CN103755778A - 活细胞内蛋白质的免疫荧光标记方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，特别涉及活细胞内蛋白质的免疫荧光标记方法，包括下列步骤：本发明先通过将待标记蛋白质的抗体片段与荧光染料偶联，得到荧光标记的抗体片段；再使脂质体与荧光标记的抗体片段结合，得到可运输的标记物；最后将待标记细胞与可运输的标记物一起在培养基中培养，在培养过程中，利用脂质体可以与细胞膜相融合的特点，即可以透膜的性质，将可运输的标记物运至待标记的细胞中，并通过上面的抗原结合片段与待标记的细胞中的待标记蛋白质发生特异性免疫结合，从而将荧光染料连接在待测蛋白质上，最终实现免疫荧光标记活细胞内蛋白质的目的。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及活细胞内蛋白质的免疫荧光标记方法。
背景技术
免疫荧光标记法是特异性标记细胞内蛋白质的有效方法，它是以荧光染料标记抗体而进行抗原定位的技术。这种方法标记蛋白质的特异性高，而且荧光染料往往是化学合成染料，有很高的量子效率。
但是，相关技术中的免疫荧光标记方法只能对固定的细胞进行标记（先将活细胞损坏再进行标记），不能标记活细胞中的蛋白质，因而无法采用这种方法观察活细胞的动态变化，用于进一步的生物学研究。
发明内容
本发明的目的在于提供活细胞内蛋白质的免疫荧光标记方法，以解决上述的问题。
在本发明的实施例中提供了活细胞内蛋白质的免疫荧光标记方法，包括下列步骤：
将待标记蛋白质的抗体片段与荧光染料偶联，得到荧光标记的抗体片段；其中，所述抗体片段含有抗原结合片段；
将脂质体与所述荧光标记的抗体片段混合，得到可运输的标记物；
将待标记细胞和所述可运输的标记物放入培养基中，培养22-26h。
本发明上述实施例的活细胞内蛋白质的免疫荧光标记方法，先通过偶联，得到荧光标记的抗体片段；再使所述脂质体与所述荧光标记的抗体片段结合，得到可运输的标记物；最后将待标记细胞与可运输的标记物一起在培养基中培养，在培养过程中，利用脂质体可以与细胞膜相融合的特点，即可以透膜的性质，将可运输的标记物运至待标记的细胞中，并通过上面的抗原结合片段与待标记的细胞中的待标记蛋白质发生特异性免疫结合，从而将荧光染料连接在待测蛋白质上，最终实现免疫荧光标记活细胞内蛋白质的目的。
附图说明
图1示出了本发明的试验例中对照组荧光标记后的细胞荧光成像图；
图2示出了本发明的试验例中试验组荧光标记后的细胞荧光成像图；
图3示出了本发明的试验例中对照组荧光漂白后的荧光淬灭趋势图；
图4示出了本发明的试验例中试验组荧光漂白后的荧光淬灭趋势图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例子并结合附图对本发明做进一步的详细描述。
本发明的一个实施例提供了一种活细胞内蛋白质的免疫荧光标记方法，包括下列步骤：
步骤101：将待标记蛋白质的抗体片段与荧光染料偶联，得到荧光标记的抗体片段；其中，所述抗体片段含有抗原结合片段（Fab段）。
步骤102：将脂质体与所述荧光标记的抗体片段混合，得到可运输的标记物。
步骤103：将待标记细胞和所述可运输的标记物放入培养基中，培养22-26h。
上述方法中，通过所述步骤101的偶联，得到荧光标记的抗体片段；再通过所述步骤102使所述脂质体与所述荧光标记的抗体片段结合，得到可运输的标记物；最后所述步骤103中，将待标记细胞与可运输的标记物一起在培养基中培养，在培养过程中，利用脂质体可以与细胞膜相融合的特点，即可以透膜的性质，将可运输的标记物运至待标记的细胞中，并通过上面的抗原结合片段与待标记的细胞中的待标记蛋白质发生特异性免疫结合，从而将荧光染料连接在待测蛋白质上，最终实现免疫荧光标记活细胞内蛋白质的目的。
上述方法中，步骤101的偶联可采用现有技术中的多种偶联方法，现有技术中的偶联方法通常利用成共价键的结合原理，例如利用荧光素（即有机荧光染料）中的异硫氰基与抗体中的氨基结合将两者偶联，或者利用荧光量子点（即无机荧光染料）表面修饰的活性基团（羧基、羟基等）与抗体共价结合完成偶联。步骤102中脂质体与荧光标记的抗体片段结合的原理是：脂质体利用其双分子结构将荧光标记的抗体片段包裹在内。
此外，由于完整的抗体分子分子量较大，不易运输至细胞体内，因此上述标记方法采用了抗体片段，并且该片段中包含了抗原结合片段，因此既容易运输至细胞体内，有可以与细胞体内的抗原结合。
其中，所述荧光染料可以为以下中的一种或几种：
阿托488染料（ATTO488），艾利克斯荧光染料（Alexa Fluor，例如Alexa Fluor647，Alexa Fluor405等），罗丹明染料，德克萨斯染料（Texas red），青色素（例如青色素3，青色5等）。
所述脂质体为以下中的一种或几种：内搬运者（Endo-porter），脂质体2000。
此外，上述活细胞内蛋白质的免疫荧光标记方法还可以进一步改进，以达到更多的技术效果：
优选地，所述步骤C中，培养23-25h。该时长可以保证抗原抗体充分结合。为达到更好的效果，还可以进一步优选为24h。
为了更进一步说明本发明的改进点，以下还提供了具体试验例。
试验例
试验对象：INS-1细胞内的微管蛋白（tubulin）。
试验方法
设置试验组和对照组。
对照组采用传统的荧光标记方法：将生长状态良好的INS-1细胞铺在适合细胞生长与成像的盖玻片上，待其生长过夜，细胞伸展并密度合适时，用转染试剂脂质体（lipofectamin）2000并按照试剂说明，用质粒增强型绿色荧光蛋白（EGFP）-tubulin转染细胞。转染24小时后，蛋白表达和亮度适中，此时观察细胞的荧光成像情况，后进行荧光漂白，观察该组的荧光淬灭情况。
试验组采用本发明的方法：先将tubulin的抗体片段与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）偶联，得到EGFP-抗体片段，再将脂质体与EGFP-抗体片段在溶液中混合，得到载有EGFP-抗体片段的脂质体。同时将生长状态良好的INS-1细胞铺在适合细胞生长与成像的盖玻片上，待其生长过夜，细胞伸展并密度合适时，向其中加入载有EGFP-抗体片段的脂质体，过夜培养，此时观察细胞的荧光成像情况，后进行荧光漂白，观察该组的荧光淬灭情况。
试验结果
图1为对照组荧光标记后的细胞荧光成像图，图2为试验组荧光标记后的细胞荧光成像图，图3为对照组荧光漂白后的荧光淬灭趋势，图4为试验组荧光漂白后的荧光淬灭趋势。对比图1和图3可知，本发明的方法相对于现有技术，标记的荧光强度高，本发明标记的荧光强度高达2000-3000au，而试验组只有600-700au。并且对比图2和图4可知，本发明的荧光标记方法更抗漂白，漂白35min后仍有相当高的荧光强度，利于长时间的动态观察。
综上所述，本发明的方法不仅可以实现免疫荧光标记活细胞内蛋白的目的，而且相对于现有的活细胞荧光成像方法，荧光标记强度高，信噪比高，抗漂白，更利于长时间追踪，具有广阔的应用前景。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.活细胞内蛋白质的免疫荧光标记方法，其特征在于，包括下列步骤：
将待标记蛋白质的抗体片段与荧光染料偶联，得到荧光标记的抗体片段；其中，所述抗体片段含有抗原结合片段；
将脂质体与所述荧光标记的抗体片段混合，得到可运输的标记物；
将待标记细胞和所述可运输的标记物放入培养基中，培养22-26h。
2.根据权利要求1所述的活细胞内蛋白质的免疫荧光标记方法，其特征在于，所述荧光染料为：
阿托488染料。
3.根据权利要求1所述的活细胞内蛋白质的免疫荧光标记方法，其特征在于，所述荧光染料为：
艾利克斯荧光染料。
4.根据权利要求1所述的活细胞内蛋白质的免疫荧光标记方法，其特征在于，所述荧光染料为：
罗丹明染料。
5.根据权利要求1所述的活细胞内蛋白质的免疫荧光标记方法，其特征在于，所述荧光染料为：
德克萨斯染料。
6.根据权利要求1所述的活细胞内蛋白质的免疫荧光标记方法，其特征在于，所述荧光染料为：
青色素。
7.根据权利要求1所述的活细胞内蛋白质的免疫荧光标记方法，其特征在于，所述脂质体为：
内搬运者。
8.根据权利要求1所述的活细胞内蛋白质的免疫荧光标记方法，其特征在于，所述脂质体为：
脂质体2000。
9.根据权利要求1所述的活细胞内蛋白质的免疫荧光标记方法，其特征在于，所述培养的时间为23-25h。
10.根据权利要求1所述的活细胞内蛋白质的免疫荧光标记方法，其特征在于，所述培养的时间为24h。
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