长爪珊瑚堇薇’；
若所述待测紫薇的核苷酸分子式为a10）所示的核苷酸分子式，则所述待测紫薇为或候选为紫薇品种‘大花翠盘堇薇’。
进一步，以上本发明所提供的鉴定或辅助鉴定待测紫薇品种的方法，其操作步骤可转化为如下：
（1）以待测紫薇的基因组DNA为模板，用由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；
（2）将所述PCR产物测序，将测序结果与核苷酸序列组I进行比对；
所述核苷酸序列组I由序列表中序列3-12共10个序列组成；
（3）根据步骤（2）的比对结果，按照如下方法对所述待测紫薇进行鉴定：
若所述PCR产物的核苷酸序列中含有序列3，则所述待测紫薇为或候选为紫薇品种‘红环直枝紫’；
若所述PCR产物的核苷酸序列中含有序列4，则所述待测紫薇为或候选为紫薇品种‘绿爪红蝶’；
若所述PCR产物的核苷酸序列中含有序列5，则所述待测紫薇为或候选为紫薇品种‘白密香’；
若所述PCR产物的核苷酸序列中含有序列6，则所述待测紫薇为或候选为紫薇品种‘黄药粉晶’；
若所述PCR产物的核苷酸序列中含有序列7，则所述待测紫薇为或候选为紫薇品种‘皱瓣堇薇’；
若所述PCR产物的核苷酸序列中含有序列8，则所述待测紫薇为或候选为紫薇品种‘建民红’；
若所述PCR产物的核苷酸序列中含有序列9，则所述待测紫薇为或候选为紫薇品种‘直萼红爪粉’；
若所述PCR产物的核苷酸序列中含有序列10，则所述待测紫薇为或候选为紫薇品种‘宝庆紫’；
若所述PCR产物的核苷酸序列中含有序列11，则所述待测紫薇为或候选为紫薇品种‘长爪珊瑚堇薇’；
若所述PCR产物的核苷酸序列中含有序列12，则所述待测紫薇为或候选为紫薇品种‘大花翠盘堇薇’。
在上述方法中，所述待测紫薇可为如下10个品种中的任一种：‘红环直枝紫’、‘绿爪红蝶’、‘白密香’、‘黄药粉晶’、‘皱瓣堇薇’、‘建民红’、‘直萼红爪粉’、‘宝庆紫’、‘长爪珊瑚堇薇’和‘大花翠盘堇薇’。
本发明的另一个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定待测紫薇品种的试剂盒。
所述用于鉴定或辅助鉴定待测紫薇品种的试剂盒，具体可包括引物对、记载有核苷酸分子式组I的对比卡；
所述引物对由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成；
所述核苷酸分子式组I由如下a1）-a10）共10种核苷酸分子式组成：
a1）G15C16T99T102T339A346G467；
a2）G15C16Y99T102Y339A346G467；
a3）G15C16Y99Y102Y339A346K467；
a4）G15C16Y99T102Y339R346G467；
a5）R15S16Y99W102Y339R346G467；
a6）R15S16T99W102Y339R346G467；
a7）G15C16T99W102Y339R346G467；
a8）G15C16T99Y102Y339R346G467；
a9）R15S16T99Y102Y339R346G467；
a10）R15S16T99T102Y339R346G467；
在a1）-a10）中，Y表示碱基T和C；K表示G和T；W表示碱基A和T；S表示C和G；R表示碱基A和G；
所述待测紫薇具体可为如下10个品种中的任一种：‘红环直枝紫’、‘绿爪红蝶’、‘白密香’、‘黄药粉晶’、‘皱瓣堇薇’、‘建民红’、‘直萼红爪粉’、‘宝庆紫’、‘长爪珊瑚堇薇’和‘大花翠盘堇薇’。
所述试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测紫薇品种中的应用也属于本发明的保护范围。
在所述应用中，所述待测紫薇具体可为如下10个品种中的任一种：‘红环直枝紫’、‘绿爪红蝶’、‘白密香’、‘黄药粉晶’、‘皱瓣堇薇’、‘建民红’、‘直萼红爪粉’、‘宝庆紫’、‘长爪珊瑚堇薇’和‘大花翠盘堇薇’。
本发明的再一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测植物品种的方法。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定待测植物品种的方法，具体可包括如下步骤：
（1）通过比对多个植物品种的细胞核核糖体DNA序列，选取所述多个植物品种的细胞核核糖体DNA序列中存在多态碱基的区域作为目的DNA区域；
（2）利用所述目的DNA区域两侧保守区域的序列，设计能够扩增所述目的DNA区域的引物；
（3）用所述引物对所述多个植物品种中的每个品种的基因组DNA分别进行PCR扩增，得到每个所述植物品种的目的DNA区域；
（4）对每个所述植物品种的目的DNA区域进行测序，得到每个所述植物品种的目的DNA区域的核苷酸序列；
（5）比较所述多个植物品种的目的DNA区域的核苷酸序列，获得序列比对矩阵（alignment），确定多态碱基位点，列出每个品种的核苷酸分子式；所述每个品种的核苷酸分子式由每个品种的目的DNA区域的核苷酸序列从5’末端到3’末端或从3’末端到5’末端依次列出所有的多态碱基位点核苷酸字母及其位置顺序编号组成；所述每个品种的核苷酸分子式通式为Bx1Bx2Bx3……Bxn，通式中，B为多态碱基位点上的碱基种类，为A、T、C和G四种碱基中的一种或两种的叠加；x1为第1个多态碱基位点在所述目的DNA区域的核苷酸序列从5’末端或3’末端起的位置编号，x2为第2个多态碱基位点在所述目的DNA区域的核苷酸序列从5’末端或3’末端起的位置编号，x3为第3个多态碱基位点在所述目的DNA区域的核苷酸序列从5’末端或3’末端起的位置编号，类推，xn为第n个多态碱基位点在所述目的DNA区域的核苷酸序列从5’末端或3’末端起的位置编号；
所述Bx1Bx2Bx3……Bxn为将所有的多态碱基位点按照在所述目的DNA区域的核苷酸序列中从5’末端或3’末端起依次列出；
（6）将具有相同所述核苷酸分子式的品种组成一个谱系，具有不同核苷酸分子式的品种组成不同的谱系，所有谱系构成核苷酸分子式谱系表；
所述核苷酸分子式谱系表中，每一种核苷酸分子式对应来自一个谱系的植物品种；
（7）将待测植物按照步骤（3）-（5）重复操作，用所述待测植物替代步骤（3）-（5）中的植物品种，得到所述待测植物的目的DNA区域的核苷酸分子式；将所述待测植物的目的DNA区域的核苷酸分子式与所述核苷酸分子式谱系表中的所有核苷酸分子式进行比对，按照如下方法确定所述待测植物的品种名称及其隶属的谱系：若所述待测植物的目的DNA区域的核苷酸分子式与所述核苷酸分子式谱系表中的一个核苷酸分子式相同，则所述待测植物品种为或候选为所述一个核苷酸分子式对应的所述谱系中的任意一个品种。
在本发明中，所述植物为紫薇。
在所述方法中，所述目的DNA区域为细胞核核糖体DNA序列的一部分，可为包括细胞核ITS区和部分26S rRNA基因的区域。
在本发明中，步骤（2）中，所述引物具体为由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对；所述目的DNA区域具体来自于采用所述引物对对所述植物的基因组DNA进行PCR扩增所得的PCR产物。
进一步，所述多个植物品种及其对应的所述目的DNA区域为如下：
所述植物品种为如下10个紫薇品种：‘红环直枝紫’、‘绿爪红蝶’、‘白密香’、‘黄药粉晶’、‘皱瓣堇薇’、‘建民红’、‘直萼红爪粉’、‘宝庆紫’、‘长爪珊瑚堇薇’和‘大花翠盘堇薇’；
所述紫薇品种‘红环直枝紫’的所述DNA区域的核苷酸序列为序列表中序列3；
所述紫薇品种‘绿爪红蝶’的所述DNA区域的核苷酸序列为序列表中序列4；
所述紫薇品种‘白密香’的所述DNA区域的核苷酸序列为序列表中序列5；
所述紫薇品种‘黄药粉晶’的所述DNA区域的核苷酸序列为序列表中序列6；
所述紫薇品种‘皱瓣堇薇’的所述DNA区域的核苷酸序列为序列表中序列7；
所述紫薇品种‘建民红’的所述DNA区域的核苷酸序列为序列表中序列8；
所述紫薇品种‘直萼红爪粉’的所述DNA区域的核苷酸序列为序列表中序列9；
所述紫薇品种‘宝庆紫’的所述DNA区域的核苷酸序列为序列表中序列10；
所述紫薇品种‘长爪珊瑚堇薇’的所述DNA区域的核苷酸序列为序列表中序列11；
所述紫薇品种‘大花翠盘堇薇’的所述DNA区域的核苷酸序列为序列表中序列12。
更加具体的，所述紫薇品种‘红环直枝紫’的所述DNA区域的核苷酸分子式具体为G15C16T99T102T339A346G467；
所述紫薇品种‘绿爪红蝶’的所述DNA区域的核苷酸分子式具体为G15C16Y99T102Y339A346G467；
所述紫薇品种‘白密香’的所述DNA区域的核苷酸分子式具体为G15C16Y99Y102Y339A346K467；
所述紫薇品种‘黄药粉晶’的所述DNA区域的核苷酸分子式具体为G15C16Y99T102Y339R346G467；
所述紫薇品种‘皱瓣堇薇’的所述DNA区域的核苷酸分子式具体为R15S16Y99W102Y339R346G467；
所述紫薇品种‘建民红’的所述DNA区域的核苷酸分子式具体为R15S16T99W102Y339R346G467；
所述紫薇品种‘直萼红爪粉’的所述DNA区域的核苷酸分子式具体为G15C16T99W102Y339R346G467；
所述紫薇品种‘宝庆紫’的所述DNA区域的核苷酸分子式具体为G15C16T99Y102Y339R346G467；
所述紫薇品种‘长爪珊瑚堇薇’的所述DNA区域的核苷酸分子式具体为R15S16T99Y102Y339R346G467；
所述紫薇品种‘大花翠盘堇薇’的所述DNA区域的核苷酸分子式具体为R15S16T99T102Y339R346G467。
本发明利用细胞核核糖体DNA序列中一段含有ITS区和部分26S rRNA基因的DNA序列，以核苷酸分子式的形式对植物品种进行鉴定。实验证明，本发明所提供的利用该分子式鉴定植物（如紫薇）品种的方法较为精确、操作简捷，可以提高相关产业的生产效率和质量监控水平，有效弥补以往方法的不足；另外，该方法同时实现了非花期（如苗期）的精准鉴定。本方法对于促进紫薇的新品种选育、紫薇花木产业和城市园林绿化的发展以及环境保护具有重要意义。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
紫薇（Lagerstroemia indica L.）品种‘红环直枝紫’、‘绿爪红蝶’、‘白密香’、‘黄药粉晶’、‘皱瓣堇薇’、‘建民红’、‘直萼红爪粉’、‘宝庆紫’、‘长爪珊瑚堇薇’和‘大花翠盘堇薇’的幼叶采自湖南省邵阳市紫薇花木研究所的紫薇品种资源圃和北京植物园展览区的紫薇园。南紫薇（Lagerstroemia subcostata Koehne）的幼叶采集自上海植物园，挂着“古树名木”牌子，并附有拉丁学名。
实施例1、紫薇品种的核苷酸分子式鉴定方法的建立及应用
为了构建能够用于有效鉴定紫薇品种的核苷酸分子式，本发明的发明人从以下系列品种的紫薇中获得一段含有细胞核核糖体DNA内转录间隔区（ITS区）和部分26SrRNA基因的DNA序列，并对其中的多态性位点进行了统计分析。作为供试材料的紫薇品种共10种，具体如下：‘红环直枝紫’、‘绿爪红蝶’、‘白密香’、‘黄药粉晶’、‘皱瓣堇薇’、‘建民红’、‘直萼红爪粉’、‘宝庆紫’、‘长爪珊瑚堇薇’和‘大花翠盘堇薇’。
一、引物设计
根据细胞核核糖体DNA序列中一段含有ITS区和部分26S rRNA基因的区域的两端的保守区，设计如下引物：
正向引物（名称：zw_ITS_F）：5’-AACAAGGTTTCCGTAGGTG-3’（序列1）；
反向引物（名称：zw_ITS_R）：5’-CTCGTGGTGCGACAGG-3’）（序列2）。
二、PCR扩增及产物的序列测定
以作为供试材料的10个紫薇品种的幼嫩叶片为实验材料，采用植物基因组DNA提取试剂盒（中国天根生物技术（北京）有限公司产品，其产品目录号为DP305）提取各样品材料的基因组DNA。以所得基因组DNA为模板，采用步骤一设计的引物对进行PCR扩增。结果显示，每个紫薇品种均可得到一条长度为907bp的PCR产物。
对纯化后的各PCR产物进行测序，获得一段含有若干多态碱基位点的约744bp的DNA序列（记为zw_ITS）。zw_ITS序列为所述PCR产物的核苷酸序列自5’端起的第126-869位。
结果显示，紫薇品种‘红环直枝紫’的zw_ITS序列为序列表中序列3；
紫薇品种‘绿爪红蝶’的zw_ITS序列为序列表中序列4；
紫薇品种‘白密香’的zw_ITS序列为序列表中序列5；
紫薇品种‘黄药粉晶’的zw_ITS序列为序列表中序列6；
紫薇品种‘皱瓣堇薇’的zw_ITS序列为序列表中序列7；
紫薇品种‘建民红’的zw_ITS序列为序列表中序列8；
紫薇品种‘直萼红爪粉’的zw_ITS序列为序列表中序列9；
紫薇品种‘宝庆紫’的zw_ITS序列为序列表中序列10；
紫薇品种‘长爪珊瑚堇薇’的zw_ITS序列为序列表中序列11；
紫薇品种‘大花翠盘堇薇’的zw_ITS序列为序列表中序列12。
三、序列比对
将步骤二所得的10个紫薇品种的zw_ITS序列进行比对，获得序列比对矩阵（alignment），进一步获得如表1所示的7个多态碱基位点。
表1  10个紫薇品种的ITS序列的7个多态碱基位点
Figure BDA0000458164660000091
注：Y表示碱基T和C；K表示G和T；W表示碱基A和T；S表示C和G；R表示碱基A和G。对于杂合型多态位点，在测序时会得到明显的叠加双峰，而单核苷酸型多态位点表现为单一峰。
四、用于紫薇品种鉴定的核苷酸分子式的构建
根据表1中所列的紫薇品种的每个多态碱基位点，列出相应的核苷酸分子式，具体如下：
紫薇品种‘红环直枝紫’的zw_ITS序列（序列3）自5’端起的第15、16、99、102、339、346及467位分别为G、C、T、T、T、A、G，根据这些核苷酸及其在zw_ITS序列中的位置（从5’端计起），列出核苷酸分子式通式为：G15C16T99T102T339A346G467。
紫薇品种‘绿爪红蝶’的zw_ITS序列（序列4）自5’端起的第15、16、99、102、339、346及467位分别为G、C、Y(=T+C)、T、Y(=T+C)、A、G，根据这些核苷酸及其在zw_ITS序列中的位置（从5’端计起），列出核苷酸分子式通式为：G15C16Y99T102Y339A346G467。
紫薇品种‘白密香’的zw_ITS序列（序列5）自5’端起的第15、16、99、102、339、346及467位分别为G、C、Y(=T+C)、Y(=T+C)、Y(=T+C)、A、K(=G+T)，根据这些核苷酸及其在zw_ITS序列中的位置（从5’端计起），列出核苷酸分子式通式为：G15C16Y99Y102Y339A346K467。
紫薇品种‘黄药粉晶’的zw_ITS序列（序列6）自5’端起的第15、16、99、102、339、346及467位分别为G、C、Y(=T+C)、T、Y(=T+C)、R(=A+G)、G，根据这些核苷酸及其在zw_ITS序列中的位置（从5’端计起），列出核苷酸分子式通式为：G15C16Y99T102Y339R346G467。
紫薇品种‘皱瓣堇薇’的zw_ITS序列（序列7）自5’端起的第15、16、99、102、339、346及467位分别为R(=A+G)、S(=C+G)、Y(=T+C)、W(=T+A)、Y(=T+C)、R(=A+G)、G，根据这些核苷酸及其在zw_ITS序列中的位置（从5’端计起），列出核苷酸分子式通式为：R15S16Y99W102Y339R346G467。
紫薇品种‘建民红’的zw_ITS序列（序列8）自5’端起的第15、16、99、102、339、346及467位分别为R(=A+G)、S(=C+G)、T、W(=T+A)、Y(=T+C)、R(=A+G)、G，根据这些核苷酸及其在zw_ITS序列中的位置（从5’端计起），列出核苷酸分子式通式为：R15S16T99W102Y339R346G467。
紫薇品种‘直萼红爪粉’的zw_ITS序列（序列9）自5’端起的第15、16、99、102、339、346及467位分别为G、C、T、W(=T+A)、Y(=T+C)、R(=A+G)、G，根据这些核苷酸及其在zw_ITS序列中的位置（从5’端计起），列出核苷酸分子式通式为：G15C16T99W102Y339R346G467。
紫薇品种‘宝庆紫’的zw_ITS序列（序列10）自5’端起的第15、16、99、102、339、346及467位分别为G、C、T、Y(=T+C)、Y(=T+C)、R(=A+G)、G，根据这些核苷酸及其在zw_ITS序列中的位置（从5’端计起），列出核苷酸分子式通式为：G15C16T99Y102Y339R346G467。
紫薇品种‘长爪珊瑚堇薇’的zw_ITS序列（序列11）自5’端起的第15、16、99、102、339、346及467位分别为R(=A+G)、S(=C+G)、T、Y(=T+C)、Y(=T+C)、R(=A+G)、G，根据这些核苷酸及其在zw_ITS序列中的位置（从5’端计起），列出核苷酸分子式通式为：R15S16T99Y102Y339R346G467。
紫薇品种‘大花翠盘堇薇’的zw_ITS序列（序列12）自5’端起的第15、16、99、102、339、346及467位分别为R(=A+G)、S(=C+G)、T、T、Y(=T+C)、R(=A+G)、G，根据这些核苷酸及其在zw_ITS序列中的位置（从5’端计起），列出核苷酸分子式通式为：R15S16T99T102Y339R346G467。
五、用核苷酸分子式鉴定紫薇品种
（1）以待测紫薇的基因组DNA为模板，用由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；
（2）将所述PCR产物测序，根据测序结果列出所述待测紫薇的核苷酸分子式；
所述待测紫薇的核苷酸分子式的通式为：
B15B16B99B102B339B346B467；
在所述通式中，所述B15、所述B16、所述B99、所述B102、所述B339、所述B346和所述B467，依次表示在所述PCR产物的核苷酸序列中，将所述PCR产物的核苷酸序列自5’端的第126个碱基记为第1个碱基，沿着所述PCR产物的核苷酸序列向3’端方向顺次计数的第15、16、99、102、339、346和467个碱基（对应zw_ITS序列的第15、16、99、102、339、346和467个碱基）；
在所述通式中，每一个B为A、T、C和G四种碱基中的一种或两种的叠加；
（3）按照如下方法对所述待测紫薇进行品种鉴定：
若所述待测紫薇的核苷酸分子式为G15C16T99T102T339A346G467，则所述待测紫薇为或候选为紫薇品种‘红环直枝紫’；
若所述待测紫薇的核苷酸分子式为G15C16Y99T102Y339A346G467，则所述待测紫薇为或候选为紫薇品种‘绿爪红蝶’；
若所述待测紫薇的核苷酸分子式为G15C16Y99Y102Y339A346K467，则所述待测紫薇为或候选为紫薇品种‘白密香’；
若所述待测紫薇的核苷酸分子式为G15C16Y99T102Y339R346G467，则所述待测紫薇为或候选为紫薇品种‘黄药粉晶’；
若所述待测紫薇的核苷酸分子式为R15S16Y99W102Y339R346G467，则所述待测紫薇为或候选为紫薇品种‘皱瓣堇薇’；
若所述待测紫薇的核苷酸分子式为R15S16T99W102Y339R346G467，则所述待测紫薇为或候选为紫薇品种‘建民红’；
若所述待测紫薇的核苷酸分子式为G15C16T99W102Y339R346G467，则所述待测紫薇为或候选为紫薇品种‘直萼红爪粉’；
若所述待测紫薇的核苷酸分子式为G15C16T99Y102Y339R346G467，则所述待测紫薇为或候选为紫薇品种‘宝庆紫’；
若所述待测紫薇的核苷酸分子式为R15S16T99Y102Y339R346G467，则所述待测紫薇为或候选为紫薇品种‘长爪珊瑚堇薇’；
若所述待测紫薇的核苷酸分子式为R15S16T99T102Y339R346G467，则所述待测紫薇为或候选为紫薇品种‘大花翠盘堇薇’。
六、紫薇品种分类鉴定的新检索表
根据步骤五所得各品种的核苷酸分子式，进一步结合品种形态特征，编制出10个紫薇品种的分类检索表，见表2。
表2  10个紫薇品种的分类检索表
Figure BDA0000458164660000121
注：Y表示碱基T和C；K表示G和T；W表示碱基A和T；S表示C和G；R表示碱基A和G。对于杂合型多态位点，在测序时会得到明显的叠加双峰，而单核苷酸型多态位点表现为单一峰。例如，‘大花翠盘堇薇’的分子式的全称应该是：细胞核核糖体DNA_ITS_26S_aln_744bp_R15S16T99T102Y339R346G467，前缀“细胞核核糖体DNA_ITS_26S_aln_744bp_”表示利用的基因组区域和基因名称，以及所用序列的长度，该前缀常常可以承前省略，以节约篇幅。
实施例2、鉴定其他紫薇样品
为了验证实施例1建立的核苷酸分子式对于紫薇植物材料的特异性，本发明的发明人还采集了南紫薇的叶片，并按照实施例1的方法，提取其基因组DNA，用由序列1和序列2所示的两条单链DNA分子构成的引物对进行PCR扩增和测序，获得了南紫薇的zw_ITS序列（序列13，与实施例1中所述的10个紫薇品种的zw_ITS序列相比，发现南紫薇缺失第108位核苷酸）。将南紫薇的ITS序列与前述10个紫薇品种的序列放在一起利用软件（如Mega5或ClustalX）进行比对，获得序列比对矩阵（alignment），进一步列出南紫薇的核苷酸分子式，为：G15G16C99T102T339A346G467。
可见，南紫薇为G16型紫薇，其核苷酸分子式与实施例1中的10个紫薇品种对应的10种核苷酸分子式均不相同。从而证实了本发明方法的有效性和特异性。
Figure IDA0000458164710000011
Figure IDA0000458164710000021
Figure IDA0000458164710000031
Figure IDA0000458164710000041
Figure IDA0000458164710000061
Figure IDA0000458164710000071
Figure IDA0000458164710000081
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Figure IDA0000458164710000101
Figure IDA0000458164710000121
Figure IDA0000458164710000131
Figure IDA0000458164710000151
Figure IDA0000458164710000161

Claims (10)

1.一种鉴定或辅助鉴定待测紫薇品种的方法，包括如下步骤：
（1）以待测紫薇的基因组DNA为模板，用由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；
（2）将所述PCR产物测序，根据测序结果列出所述待测紫薇的核苷酸分子式；
所述待测紫薇的核苷酸分子式的通式为：
B15B16B99B102B339B346B467；
在所述通式中，所述B15、所述B16、所述B99、所述B102、所述B339、所述B346和所述B467，依次表示在所述PCR产物的核苷酸序列中，将所述PCR产物的核苷酸序列自5’端的第126个碱基记为第1个碱基，沿着所述PCR产物的核苷酸序列向3’端方向顺次计数的第15、16、99、102、339、346和467个碱基；
在所述通式中，每一个B为A、T、C和G四种碱基中的一种或两种的叠加；
（3）将步骤（2）所得所述待测紫薇的核苷酸分子式与核苷酸分子式组I进行比对；
所述核苷酸分子式组I由如下a1）-a10）共10种核苷酸分子式组成：
a1）G15C16T99T102T339A346G467；
a2）G15C16Y99T102Y339A346G467；
a3）G15C16Y99Y102Y339A346K467；
a4）G15C16Y99T102Y339R346G467；
a5）R15S16Y99W102Y339R346G467；
a6）R15S16T99W102Y339R346G467；
a7）G15C16T99W102Y339R346G467；
a8）G15C16T99Y102Y339R346G467；
a9）R15S16T99Y102Y339R346G467；
a10）R15S16T99T102Y339R346G467；
在a1）-a10）中，Y表示碱基T和C；K表示G和T；W表示碱基A和T；S表示C和G；R表示碱基A和G；
（4）根据步骤（3）的比对结果，按照如下方法对所述待测紫薇进行品种鉴定：
若所述待测紫薇的核苷酸分子式为a1）所示的核苷酸分子式，则所述待测紫薇为或候选为紫薇品种‘红环直枝紫’；
若所述待测紫薇的核苷酸分子式为a2）所示的核苷酸分子式，则所述待测紫薇为或候选为紫薇品种‘绿爪红蝶’；
若所述待测紫薇的核苷酸分子式为a3）所示的核苷酸分子式，则所述待测紫薇为或候选为紫薇品种‘白密香’；
若所述待测紫薇的核苷酸分子式为a4）所示的核苷酸分子式，则所述待测紫薇为或候选为紫薇品种‘黄药粉晶’；
若所述待测紫薇的核苷酸分子式为a5）所示的核苷酸分子式，则所述待测紫薇为或候选为紫薇品种‘皱瓣堇薇’；
若所述待测紫薇的核苷酸分子式为a6）所示的核苷酸分子式，则所述待测紫薇为或候选为紫薇品种‘建民红’；
若所述待测紫薇的核苷酸分子式为a7）所示的核苷酸分子式，则所述待测紫薇为或候选为紫薇品种‘直萼红爪粉’；
若所述待测紫薇的核苷酸分子式为a8）所示的核苷酸分子式，则所述待测紫薇为或候选为紫薇品种‘宝庆紫’；
若所述待测紫薇的核苷酸分子式为a9）所示的核苷酸分子式，则所述待测紫薇为或候选为紫薇品种‘长爪珊瑚堇薇’；
若所述待测紫薇的核苷酸分子式为a10）所示的核苷酸分子式，则所述待测紫薇为或候选为紫薇品种‘大花翠盘堇薇’。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述待测紫薇为如下10个品种中的任一种：‘红环直枝紫’、‘绿爪红蝶’、‘白密香’、‘黄药粉晶’、‘皱瓣堇薇’、‘建民红’、‘直萼红爪粉’、‘宝庆紫’、‘长爪珊瑚堇薇’和‘大花翠盘堇薇’。
3.一种用于鉴定或辅助鉴定待测紫薇品种的试剂盒，包括引物对、记载有核苷酸分子式组I的对比卡；
所述引物对由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成；
所述核苷酸分子式组I由如下a1）-a10）共10种核苷酸分子式组成：
a1）G15C16T99T102T339A346G467；
a2）G15C16Y99T102Y339A346G467；
a3）G15C16Y99Y102Y339A346K467；
a4）G15C16Y99T102Y339R346G467；
a5）R15S16Y99W102Y339R346G467；
a6）R15S16T99W102Y339R346G467；
a7）G15C16T99W102Y339R346G467；
a8）G15C16T99Y102Y339R346G467；
a9）R15S16T99Y102Y339R346G467；
a10）R15S16T99T102Y339R346G467；
在a1）-a10）中，Y表示碱基T和C；K表示G和T；W表示碱基A和T；S表示C和G；R表示碱基A和G；
所述待测紫薇具体为如下10个品种中的任一种：‘红环直枝紫’、‘绿爪红蝶’、‘白密香’、‘黄药粉晶’、‘皱瓣堇薇’、‘建民红’、‘直萼红爪粉’、‘宝庆紫’、‘长爪珊瑚堇薇’和‘大花翠盘堇薇’。
4.权利要求3所述试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测紫薇品种中的应用；
所述待测紫薇具体为如下10个品种中的任一种：‘红环直枝紫’、‘绿爪红蝶’、‘白密香’、‘黄药粉晶’、‘皱瓣堇薇’、‘建民红’、‘直萼红爪粉’、‘宝庆紫’、‘长爪珊瑚堇薇’和‘大花翠盘堇薇’。
5.一种鉴定或辅助鉴定待测植物品种的方法，包括如下步骤：
（1）通过比对多个植物品种的细胞核核糖体DNA序列，选取所述多个植物品种的细胞核核糖体DNA序列中存在多态碱基的区域作为目的DNA区域；
（2）利用所述目的DNA区域两侧保守区域的序列，设计能够扩增所述目的DNA区域的引物；
（3）用所述引物对所述多个植物品种中的每个品种的基因组DNA分别进行PCR扩增，得到每个所述植物品种的目的DNA区域；
（4）对每个所述植物品种的目的DNA区域进行测序，得到每个所述植物品种的目的DNA区域的核苷酸序列；
（5）比较所述多个植物品种的目的DNA区域的核苷酸序列，确定多态碱基位点，列出每个品种的核苷酸分子式；所述每个品种的核苷酸分子式由每个品种的目的DNA区域的核苷酸序列从5’末端到3’末端或从3’末端到5’末端依次列出所有的多态碱基位点核苷酸字母及其位置顺序编号组成；所述每个品种的核苷酸分子式通式为Bx1Bx2Bx3……Bxn，通式中，B为多态碱基位点上的碱基种类，为A、T、C和G四种碱基中的一种或两种的叠加；x1为第1个多态碱基位点在所述目的DNA区域的核苷酸序列从5’末端或3’末端起的位置编号，x2为第2个多态碱基位点在所述目的DNA区域的核苷酸序列从5’末端或3’末端起的位置编号，x3为第3个多态碱基位点在所述目的DNA区域的核苷酸序列从5’末端或3’末端起的位置编号，类推，xn为第n个多态碱基位点在所述目的DNA区域的核苷酸序列从5’末端或3’末端起的位置编号；
所述Bx1Bx2Bx3……Bxn为将所有的多态碱基位点按照在所述目的DNA区域的核苷酸序列中从5’末端或3’末端起依次列出；
（6）将具有相同所述核苷酸分子式的品种组成一个谱系，具有不同核苷酸分子式的品种组成不同的谱系，所有谱系构成核苷酸分子式谱系表；
所述核苷酸分子式谱系表中，每一种核苷酸分子式对应来自一个谱系的植物品种；
（7）将待测植物按照步骤（3）-（5）重复操作，用所述待测植物替代步骤（3）-（5）中的植物品种，得到所述待测植物的目的DNA区域的核苷酸分子式；将所述待测植物的目的DNA区域的核苷酸分子式与所述核苷酸分子式谱系表中的所有核苷酸分子式进行比对，按照如下方法确定所述待测植物的品种名称及其隶属的谱系：若所述待测植物的目的DNA区域的核苷酸分子式与所述核苷酸分子式谱系表中的一个核苷酸分子式相同，则所述待测植物品种为或候选为所述一个核苷酸分子式对应的所述谱系中的任意一个品种。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述植物为紫薇。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述目的DNA区域为细胞核核糖体DNA序列的一部分，为含有内转录间隔区和部分26S rRNA基因的区域。
8.根据权利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于：
步骤（2）中，所述引物具体为由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对；
所述目的DNA区域来自于采用所述引物对对所述植物的基因组DNA进行PCR扩增所得的PCR产物。
9.根据权利要求5-8中任一所述的方法，其特征在于：所述多个植物品种及其对应的所述目的DNA区域为如下：
所述植物品种为如下10个紫薇品种中的任一种：‘红环直枝紫’、‘绿爪红蝶’、‘白密香’、‘黄药粉晶’、‘皱瓣堇薇’、‘建民红’、‘直萼红爪粉’、‘宝庆紫’、‘长爪珊瑚堇薇’和‘大花翠盘堇薇’；
所述紫薇品种‘红环直枝紫’的所述DNA区域的核苷酸序列为序列表中序列3；
所述紫薇品种‘绿爪红蝶’的所述DNA区域的核苷酸序列为序列表中序列4；
所述紫薇品种‘白密香’的所述DNA区域的核苷酸序列为序列表中序列5；
所述紫薇品种‘黄药粉晶’的所述DNA区域的核苷酸序列为序列表中序列6；
所述紫薇品种‘皱瓣堇薇’的所述DNA区域的核苷酸序列为序列表中序列7；
所述紫薇品种‘建民红’的所述DNA区域的核苷酸序列为序列表中序列8；
所述紫薇品种‘直萼红爪粉’的所述DNA区域的核苷酸序列为序列表中序列9；
所述紫薇品种‘宝庆紫’的所述DNA区域的核苷酸序列为序列表中序列10；
所述紫薇品种‘长爪珊瑚堇薇’的所述DNA区域的核苷酸序列为序列表中序列11；
所述紫薇品种‘大花翠盘堇薇’的所述DNA区域的核苷酸序列为序列表中序列12。
10.根据权利要求5-8中任一所述方法，其特征在于：
所述紫薇品种‘红环直枝紫’的所述DNA区域的核苷酸分子式为G15C16T99T102T339A346G467；
所述紫薇品种‘绿爪红蝶’的所述DNA区域的核苷酸分子式为G15C16Y99T102Y339A346G467；
所述紫薇品种‘白密香’的所述DNA区域的核苷酸分子式为G15C16Y99Y102Y339A346K467；
所述紫薇品种‘黄药粉晶’的所述DNA区域的核苷酸分子式为G15C16Y99T102Y339R346G467；
所述紫薇品种‘皱瓣堇薇’的所述DNA区域的核苷酸分子式为R15S16Y99W102Y339R346G467；
所述紫薇品种‘建民红’的所述DNA区域的核苷酸分子式为R15S16T99W102Y339R346G467；
所述紫薇品种‘直萼红爪粉’的所述DNA区域的核苷酸分子式为G15C16T99W102Y339R346G467；
所述紫薇品种‘宝庆紫’的所述DNA区域的核苷酸分子式为G15C16T99Y102Y339R346G467；
所述紫薇品种‘长爪珊瑚堇薇’的所述DNA区域的核苷酸分子式为R15S16T99Y102Y339R346G467；
所述紫薇品种‘大花翠盘堇薇’的所述DNA区域的核苷酸分子式为R15S16T99T102Y339R346G467。
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