CN103735785B

CN103735785B - 铁帚清浊片在制备抑制淋巴瘤细胞yac-1细胞增殖药物中的应用

Info

Publication number: CN103735785B
Application number: CN201310746368.8A
Authority: CN
Inventors: 王铁君; 王红勇; 李云峰; 于多; 张俊; 张冰雅; 宋欣灵; 韩金华; 边丽
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2013-12-30
Filing date: 2013-12-30
Publication date: 2016-01-20
Anticipated expiration: 2033-12-30
Also published as: CN103735785A

Abstract

本发明属于中药技术领域，具体涉及一种铁帚清浊片在制备抑制淋巴瘤细胞YAC-1细胞增殖药物中的应用及铁帚清浊片的制备方法。本发明的铁帚清浊片在制备抑制淋巴瘤细胞YAC-1细胞增殖药物中的应用，所述铁帚清浊片由猪殃殃417g、铁扫帚417g、粉萆薢333g、鱼腥草417g、蒲公英417g、黑蚂蚁250g、预知子417g、车前子250g、茯苓250g、山药250g、益智167g、菟丝子250g、沙苑子250g、金樱根333g、远志125g、甘草50g作为原料药制成，采用超临界萃取和微波萃取制备而成，使得薯蓣皂苷元含量有很大提高。

Description

铁帚清浊片在制备抑制淋巴瘤细胞YAC-1细胞增殖药物中的应用

技术领域

本发明属于中药技术领域，具体涉及一种铁帚清浊片在制备抑制淋巴瘤细胞YAC-1细胞增殖药物中的应用及铁帚清浊片的制备方法。

背景技术

铁帚清浊丸标准号WS-10190（ZD-0190）2002，记载于国家中成药标准汇编内科外科妇科分册。由猪殃殃417g、铁扫帚417g、粉萆薢333g、鱼腥草417g、蒲公英417g、黑蚂蚁250g、预知子417g、车前子250g、茯苓250g、山药250g、益智167g、菟丝子250g、沙苑子250g、金樱根333g、远志125g、甘草50g作为原料药制成，具有清热解毒、利湿去浊的功效。用于慢性前列腺炎下焦湿热证。

现有技术中，尚未有铁帚清浊丸在在制备抑制淋巴瘤细胞YAC-1细胞增殖药物中的应用的报道，也未见有铁帚清浊丸提取制备方面采用超临界和微波技术的报道，而直接粉碎、渗漉、挥发油提取，水煎煮的方法，工艺粗糙、落后，杂质多，导致患者用量过大，不方便服用，严重影响了本品在临床上应用。

发明内容

发明目的：本发明的目的在于提供一种铁帚清浊片在制备抑制淋巴瘤细胞YAC-1细胞增殖药物中的应用。

本发明的另一个目的在于提供一种铁帚清浊片的制备方法。

本发明的目的是通过如下的方案实现的：

铁帚清浊片在制备抑制淋巴瘤细胞YAC-1细胞增殖药物中的应用，所述铁帚清浊片由猪殃殃417g、铁扫帚417g、粉萆薢333g、鱼腥草417g、蒲公英417g、黑蚂蚁250g、预知子417g、车前子250g、茯苓250g、山药250g、益智167g、菟丝子250g、沙苑子250g、金樱根333g、远志125g、甘草50g作为原料药制成，所述铁帚清浊片的制备方法由下列步骤组成：取铁扫帚、黑蚂蚁、鱼腥草、益智，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力15-30MPa，温度30-50℃，CO2流量l-3ml/g生药·min，萃取时间330-370min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎成粗粉，加入15L的60%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次15-25分钟，合并萃取液，浓缩，加到DiaionHP-10大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成500片，每片重0.5g。

优选的，上述的铁帚清浊片在制备抑制淋巴瘤细胞YAC-1细胞增殖药物中的应用，其特征在于，所述铁帚清浊片的制备方法由下列步骤组成：取铁扫帚、黑蚂蚁、鱼腥草、益智，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%，萃取压力25MPa，温度40℃，CO2流量2ml/g生药·min，萃取时间350min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎成粗粉，加入15L的30%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率700W，萃取2次，每次20分钟，合并萃取液，浓缩，加到DiaionHP-10大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成500片，每片重0.5g。

现有技术中，铁帚清浊丸每次6g，一日3次。铁帚清浊丸服药量大，且丸剂味道不好，患者依从性差。采用本发明方法制备成的铁帚清浊片每片重0.5g，每次仅需3片，一日服用3次。在具有更多活性成分的条件下大大减少了服用量。此结论可以通过下述试验证明。且制备成片剂，患者随水吞下即可，服药量小且无苦味，患者易于接受。

试验一、不同方法制备的铁帚清浊片中薯蓣皂苷元含量的比较

l、仪器及试药本发明铁帚清浊片：按实施例1方法制备，使用4785g原料药，经提取制成500片，每片重0.5g。原铁帚清浊丸，按照WS-10190（ZD-0190）2002标准方法制备。Agilent1200高效液相色谱仪；METTLERAE240电子分析天平；薯蓣皂苷元对照品（中国药品生物制品检定所）。

2、方法

照高效液相色谱法（中国药典2010年版一部附录ⅥD）测定。

色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇—乙腈（60:40）为流动相；检测波长为206nm。理论板数按薯蓣皂苷元峰计算应不低于3000。

对照品溶液的制备精密称取在60℃减压干燥4小时的薯蓣皂苷元对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.15mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备取本品20片，研细，取0.25g，精密称定，置50ml圆底烧瓶中，加2mol/L硫酸溶液30ml，加热回流2小时，取出，冷却，滤过，用适量水洗涤容器及滤渣，滤渣烘干（70～80℃），用氯仿加热回流3次（20ml、15ml、15ml），每次15分钟，滤过，合并滤液，挥干氯仿，残渣加流动相适量使溶解，转移至10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液，即得。

对照产品供试品溶液的制备取本品10g，精密称定，研细，取0.50g，精密称定，置50ml圆底烧瓶中，加2mol/L硫酸溶液30ml，加热回流2小时，取出，冷却，滤过，用适量水洗涤容器及滤渣，滤渣烘干（70～80℃），用氯仿加热回流3次（20ml、15ml、15ml），每次15分钟，滤过，合并滤液，挥干氯仿，残渣加流动相适量使溶解，转移至10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液，即得。

含粉萆薢以薯蓣皂苷元（C₂₇H₄₂O₃）计，不得少于0.030mg。

3、结果

结果表明，本发明铁帚清浊片中薯蓣皂苷元的含量为1.2-2.4mg/片；而原铁帚清浊丸中薯蓣皂苷元的含量为0.32mg/g，每次服用量3片的薯蓣皂苷元含量为原丸剂10g含量的4-8倍，在服用量减少的情况下，薯蓣皂苷元含量有很大提高。

上述研究表明，采用本发明制备方法制备的铁帚清浊片，有效成分含量远远高于WS-10190（ZD-0190）2002标准记载的方法制备的铁帚清浊丸。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1

取猪殃殃417g、铁扫帚417g、粉萆薢333g、鱼腥草417g、蒲公英417g、黑蚂蚁250g、预知子417g、车前子250g、茯苓250g、山药250g、益智167g、菟丝子250g、沙苑子250g、金樱根333g、远志125g、甘草50g，将铁扫帚、黑蚂蚁、鱼腥草、益智，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%，萃取压力25MPa，温度40℃，CO2流量2ml/g生药·min，萃取时间350min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎成粗粉，加入15L的30%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率700W，萃取2次，每次20分钟，合并萃取液，浓缩，加到DiaionHP-10大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成500片，每片重0.5g。

经检测，成品中薯蓣皂苷元的含量为2.38mg/片。

实施例2

取猪殃殃417g、铁扫帚417g、粉萆薢333g、鱼腥草417g、蒲公英417g、黑蚂蚁250g、预知子417g、车前子250g、茯苓250g、山药250g、益智167g、菟丝子250g、沙苑子250g、金樱根333g、远志125g、甘草50g，将铁扫帚、黑蚂蚁、鱼腥草、益智，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4%，萃取压力15MPa，温度30℃，CO2流量lml/g生药·min，萃取时间370min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎成粗粉，加入15L的60%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率600W，萃取2次，每次15分钟，合并萃取液，浓缩，加到DiaionHP-10大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成500片，每片重0.5g。

经检测，成品中薯蓣皂苷元的含量为1.27mg/片。

实施例3

取猪殃殃417g、铁扫帚417g、粉萆薢333g、鱼腥草417g、蒲公英417g、黑蚂蚁250g、预知子417g、车前子250g、茯苓250g、山药250g、益智167g、菟丝子250g、沙苑子250g、金樱根333g、远志125g、甘草50g，将铁扫帚、黑蚂蚁、鱼腥草、益智，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为6%，萃取压力30MPa，温度50℃，CO2流量3ml/g生药·min，萃取时间3300min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎成粗粉，加入15L的60%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率800W，萃取2次，每次25分钟，合并萃取液，浓缩，加到DiaionHP-10大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成500片，每片重0.5g。

经检测，成品中薯蓣皂苷元的含量为1.84mg/片。

实施例4：铁帚清浊片抑制小鼠淋巴瘤细胞YAC-1细胞增殖的实验研究资料

1.实验材料

1.1实验用细胞株

小鼠淋巴瘤细胞YAC-1细胞，山东大学实验室细胞库，DMEM+10%FBS常规培养。

1.2实验药物

研究药物：本发明铁帚清浊片：按实施例1方法制备。

药液储液：称取100mg铁帚清浊片，溶于5ml无水乙醇中，0.2μm滤器过滤，500μldoff管分装，-20℃存储，同时0.2μm滤器过滤无水乙醇以备对照组之用。

1.3实验试剂

DMEM(GIBCO公司Cat.No.12100-061Lot.No.758137)；胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司Lot.No.100419）；NaHC03(上海久亿化学试剂有限公司Cat.No.11810-033Lot.No.1088387)；Trypsin（AMRESCO公司）；EDTA（AMRESCO公司）；PenicillinGSodiumSalt（AMRESCO公司1）；StreptomycinSulfate(AMRESCO)；无水乙醇（淄博亚杜兰经贸有限公司）；MTT(Biosharp批号：0793)：PBS（实验室自配）；

1.4实验器材

莱卡倒置显微镜（德国Leica型号：DMIL）；可见-紫外光微孔板检测仪（美国MD公司型号：SPECTRAMAX190）；C02培养箱（FORMA型号：3111）；超净台（苏净集团安泰公司制造型号：SW-CJ-ZFD）；纯水仪（美国Sprlng公司型号：S/N020579）；精密移液器（法国吉尔森公司型号：P2）；电子天平（德国赛多利斯有限公司型号：BT323S）；全自动高压灭菌锅（日本SANYO公司型号：MLS-3020）；台式电热鼓风干燥箱(上海精密实验设备公司型号：DHG9123A)；冰箱(西门子公司型号：KG18V21TI)；液氮罐（CBS型号：2001）；低速离心机（上海安亭科学仪器厂型号：KA-1000）；0.2μm滤器（MILLIPORE型号：SLGP033RB）；1cm培养皿(NEST公司)、96孔培养板（NEST公司）；细胞计数板；离心管、移液管、Tips若干。

2.实验方法

1)YAC-1细胞用DMEM+10%FBS于37℃、5%C02进行常规培养（10cm培养皿），当细胞生长至对数期时，收集细胞，弃去培养液，PBS轻洗3遍，加入3ml0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA，37℃消化2min后，向其中加入5ml完全培养基中和反应，吹打细胞后将其转入离心管中，1000rpm离心5min，调整细胞悬液浓度3×10⁴个/ml。

2)将细胞种入96孔培养板中，每孔加入细胞悬液180μl，培养板放入细胞培养箱中(37℃，5%C0₂)常规培养。

3)根据细胞生长情况，一般长至50%-70%，加入铁帚清浊片溶液，继续培养24h。

4)24h后加入20μlMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。

5)4h后扣板法倒去上清，用吸水纸轻轻拍干，每孔如入200μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。

6)同时设置本底（不加细胞，只加培养液），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定6个复孔。

7)结果以药物对细胞的抑制率表示：细胞增值抑制率(%)=（对照孔OD值-给药孔OD值）、对照孔OD值×100%。实验重复3次。

3.统计处理

采用MicrosoftExcel2007软件中的相关分析和Studentt检验，数据以mean±S.D.表示。

4.实验结果

MTT法实验后统计结果显示，与对照组比较，当剂量达到5mg/ml时，对YAC-1细胞增殖抑制有差异(P<0.05)，剂量在10mg/ml时该差异具有显著性(P<0.01)，当剂量达到15-20mg/ml时有极显著性差异(P<0.001)。

表1铁帚清浊片对YAC-1细胞增殖抑制影响研究(X±SD)

组别	药物浓度（mg/ml）	抑制率（%）
			对照组	0	0
1	5	8.47±5.24
			2	10	16.52±7.56*
3	15	26.17±10.42**
			4	20	38.55±13.97**

注：与对照组比较，*P<O.01；**P<0.001。

5.实验结论

本发明的铁帚清浊片可以抑制YAC-1细胞增殖，减少YAC-1细胞的细胞生长数目，该作用呈剂量依赖性。

Claims

1.铁帚清浊片在制备抑制淋巴瘤细胞YAC-1细胞增殖药物中的应用，所述铁帚清浊片由猪殃殃417g、铁扫帚417g、粉萆薢333g、鱼腥草417g、蒲公英417g、黑蚂蚁250g、预知子417g、车前子250g、茯苓250g、山药250g、益智167g、菟丝子250g、沙苑子250g、金樱根333g、远志125g、甘草50g作为原料药制成，其特征在于，所述铁帚清浊片的制备方法由下列步骤组成：取铁扫帚、黑蚂蚁、鱼腥草、益智，加入到CO₂超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力15-30MPa，温度30-50℃，CO₂流量l-3ml/g生药·min，萃取时间330-370min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎成粗粉，加入15L的60%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次15-25分钟，合并萃取液，浓缩，加到DiaionHP-10大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成500片，每片重0.5g。

2.根据权利要求l所述的铁帚清浊片在制备抑制淋巴瘤细胞YAC-1细胞增殖药物中的应用，其特征在于，所述铁帚清浊片的制备方法由下列步骤组成：取铁扫帚、黑蚂蚁、鱼腥草、益智，加入到CO₂超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%，萃取压力25MPa，温度40℃，CO₂流量2ml/g生药·min，萃取时间350min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎成粗粉，加入15L的60%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率700W，萃取2次，每次20分钟，合并萃取液，浓缩，加到DiaionHP-10大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成500片，每片重0.5g。