CN103751698B

CN103751698B - 一种胆石通利片的制备方法及其在制备抑制前列腺癌细胞rm-1细胞增殖药物中的应用

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Publication number: CN103751698B
Application number: CN201310671244.8A
Authority: CN
Inventors: 孙乐津; 陈沂芳; 陈翠萍
Original assignee: Individual
Current assignee: Sun Lejin
Priority date: 2013-12-10
Filing date: 2013-12-10
Publication date: 2016-06-15
Anticipated expiration: 2033-12-10
Also published as: CN103751698A

Abstract

本发明属于中药技术领域，具体涉及一种胆石通利片的制备方法及应用。本发明的胆石通利片的制备方法，由金钱草225g、茵陈225g、郁金90g、陈皮150g、黄芩45g、乳香35g、芒硝80g、白矾35g、大黄45g、三棱45g、栀子45g、甘草25g、没药35g作为原料药制成，采用超微粉碎、超临界萃取、微波萃取和大孔树脂吸附制备而成，使得橙皮苷含量有很大提高。本发明还提供了胆石通利片在制备抑制小鼠前列腺癌细胞RM-1细胞增殖药物中的应用。

Description

一种胆石通利片的制备方法及其在制备抑制前列腺癌细胞RM-1细胞增殖药物中的应用

技术领域

本发明属于中药技术领域，具体涉及一种胆石通利片的制备方法及其在制备抑制小鼠前列腺癌细胞RM-1细胞增殖药物中的应用。

背景技术

胆石通利胶囊标准号WS-10324（ZD-0324）-2002，记载于国家中成药标准汇编内科肝胆分册。由金钱草225g、茵陈225g、郁金90g、陈皮150g、黄芩45g、乳香35g、芒硝80g、白矾35g、大黄45g、三棱45g、栀子45g、甘草25g、没药35g作为原料药制成，具有清热利胆，化瘀排石的功效。用于肝胆湿热所致的急、慢性胆囊炎，胆结石等。

现有技术中，尚未有胆石通利胶囊在提取制备方面采用超微粉碎、CO₂超临界萃取、微波技术和大孔树脂吸附技术提取的报道，而中药直接打粉取、水煎煮的方法，工艺粗糙、落后，杂质多，导致患者用量过大，不方便服用，严重影响了本品在临床上应用。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种胆石通利片的制备方法。

本发明的另一个目的在于提供一种胆石通利片在制备抑制小鼠前列腺癌细胞RM-1细胞增殖药物中的应用。

本发明的目的是通过如下的方案实现的：

一种胆石通利片的制备方法，由金钱草225g、茵陈225g、郁金90g、陈皮150g、黄芩45g、乳香35g、芒硝80g、白矾35g、大黄45g、三棱45g、栀子45g、甘草25g、没药35g作为原料药制成，所述的制备方法由下列步骤组成：芒硝、白矾超微粉碎成粒度范围5-45μm的细粉备用；取乳香、没药，粉碎成细粉，加入到CO₂超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力15-30MPa，温度30-50℃，CO₂流量1-3ml/g生药·min，萃取时间180-220min，得超临界萃取物，备用；萃取后的乳香、没药残渣与其他九味药材，粉碎，加入3.6L的70%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次5-10分钟，合并萃取液，浓缩，加到DiaionHP-10大孔吸附树脂柱上，70%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，将超微粉碎后的芒硝、白矾、超临界萃取物、微波提取物混合加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成500片，每片重0.3g。

上述的胆石通利片的制备方法中，所述CO₂超临界萃取中夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%。

上述的胆石通利片的制备方法中，所述CO₂超临界萃取中萃取压力为25MPa。

上述的胆石通利片的制备方法中，所述CO₂超临界萃取中萃取温度为60℃。

上述的胆石通利片的制备方法中，所述CO₂超临界萃取中CO₂流量2ml/g生药·min。

上述的胆石通利片的制备方法中，所述CO₂超临界萃取中萃取时间为200min。

上述的胆石通利片的制备方法中，所述微波萃取功率为700W。

上述的胆石通利片的制备方法中，所述微波萃取每次萃取时间为8分钟。

上述的胆石通利片在制备抑制小鼠前列腺癌细胞RM-1细胞增殖药物中的应用。

现有技术中，胆石通利胶囊口服，一次5粒，一日3次。胆石通利胶囊服药量大。采用本发明方法制备成的胆石通利片每片重0.3g，每次仅需2片，一日服用3次。在具有更多活性成分的条件下大大减少了服用量。此结论可以通过下述试验证明。

试验一、不同方法制备的胆石通利片中橙皮苷含量的比较

1、仪器及试药本发明胆石通利片：按实施例1方法制备，使用1080g原料药，经提取制成500片，每片重0.3g。原胆石通利胶囊，按照WS-10324（ZD-0324）-2002标准方法制备，作为对照。Agilent1200高效液相色谱仪；AE240电子分析天平；橙皮苷对照品（中国药品生物制品检定所）。

2、方法

照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录VD)测定。

色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷健合硅胶为填充剂；甲醇—水（40∶60）为流动相；检测波长为284nm；理论板数按橙皮苷峰计算应不低于3000。

对照品溶液的制备精密称取橙皮苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含38μg的溶液，即得。

本发明产品供试品溶液的制备取本发明的胆石通利片，研细，取0.06g，，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇25ml，称定重量，密塞，超声处理（功率250w，频率30kHz）40分钟，放冷，称定重量，并用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

对照品供试品溶液的制备取本对照的胆石通利胶囊，混匀，研细，取0.15g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇25ml，称定重量，密塞，超声处理（功率250w，频率30kHz）40分钟，放冷，称定重量，并用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

3、结果

结果表明，本发明胆石通利片中橙皮苷的含量为6-10mg/片；而原胆石通利胶囊中橙皮苷的含量为1.45mg/粒，每片橙皮苷含量相当于原胶囊剂含量的4-6倍，在服用量减少的情况下，橙皮苷含量有很大提高。

上述研究表明，采用本发明制备方法制备的胆石通利片，有效成分含量远远高于WS-10324（ZD-0324）-2002标准记载的方法制备的胆石通利胶囊。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1

取金钱草225g、茵陈225g、郁金90g、陈皮150g、黄芩45g、乳香35g、芒硝80g、白矾35g、大黄45g、三棱45g、栀子45g、甘草25g、没药35g：将芒硝、白矾超微粉碎成粒度范围5-45μm的细粉备用；取乳香、没药，粉碎成细粉，加入到CO₂超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%，萃取压力25MPa，温度40℃，CO₂流量2ml/g生药·min，萃取时间200min，得超临界萃取物，备用；萃取后的乳香、没药残渣与其他九味药材，粉碎，加入3.6L的70%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率700W，萃取2次，每次8分钟，合并萃取液，浓缩，加到DiaionHP-10大孔吸附树脂柱上，70%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，将超微粉碎后的芒硝、白矾、超临界萃取物、微波提取物混合加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成500片，每片重0.3g。

经检测，成品中橙皮苷的含量为9.86mg/片。

实施例2

取金钱草225g、茵陈225g、郁金90g、陈皮150g、黄芩45g、乳香35g、芒硝80g、白矾35g、大黄45g、三棱45g、栀子45g、甘草25g、没药35g：将芒硝、白矾超微粉碎成粒度范围5-45μm的细粉备用；取乳香、没药，粉碎成细粉，加入到CO₂超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4%，萃取压力30MPa，温度50℃，CO₂流量3ml/g生药·min，萃取时间180min，得超临界萃取物，备用；萃取后的乳香、没药残渣与其他九味药材，粉碎，加入3.6L的70%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率600W，萃取2次，每次8分钟，合并萃取液，浓缩，加到DiaionHP-10大孔吸附树脂柱上，70%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，将超微粉碎后的芒硝、白矾、超临界萃取物、微波提取物混合加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成500片，每片重0.3g。

经检测，成品中橙皮苷的含量为6.42mg/片。

实施例3

取金钱草225g、茵陈225g、郁金90g、陈皮150g、黄芩45g、乳香35g、芒硝80g、白矾35g、大黄45g、三棱45g、栀子45g、甘草25g、没药35g：将芒硝、白矾超微粉碎成粒度范围5-45μm的细粉备用；取乳香、没药，粉碎成细粉，加入到CO₂超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为6%，萃取压力15MPa，温度30℃，CO₂流量1ml/g生药·min，萃取时间220min，得超临界萃取物，备用；萃取后的乳香、没药残渣与其他九味药材，粉碎，加入3.6L的70%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率800W，萃取2次，每次10分钟，合并萃取液，浓缩，加到DiaionHP-10大孔吸附树脂柱上，70%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，将超微粉碎后的芒硝、白矾、超临界萃取物、微波提取物混合加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成500片，每片重0.3g。

经检测，成品中橙皮苷的含量为8.26mg/片。

实施例4：胆石通利片抑制小鼠前列腺癌细胞RM-1细胞增殖的实验研究资料

1．实验材料

1.1实验用细胞株

小鼠前列腺癌细胞RM-1细胞，山东大学实验室细胞库，DMEM+10%FBS常规培养。

1.2实验药物

研究药物：本发明胆石通利片：按实施例1方法制备。

药液储液：称取100mg胆石通利片，溶于5ml无水乙醇中，0.2μm滤器过滤，500μldoff管分装，-20℃存储，同时0.2μm滤器过滤无水乙醇以备对照组之用。

1.3实验试剂

DMEM(GIBCO公司Cat.No.12100-061Lot.No.758137)；胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司Lot.No.100419）；NaHCO₃(上海久亿化学试剂有限公司Cat.No.11810-033Lot.No.1088387)；Trypsin（AMRESCO公司）；EDTA（AMRESCO公司）；PenicillinGSodiumSalt（AMRESCO公司1）；StreptomycinSulfate(AMRESCO)；无水乙醇（淄博亚杜兰经贸有限公司）；MTT(Biosharp批号：0793)：PBS（实验室自配）；

1.4实验器材

莱卡倒置显微镜（德国Leica型号：DMIL）；可见-紫外光微孔板检测仪（美国MD公司型号：SPECTRAMAX190）；CO₂培养箱（FORMA型号：3111）；超净台（苏净集团安泰公司制造型号：SW-CJ-ZFD）；纯水仪（美国Sprlng公司型号：S/N020579）；精密移液器（法国吉尔森公司型号：P2）；电子天平（德国赛多利斯有限公司型号：BT323S）；全自动高压灭菌锅（日本SANYO公司型号：MLS-3020）；台式电热鼓风干燥箱(上海精密实验设备公司型号：DHG9123A)；冰箱(西门子公司型号：KG18V21TI)；液氮罐（CBS型号：2001）；低速离心机（上海安亭科学仪器厂型号：KA-1000）；0.2μm滤器（MILLIPORE型号：SLGP033RB）；1cm培养皿(NEST公司)、96孔培养板（NEST公司）；细胞计数板；离心管、移液管、Tips若干。

2．实验方法

1)RM-1细胞用DMEM+10%FBS于37℃、5%C0₂进行常规培养（10cm培养皿），当细胞生长至对数期时，收集细胞，弃去培养液，PBS轻洗3遍，加入3ml0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA，37℃消化2min后，向其中加入5ml完全培养基中和反应，吹打细胞后将其转入离心管中，1000rpm离心5min，调整细胞悬液浓度3×10⁴个/ml。

2)将细胞种入96孔培养板中，每孔加入细胞悬液180μl，培养板放入细胞培养箱中(37℃，5%CO₂)常规培养。

3)根据细胞生长情况，一般长至50%-70%，加入胆石通利片溶液，继续培养24h。

4)24h后加入20μlMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。

5)4h后扣板法倒去上清，用吸水纸轻轻拍干，每孔如入200μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。

6)同时设置本底（不加细胞，只加培养液），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定6个复孔。

7)结果以药物对细胞的抑制率表示：细胞增值抑制率(%)=（对照孔OD值-给药孔OD值）、对照孔OD值×100%。实验重复3次。

3．统计处理

采用MicrosoftExcel2007软件中的相关分析和Studentt检验，数据以mean±S.D.表示。

4．实验结果

MTT法实验后统计结果显示，与对照组比较，当剂量达到5mg/ml时，对RM-1细胞增殖抑制有差异(P<0.05)，剂量在10mg/ml时该差异具有显著性(P<0.01)，当剂量达到15-20mg/ml时有极显著性差异(P<0.001)。

表1胆石通利片对RM-1细胞增殖抑制影响研究(X±SD)

注：与对照组比较，*P<O.01；**P<0.001。

5．实验结论

胆石通利片可以抑制RM-1细胞增殖，减少RM-1细胞的细胞生长数目，该作用呈剂量依赖性。

Claims

1.一种胆石通利片在制备抑制小鼠前列腺癌细胞RM-1细胞增殖药物中的应用，其特征在于，所述的胆石通利片由金钱草225g、茵陈225g、郁金90g、陈皮150g、黄芩45g、乳香35g、芒硝80g、白矾35g、大黄45g、三棱45g、栀子45g、甘草25g、没药35g所制成；所述的胆石通利片的制备方法具体包括下述的步骤：将芒硝、白矾超微粉碎成粒度范围5-45μm的细粉备用；取乳香、没药，粉碎成细粉，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力15-30MPa，温度30-50℃，CO2流量1-3ml/g生药·min，萃取时间180-220min，得超临界萃取物，备用；萃取后的乳香、没药残渣与其他九味药材，粉碎，加入3.6L的70%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次5-10分钟，合并萃取液，浓缩，加到DiaionHP-10大孔吸附树脂柱上，70%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，将超微粉碎后的芒硝、白矾、超临界萃取物、微波提取物混合加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成500片，每片重0.3g。

2.根据权利要求1所述的一种胆石通利片在制备抑制小鼠前列腺癌细胞RM-1细胞增殖药物中的应用，其特征在于，所述CO2超临界萃取中夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%。

3.根据权利要求1所述的一种胆石通利片在制备抑制小鼠前列腺癌细胞RM-1细胞增殖药物中的应用，其特征在于，所述CO2超临界萃取中萃取压力为25MPa。

4.根据权利要求1所述的一种胆石通利片在制备抑制小鼠前列腺癌细胞RM-1细胞增殖药物中的应用，其特征在于，所述CO2超临界萃取中CO2流量2ml/g生药·min。

5.据权利要求1所述的一种胆石通利片在制备抑制小鼠前列腺癌细胞RM-1细胞增殖药物中的应用，其特征在于，所述CO2超临界萃取中萃取时间为200min。

6.根据权利要求1所述的一种胆石通利片在制备抑制小鼠前列腺癌细胞RM-1细胞增殖药物中的应用，其特征在于，所述微波萃取功率为700W。

7.根据权利要求1所述的一种胆石通利片在制备抑制小鼠前列腺癌细胞RM-1细胞增殖药物中的应用，其特征在于，所述微波萃取每次萃取时间为8分钟。