CN103733074A - 用于连续流动式pcr系统的系统及方法 - Google Patents

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Abstract

PCR系统的液体处理系统被指示获得用于PCR实验的样品和试剂的矩阵。PCR系统的流体泵送系统被指示维持输送流体通过多个微通道的连续流动，该连续流动允许样品和试剂的混合，从而产生多个混合样品小滴。从PCR系统的桥后检测系统接收用于每个混合样品小滴的一个或多个桥后检测值，以确定混合样品小滴是否正确地混合。PCR系统的热循环仪被指示维持用于使多个混合样品小滴的温度的循环的一个或多个温度。从PCR系统的端点检测系统接收用于每个混合样品小滴的一个或多个端点检测值，以对PCR实验进行分析。

Description

用于连续流动式PCR系统的系统及方法
背景技术
聚合酶链式反应（PCR）系统或热循环仪通常包括取样块、热盖以及加热与冷却元件。这些部件由板载控制系统控制或监控。实时PCR系统或热循环仪通常还包括光学检测系统，其用于检测由附接至核酸样品的一个或多个探针发射的电磁辐射。实时PCR系统另外可包括外部计算机或控制系统，其用于控制及监控系统部件并分析由光学检测系统产生的数据。
当前标准PCR系统和实时PCR系统是基于孔的系统。这些系统接收样品支承设备中的样品，该样品支承设备包括多个孔。在装载到PCR系统中之前，样品利用试剂制备或与试剂混合。然后PCR系统使孔中的样品的温度进行循环。另外，实时PCR系统监控孔中的样品的电磁辐射或荧光发射。
随着遗传和基因组信息的使用及需求的增加，对PCR扩增和分析的需求也在增加。具体地，改进PCR系统的处理量变得越来越重要。尽管每代PCR系统都能够稍稍加快对样品温度的循环，但是技术却无法跟上其他遗传和基因组分析仪器的性能改进。例如，脱氧核糖核酸（DNA）测序仪器发展到在测序实验的时间和成本方面，PCR扩增是最限制性的步骤。
另外，当前PCR系统对基于孔技术的依赖限制了这些系统的整体处理量。当前系统能够在约40分钟内循环样品的温度。当使用具有384孔的最大的基于孔的样品支承设备时，得到约500样品每小时的最大整体样品处理量。另外，当前PCR系统接收已在样品支承设备内制备或混合的样品。因此，这些系统依赖于基于孔的样品制备的费时且有时是手动的步骤。
发明内容
提供了用于高处理量聚合酶链式反应（PCR）扩增和分析的一种系统、方法以及计算机程序产品。该系统包括PCR系统和与该PCR系统进行通信的处理器。该方法包括使用PCR系统和处理器的步骤。
计算机程序产品包括非瞬时且有形的计算机可读存储媒介。计算机可读存储媒介包括具有指令的程序，其中该指令在处理器上执行。在处理器上执行的该指令执行用于高处理量PCR扩增和分析的方法。该方法包括提供不同软件模块的系统，该系统包括液体处理模块、流体泵送模块、桥后检测模块、热循环仪模块以及端点检测模块。
在该系统和方法中，处理器将指令发送给PCR系统的若干部件并接收来自PCR系统的若干部件的数据值。处理器指示液体处理系统获得用于PCR实验的多个样品和多个试剂。处理器指示流体泵送系统维持输送流体通过多个微通道的连续流动。该连续流动允许流体泵送系统接收来自液体处理系统的多个样品和多个试剂，该多个样品和多个试剂作为多个微通道中的小滴。该连续流动还允许流体泵送系统利用上述多个微通道的几何形状混合上述多个样品和多个试剂，从而在上述多个微通道中产生多个混合样品小滴。
处理器从PCR系统的桥后检测系统接收一个或多个桥后检测值，以确定每个混合样品小滴是否正确地混合，其中该一个或多个桥后检测值用于上述多个混合样品小滴的每个混合样品小滴。处理器指示PCR系统的热循环仪维持一个或多个温度，其中该一个或多个温度用于循环上述多个微通道中的多个混合样品小滴的温度。最后，处理器从PCR系统的端点检测系统接收一个或多个端点检测值，以对PCR实验进行分析，其中该一个或多个端点检测值用于上述多个混合样品小滴的每个混合样品小滴。
在各种实施方式中，处理器指示液体处理系统从位于液体处理系统的第一托盘上的第一样品支承设备吸移样品，从位于液体处理系统的第二托盘上的第二样品支承设备吸移测定试剂，以及从容器吸移主混合物试剂。
在各种实施方式中，一个或多个桥后检测值包括混合样品小滴的时间戳。在各种实施方式中，一个或多个桥后检测值包括由混合样品小滴吸收或反射的电磁辐射强度。在各种实施方式中，一个或多个桥后检测值包括：电磁辐射的第一强度，该电磁辐射由混合样品小滴的样品的第一染料发射；电磁辐射的第二强度，该电磁辐射由混合样品小滴的测定试剂的第二染料发射；以及电磁辐射的第三强度，该电磁辐射由混合样品小滴的主混合物试剂的第三染料发射。
在各种实施方式中，如果处理器根据一个或多个桥后检测值确定混合样品小滴没有正确地混合，则其进一步指示液体处理系统对混合样品小滴的样品和测定试剂进行重新采样。
在各种实施方式中，一个或多个端点检测值包括微通道的位置和从该微通道检测到的频谱强度。
本文阐述了本教导的这些及其他特征。
附图说明
本领域技术人员将理解，下面描述的附图仅用于示例性目的。附图并不旨在以任何方式限制本教导的范围。
图1为示出可实施本教导的实施方式的计算机系统的框图；
图2为示出根据各种实施方式的用于高处理量聚合酶链式反应（PCR）扩增和分析的系统的示意图；
图3为示出根据各种实施方式的用于高处理量PCR扩增和分析的方法的示例性流程图；
图4为根据各种实施方式的包括执行用于高处理量PCR扩增和分析的方法的一个或多个不同软件模块的系统的示意图；
图5为根据各种实施方式的用于连续流动式PCR系统的软件架构的示意图；
图6为示出根据各种实施方式的系统初始化方法的流程图；
图7为示出根据各种实施方式的用于发出传输控制协议/互联网协议（TCP/IP）命令的方法的流程图；
图8为示出根据各种实施方式的用于发出运行命令的方法的第一部分的流程图；
图9为示出根据各种实施方式的用于发出运行命令的方法的第二部分的流程图；
图10为示出根据各种实施方式的用于发出运行命令的方法的第三部分的流程图；
图11为示出根据各种实施方式的系统关闭方法的流程图；
图12为示出根据各种实施方式的用于处理错误的方法的流程图；
图13为根据各种实施方式的片状阀打开方法的示意图；
图14为根据各种实施方式的流体/板处理系统的示意图；
图15为示出根据各种实施方式的用于板堆叠的方法的第一部分的流程图；
图16为示出根据各种实施方式的用于板堆叠的方法的第二部分的流程图；
图17为示出根据各种实施方式的用于板堆叠的方法的第三部分的流程图；
图18为示出根据各种实施方式的用于液体处理初始化的方法的流程图；
图19为示出根据各种实施方式的用于液体处理的方法的流程图；
图20为示出根据各种实施方式的用于液体处理关闭的方法的流程图；
图21为示出根据各种实施方式的桥后方法之间的关系的状态图；
图22为示出根据各种实施方式的桥后初始化方法的第一部分的流程图；
图23为示出根据各种实施方式的桥后初始化方法的第二部分的流程图；
图24为示出根据各种实施方式的桥后预运行方法的流程图；
图25为示出根据各种实施方式的桥后运行方法的第一部分的流程图；
图26为示出根据各种实施方式的桥后运行方法的第二部分的流程图；
图27为示出根据各种实施方式的桥后运行方法的第三部分的流程图；
图28为示出根据各种实施方式的桥后运行结束方法的流程图；
图29为示出根据各种实施方式的桥后关闭方法的流程图；
图30为示出根据各种实施方式的托盘和位置路径点的示意图；
图31为示出根据各种实施方式文件如何在图形用户界面（GUI）和仪器之间传输的示意图；
图32为示出根据各种实施方式的用于利用文件传输协议（FTP）服务器上传文件的方法的流程图；
图33为根据各种实施方式的用于在连续流动式PCR系统中检测频谱与空间信息的系统的侧视图的示意图；
图34为根据各种实施方式的用于在连续流动式PCR系统中检测频谱与空间信息的系统的俯视图的示意图；
图35为根据各种实施方式的管阵列板的示意性三维视图；
图36为根据各种实施方式的管阵列板的示意性俯视图；
图37为根据各种实施方式的管阵列板的示意性侧视图；
图38为示出根据各种实施方式的用于在连续PCR系统中检测频谱与空间信息的方法的流程图。
在详细描述本教导的一个或多个实施方式之前，本领域技术人员应当理解：在其应用中本教导并不限于下文详细描述的或附图中图示的构造的细节、部件的布置以及步骤的安排。另外，应当理解本文使用的措辞及术语是用于说明的目的而不应视为限制性的。
具体实施方式
计算机实施的系统
图1为示出了可实施本教导的实施方式的计算机系统100的框图。计算机系统100包括：用于进行信息通信的总线102或其他通信机构，以及与总线102联接的用于处理信息的处理器104。计算机系统100还包括存储器106，存储器106可以是随机存取存储器（RAM）或其他动态存储设备，其联接至总线102，用于确定将由处理器104执行的基础调用（base call）和指令。存储器106还可用于在将由处理器104执行的指令的执行过程中存储临时变量或其他中间信息。计算机系统100还包括只读存储器（ROM）108或其他静态存储设备，其联接至总线102并存储用于处理器104的静态信息和指令。存储设备110（如磁盘或光盘）设置成联接至总线102，用于存储信息和指令。
计算机系统100可通过总线102联接至显示器112（如阴极射线管（CRT）或液晶显示器（LCD）），以向计算机用户显示信息。包括字母数字和其他键的输入设备114联接至总线102，以用于向处理器104通信信息和命令选择。另一类型的用户输入设备是光标控制116（如鼠标、轨迹球或光标方向键），其用于向处理器104通信方向信息和命令选择以及控制显示器112上的光标移动。输入设备通常在两个轴线，即第一轴线（即x）和第二轴线（即y）上具有两个自由度，从而允许该设备指定在面内的位置。
计算机系统100可执行本教导。与本教导的某些实施方式相一致地，响应于处理器104执行包括在存储器106中的一个或多个指令的一个或多个序列，结果由计算机系统100提供。这些指令可从另一计算机可读媒介如存储设备110读取到存储器106中。包括在存储器106中的指令序列的执行使得处理器104执行本文中描述的过程。可替代地，也可使用硬连线电路取代软件指令或与软件指令相结合来实施本教导。因此本教导的实施方式不限于软件与硬连线电路的任何具体组合。
本文中所使用的术语“计算机可读媒介”是指参与向处理器104提供用于执行的指令的任何媒介。这种媒介可具有多种形式，包括但不限于非易失性媒介、易失性媒介和传输媒介。非易失性媒介包括例如光盘或磁盘，如存储设备110。易失性媒介包括动态存储器，如存储器106。传输媒介包括同轴电缆、铜线和光纤，包括其中包括总线102的连线。
计算机可读媒介的常见形式包括例如软盘（floppy disk）、软盘（flexible disk）、硬盘、磁带或任何其他磁性媒介、CD-ROM、任何其他光学媒介、穿孔卡、纸带、具有孔图案的任何其他物理媒介、RAM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、任何其他存储器芯片或盒式磁带（cartridge）、或计算机可读取的任何其他有形媒介。
各种形式的计算机可读媒介可涉及向处理器104输送一个或多个指令的一个或多个序列以供执行。例如，指令最初可携带在远程计算机的磁盘上。远程计算机可将指令加载到其动态存储器中并利用调制解调器通过电话线发送指令。计算机系统100的本地调制解调器可接收电话线上的数据并使用红外发射器将该数据转变为红外信号。与总线102联接的红外检测器可接收红外信号中携带的数据并将该数据放置到总线102上。总线102携带数据至存储器106，处理器104从存储器106取回并执行这些指令。在由处理器104执行之前或执行之后，通过存储器106接收的指令可以可选地存储在存储设备110上。
根据各种实施方式，配置成将由处理器执行以执行方法的指令存储在非瞬时且有形的计算机可读媒介上。计算机可读媒介可以是存储数字信息的设备。例如，计算机可读媒介包括本领域公知的用于存储软件的光盘只读存储器（CD-ROM）。计算机可读媒介通过处理器进行存取，其中该处理器适于执行配置成将被执行的指令。
出于图示和说明的目的，下文呈现对本教导的各种实施方式的说明。其非穷尽性的并且不使本教导限制于所公开的精确形式。根据本教导可进行各种修改和变型，或可从本教导的实践中获得。另外，虽然所描述的实施包括软件，但是本教导可实施为硬件与软件的组合或仅通过硬件来实施。本教导可以用面向对象和非面向对象的编程系统来实施。
数据处理的系统和方法
连续流动式PCR系统
如上所述，当前PCR系统对基于孔的技术的依赖会限制这些系统的整体处理量。此外，当前PCR系统接收已在样品支承设备中制备或混合的样品。因此，这些系统依赖于基于孔的样品制备的费时且有时是手动的步骤。
在各种实施方式中，使用了用于连续流动式PCR扩增和分析的系统和方法。这些系统和方法显著增大了PCR实验的样品处理量并且减少了由于基于孔的技术所带来的限制。具体地，用于连续流动式PCR的系统和方法通过将样品制备步骤并入PCR过程而基本消除了样品制备步骤。
图2为示出根据各种实施方式的用于高处理量PCR扩增和分析的系统200的示意图。系统200包括PCR系统210和处理器220。PCR系统210包括液体处理系统230、流体泵送系统240、桥后（post-bridge）检测系统250、热循环仪260以及端点检测系统270。
处理器220与PCR系统210进行通信。处理器220可包括但不限于计算机，微处理器，微控制器，专用集成电路（ASIC），或任何能够执行指令以及发送和接收数据或控制通信的设备。
处理器220指示液体处理系统230获得用于PCR实验的多个样品和多个试剂。在各种实施方式中，处理器220指示液体处理系统230从位于液体处理系统230的托盘231上的第一样品支承设备（未图示）吸移（pipette）样品，从位于液体处理系统230的托盘232上的第二样品支承设备（未图示）吸移测定试剂，以及从容器233吸移主混合试剂。
在各种实施方式中，样品支承设备可以是具有多个样品区域的玻璃载玻片或塑料载玻片。样品支承设备的一些示例可包括但不限于多孔板，如标准96孔微量滴定板、384孔板或微型卡，或者大致为平的支承件，如玻璃载玻片或塑料载玻片。在样品支承设备的各种实施方式中，样品区域可以包括：凹陷、凹口、脊状凸起及其组合，以规则或不规则阵列的形式在基板的表面上形成图案。
处理器220指示流体泵送系统240维持输送流体穿过多个微通道的连续流动。输送流体或油是用于在系统200周围携带样品的被动缓冲。图2示出多个微通道中的一个微通道。这个微通道或管包括导流线（draft line）241和热循环仪线242。导流线241用来排放过多的输送流体并维持输送流体以恒定流速连续流过微通道。热循环仪线242用于运送混合样品通过系统200。
处理器220指示流体泵送系统240维持输送流体的连续流动，以接收作为该多个微通道中的小滴的来自液体处理系统230的多个样品和多个试剂。通过流体泵送系统240维持的输送流体的连续流动通过流体泵送系统240的线245从液体处理系统230的尖端235抽取样品小滴。类似地，例如，通过流体泵送系统240维持的输送流体的连续流动通过流体泵送系统240的线246从液体处理系统230的尖端236抽取测定试剂小滴并且小滴通过流体泵送系统240的线247从液体处理系统230的尖端237抽取主混合物试剂。
另外，通过流体泵送系统240维持的输送流体的连续流动还利用该多个微通道的几何形状致使多个样品与多个试剂被混合。这导致了该多个微通道中的多个混合样品小滴。例如，致使多个样品与多个试剂混合的该多个微通道的几何形状是微通道的连结点或液桥。
连结点249是用于一个微通道的混合样品和试剂的示例性液桥。线245、246和247在连结点249处相遇。通过精确的定时控制，处理器220指示液体处理系统230利用尖端235、236和247在特定的时间选择样品、测定试剂和主混合小滴，以使得流体泵送系统240将这些小滴同时抽取至连结点249。因为样品、测定试剂和主混合小滴同时到达连结点249，所以当与输送流体的连续流动一起移动时被其混合。这种混合产生了混合样品小滴。混合样品小滴离开连结点249并进入热循环仪线242。在热循环仪线242中，混合样品小滴继续以恒定的流速与输送流体的连续流动一起移动。
为了确定每个混合样品小滴是否正确地混合，处理器220从桥后检测系统250接收一个或多个桥后检测值，其中该一个或多个桥后检测值用于多个混合样品小滴的每个混合样品小滴。桥后检测系统250例如在由处理器220选择的精确时间步骤检测热循环仪线242中的混合样品小滴。在各种实施方式中，桥后检测系统250是光学系统，其包括一个或多个照明源和一个或多个照相机。在各种实施方式中，使用一个照相机且该一个或多个桥后检测值包括由每一混合样品小滴吸收或反射的电磁辐射强度。
在各种实施方式中，桥后检测系统250使用三个照相机。由处理器220接收的该一个或多个桥后检测值包括：电磁辐射的第一强度，该电磁辐射由每个混合样品小滴的样品的第一染料发射；电磁辐射的第二强度，该电磁辐射由每个混合样品小滴的测定试剂的第二染料发射；以及电磁辐射的第三强度，该电磁辐射由混合样品小滴的主混合试剂的第三染料发射。在各种实施方式中，该一个或多个桥后检测值还包括混合样品小滴的时间戳，从而处理器能够辨别用于形成混合样品小滴的样品和试剂。
在各种实施方式中，如果处理器220根据该一个或多个桥后检测值确定混合样品小滴没有正确地混合，则处理器220指示液体处理系统230对混合样品小滴的样品和测定试剂进行重新采样。换句话说，如果处理器220根据该一个或多个桥后检测值确定混合样品小滴没有指示适当的混合物，那么处理器指示液体处理系统230对用于形成混合样品小滴的样品和试剂进行重新采样。
在多个混合样品小滴中的混合样品小滴通过桥后检测系统250进行分析之后，其移动至热循环仪260。处理器220指示热循环仪260维持一个或多个温度，其中该一个或多个温度用于使多个混合样品小滴的温度在多个微通道中循环。在各种实施方式中，热循环仪260包括两个或更多加热与冷却元件，该两个或更多加热与冷却元件被指示以维持两个或更多温度。当每个混合样品小滴在上述两个或更多加热与冷却元件之间移动时，混合样品小滴的温度被循环。
最后，处理器220接收来自端点检测系统270的一个或多个端点检测值，其中该一个或多个端点检测值用于多个混合样品小滴的每个混合样品小滴。处理器220使用该一个或多个端点检测值来对PCR实验进行分析。在各种实施方式中，端点检测系统270也是光学检测系统。端点检测系统270例如是确定空间与频谱信息的超频谱成像系统。因此，在各种实施方式中，该一个或多个端点检测值包括微通道的位置和从该微通道检测到的频谱强度。微通道的位置允许处理器220辨别混合样品小滴而检测到的谱强度值提供了对PCR实验的结果的测量。
图3为示出了根据各种实施方式的用于高处理量PCR扩增和分析的方法的示例性流程图。
在方法300的步骤310中，使用处理器指示PCR系统的液体处理系统获得用于PCR实验的多个样品和多个试剂。
在步骤320中，使用处理器指示PCR系统的流体泵送系统维持输送流体通过过多个微通道的连续流动。该连续流动允许流体泵送系统接收来自液体处理系统的多个样品和多个试剂，其中该多个样品和多个试剂作为多个微通道中的小滴。该连续流动还允许流体泵送系统利用多个微通道的几何形状混合多个样品和多个试剂。多个样品和多个试剂的混合在多个微通道内产生多个混合样品小滴。
在步骤330中，使用处理器从PCR系统的桥后检测系统接收一个或多个桥后检测值，以确定每个混合样品小滴是否正确地混合，其中该一个或多个桥后检测值用于该多个混合样品小滴的每个混合样品小滴。
在步骤340中，使用处理器指示PCR系统的热循环仪维持一个或多个温度，该一个或多个温度用于使该多个混合样品小滴的温度在多个微通道中循环。
在步骤350中，使用处理器接收来自PCR系统的端点检测系统的一个或多个端点检测值，以对PCR实验进行分析，其中该一个或多个端点检测值用于该多个混合样品小滴的每个混合样品小滴。
在各种实施方式中，计算机程序产品包括非瞬时且有形的计算机可读存储媒介，其内容包括具有指令的程序，其中该指令在处理器上被执行，以执行用于高处理量PCR扩增和分析的方法。该方法通过包括一个或多个不同软件模块的系统执行。
图4为根据各种实施方式的包括执行用于高处理量PCR扩增和分析的方法的一个或多个不同软件模块的系统400的示意图。系统400包括液体处理模块410、流体泵送模块420、桥后检测模块430、热循环仪模块440以及端点检测模块450。
液体处理模块410指示PCR系统的液体处理系统获得用于PCR实验的多个样品和多个试剂。
流体泵送模块420指示PCR系统的流体泵送系统维持输送流体通过过多个微通道的连续流动。该连续流动允许流体泵送系统接收来自液体处理系统的多个样品和多个试剂，其中该多个样品和多个试剂作为多个微通道中的小滴。该连续流动还允许流体泵送系统利用上述多个微通道的几何形状来混合该多个样品和多个试剂，从而在上述多个微通道中产生多个混合样品小滴。
桥后检测模块430从PCR系统的桥后检测系统接收一个或多个桥后检测值，以判断每个混合样品小滴是否正确地混合，其中该一个或多个桥后检测值用于该多个混合样品小滴的每个混合样品小滴。
热循环仪模块440指示PCR系统的热循环仪维持一个或多个温度，其中该一个或多个温度用于使多个混合样品小滴的温度在多个微通道中循环。
端点检测模块450从PCR系统的端点检测系统接收一个或多个端点检测值，以对PCR实验进行分析，其中该一个或多个端点检测值用于该多个混合样品小滴的每个混合样品小滴。
示例性连续流动式PCR系统
示例性连续流动式PCR系统是能够同时从主混合物、样品和引物/探针取样并将它们在微通道几何形状（液桥）内混合的连续流动式96线PCR仪器。混合的小滴向下游流动至热循环仪，在热循环仪处其被扩增。然后小滴通过数据采集系统，在数据采集系统处其荧光强度被测量。
为了使得系统能够操作，存在以下软件控制的单元：流体泵送系统，液体处理/板处理系统，桥后检测系统，热循环仪，端点检测系统以及辅助器件。流体泵送系统包括五个流量传感器，五个泵及40个以上水平传感器和阀。液体处理/板处理系统包括板堆叠器，条形码读取器和15个轴线取样单元。桥后检测系统包括三个Basler照相机。热循环仪包括四个24线温控热循环仪（TC），其每个均具有分离的变性块。端点检测系统包括一个Hamamatsu Orca照相机和一个激光器。
图5为根据各种实施方式的用于连续流动式PCR系统的软件架构的示意图。
图6为示出根据各种实施方式的系统初始化方法的流程图。
图7为示出根据各种实施方式的用于发出传输控制协议/互联网协议（TCP/IP）命令的方法的流程图。
图8为示出根据各种实施方式的用于发出运行命令的方法的第一部分的流程图。
图9为示出根据各种实施方式的用于发出运行命令的方法的第二部分的流程图。
图10为示出根据各种实施方式的用于发出运行命令的方法的第三部分的流程图。
图11为示出根据各种实施方式的系统关闭方法的流程图。
图12为示出根据各种实施方式的用于处理错误的方法的流程图。
流体泵送系统
再次参照图2，系统200按照连续流动的原理进行操作。油的连续流动被维持通过热循环仪（TC线242）并且油的流动运送混合的小滴。为了满足处理量的要求，液桥上游（从取样尖端到桥）的流动需要快于通过热循环仪的流动。导流线241安装到桥上并排放过多的油。TC线242和导流线241都以固定的流速进行操作。因为小滴加入这些线中增加了沿着每个线的压力降，所以这些线需要是受控。TC线242和导流线241中的组合流与主混合物、样品和引物-探针线中的组合流相等。
另外，泵送系统包括多个子系统，该多个子系统用于利用油使系统准备好并排放系统的空气。图2为示出了TC线242，导流线241和硬件部件所处的位置的总体示意图（用于单线系统）。
护套
如果PCR系统在连续流动下操作，那么移动系统通过空气以从孔移动至孔会致使空气被抽入该系统。通过使用护套/片状阀可避免这种情况。这些更大口径管安装在取样管周围并且使其包裹在油中。油进入护套的连续流动（由3个独立的护套泵驱动）与抽入系统尖端的流动相匹配（或稍稍超过），保证了连续流动线总是包裹在油中。因此，尖端能够从一个孔自由地移动到另一孔，而不会使任何空气抽入系统中。
液体处理/板改变
图13为根据各种实施方式的片状阀打开方法1300的示意图。为了便于片状阀/护套（需要在可以进行取样之前打开）的使用，尖端安装在双Z轴上。次轴1320安装在主轴1310上。护套/片状阀安装在主轴1310上而尖端安装在次轴1320上。
在方法1300的步骤1中，机器人头部在空气中在所需的孔上方移动。
在步骤2中，主轴1310使尖端（护套和次轴1320）下降至油覆盖层中，该油覆盖层覆盖每个孔中的样品。
在步骤3中，然后次轴1320使尖端延伸（将阀推开），从而尖端位于样品上方。同时主轴1310升高相等的距离。组合效果是次轴1320在空间上是静止的而主轴1310向上移动。与片状阀的几何形状相结合，该运动使得在每个孔（96孔板）中使用了额外的30μl体积的样品。
在步骤4中，次轴1320进一步下降到孔中并且完成片状阀的打开。次轴1320暂停直到被触发至样品。
在步骤5中，在所需的精确时间，次轴1320浸入流体中并抽取约75nl的流体（样品/引物-探针，主混合物约150nl）。所抽取的流体的量取决于所使用的流速以及尖端处在流体内的时间。
在步骤6中，尖端随后从样品缩回并暂停，准备好再次取样（如果需要）。如果需要对相邻孔（或者板-变换）进行下一次取样，则尖端缩回到护套内，然后主轴1310时取样头移出到空气中。护套运动与去护套运动是相反的。
图14为根据各种实施方式的流体/板处理系统1400的示意图。在系统1400中，流体/板处理提供沿15个轴线的移动。作为参考，系统1400分成三个取样系统和一个板处理系统。每个台的运动方向都通过箭头示出。应注意到，示出了多腔单元的取样臂。但是为了清楚起见，隐藏了单尖端单元和主混合物单元的取样臂。此外，主混合物单元安装在外壳的顶部上。各个轴为：
·尖端取样
○X轴
○Y轴
○主Z轴（Z1）
○次Z轴（Z2）
·多腔取样
○X轴
○Y轴
○主Z轴（Z1）
○次Z轴（Z2）
○旋转轴
·主混合物取样
○X轴
○主Z轴（Z1）
○次Z轴（Z2）
·板处理
○Y轴
○Xl轴（托盘1-单尖端）
○X2轴（托盘2-多腔）
单尖端系统包括96个尖端，每个尖端都能够进入96孔或384孔板上的一个孔中。因此系统1400可以一次移动对96孔板进行取样或者以四次移动对384孔板进行取样。多腔系统包括四组24尖端。每组中的所有24线可进入一个孔中。组中的每个线都排列成与单尖端线中的一个相对，在桥中相遇，然后流入热循环器。多腔头部安装在旋转单元上。因此通过四次旋转及浸入，位于托盘2（多腔侧）上的四个孔可排列成与整个96孔板相对。相似地，16次机器人运动（四次多腔转动乘以四次单尖端移动）可准许位于托盘2上的四个孔排列成与整个384孔板相对。
图15为示出根据各种实施方式的用于板堆叠的方法的第一部分的流程图。
图16为示出根据各种实施方式的用于板堆叠的方法的第二部分的流程图。
图17为示出根据各种实施方式的用于板堆叠的方法的第三部分的流程图。
图18为示出根据各种实施方式的用于液体处理初始化的方法的流程图。
图19为示出根据各种实施方式的用于液体处理的方法的流程图。
图20为示出根据各种实施方式的用于液体处理关闭的方法的流程图。
小滴厢（Carriage）
离开液桥的小滴流被分成多个包（基于机器人进行采样的时间戳）。为方便起见，这些包被称为厢。这些厢的使用准许更容易地辨别各个小滴且易于辨别小滴流中的错误，其中厢之间的间隔至少两倍于小滴之间的间隔。例如，厢2（每个厢具有5个小滴）的小滴2较之于连续流中的小滴12更易于辨别。相似的错误可易于辨别。如果在一个5小滴的厢内只存在4个小滴，那么很显然出现了错误（小滴合并）；如果存在6个，那么小滴没有混合或者混合后又分成了两个。
图21为示出根据各种实施方式的桥后方法之间关系的状态图。
图22为示出根据各种实施方式的桥后初始化方法的第一部分的流程图。
图23为示出根据各种实施方式的桥后初始化方法的第二部分的流程图。
图24为示出根据各种实施方式的桥后预运行方法的流程图。
图25为示出根据各种实施方式的桥后运行方法的第一部分的流程图。
图26为示出根据各种实施方式的桥后运行方法的第二部分的流程图。
图27为示出根据各种实施方式的桥后运行方法的第三部分的流程图。
图28为示出根据各种实施方式的桥后运行结束方法的流程图。
图29为示出根据各种实施方式的桥后关闭方法的流程图。
桥后检测
桥后检测系统包括蓝色发光二极管（LED）的阵列，其照射来自桥的输出线（位于液桥和热循环仪之间）。使用三个照相机（Basler）监控由蓝色发光二极管激发的三个荧光波长。这些组分为引物-探针中的FAM/VIC，主混合物中的ROX以及添加到样品中作为参照的第三染料（即ALEXA）。如果检测系统从小滴中拾取了全部三种波长，那么这被认为是混合且有效的小滴。但是，在一些情况下，桥并没有正确地混合小滴。这可以通过确定主小滴缺失了一个或多个组分而被发现。在一个小滴（或厢）出现错误的情况下，则该小滴（或整个厢）将重新取样。
热循环仪
热循环仪包括四个24线热循环仪。每个块前都有预热块。每个块都采用比例积分微分（PID）控制来维持在其设定点。
端点检测和分析
端点检测包括自由空间摄谱仪系统。采集硬件为Hamamatsu Orca照相机。96个热循环仪线由488nm激光线照射。摄谱仪/照相机对该激光线成像并分解到其构成波长中。根据小滴的成分，测量适当的波长。基于由桥后检测模块生成的时间戳辨别小滴并生成小滴的原始荧光数据。然后施加光谱补偿以补偿染料泄漏。
文件输入/输出
PCR仪器利用两个不同的ASCII.csv文件进行驱动。命令文件（command file）以BARCODETRAY1_BARCODETRAY2_cmds.csv格式来命名，而卷文件（volume file）以BARCODETRAY1_vols.csv格式来命名。命令文件包括由仪器取样的孔组合的列表。卷文件包括与板上的每个孔的内容（体积和组分）有关的信息。当接收到RUN命令时，仪器读取存在的每个板上的条形码。其搜索匹配的命令和卷文件，如果存在，则处理该项目。结果以BARCODETRAYl_BARCODETRAY2_rslts.csv的形式输出。
图30为示出根据各种实施方式的托盘和位置路径点的示意图。在图30中，示出了液体路径点P1至P6。托盘T1和T2都能够访问所有的六个路点。例如，P1和P6没有使用。P2用于条形码读取。P3用于在板改变装置上上堆叠（upstack）/下堆叠（downstack）到Hotel1中。P4类似地用于Hotel2。P5由机器人使用，以装载或卸载板。
图形用户界面（GUI）
例如，通过实验室信息管理系统向连续流动式PCR仪器提供样品和试剂孔的矩阵。在各种实施方式中，通过GUI输入样品和试剂孔的矩阵。GUI与仪器进行交互以控制板堆叠器和传输文件。为了传输文件，使用了文件传输协议（FTP）设定。存在FTP服务器，其存储文件并且等待客户与之连接。GUI充当客户以与该FTP服务器连接并传输文件。仪器也可与同一FTP服务器相连并传输文件。
为了控制板堆叠器，使用了自定义控制协议（TCP）。该仪器充当服务器并且等待GUI与之连接。在连接建立之后，预定的TCP命令被发送及接收以控制仪器。
图31为示出根据各种实施方式文件如何在图形用户界面（GUI）与仪器之间传输的示意图。使用GUI可以创建和修改命令文件和卷文件。然后这些文件可被传输至仪器。通过使用FTP服务器来传输文件。
图32为示出根据各种实施方式利用文件传输协议（FTP）服务器上传文件的方法的流程图。为了上传文件，GUI向仪器发送TCP命令，请求FTP服务器的地址。一旦仪器对该信息响应，GUI连接至仪器并上传文件。如果该文件已经存在于FTP服务器上，那么用户会被问及保留该文件还是覆盖该文件。
为了下载文件，GUI向仪器发送TCP命令，请求FTP服务器的地址。一旦仪器对该信息响应，GUI连接至仪器并呈现可供下载的文件的列表。用户选择文件，随后GUI将该文件下载到本地计算机上的预定位置。
板堆叠器允许仪器的用户立刻加载多个板并运行它们，而不必须明确地加载和单独运行每个板组合。堆叠器被分成两个分隔部。每个分隔部加载有板。在运行时间，用户告知GUI运行哪个组合。GUI并不知道哪些板位于堆叠器中。通过指示仪器在仪器与堆叠器之间适当传输板及对板进行条形码编码的一系列TCP命令，GUI可指示仪器运行所有选择的组合。
在各种实施方式中，命令文件是例如定义了板之间的孔组合的文件。FTP服务器是文件的存放库。FTP服务器可与GUI和仪器进行通信。GUI向仪器发送命令并创建可存储在FTP服务器上的文件。仪器操作板，从GUI接收命令并与FTP服务器交互。板堆叠器是仪器的部件，其保持将在仪器上运转的板。TCP是允许在网络上发送信息的协议。其使用在GUI与仪器之间。卷文件是定义板的文件。其包含板条形码、板类型以及孔的体积。
端点检测系统
为了维持连续流动式PCR系统的高处理量，PCR系统需要能够同时检测两个或更多微通道中的荧光。测量两个或更多微通道的荧光对端点检测系统施加了一些限制。
例如，因为微通道数量的增加，检测器的视场也需要增大。这些微通道可以在透明微通道或管的阵列中紧密地捆或对准起来。但是，在管之间必须维持具有一定厚度的壁，以避免相邻微通道之间的串扰。因此，检测器的视场是关于管直径和管阵列壁厚度的函数。为了在管阵列的边缘处维持管的高荧光收集效率，可使用增加的射束长度。然而，从管阵列到检测器的射束长度的增加增大了端点检测系统的整体物理尺寸。
同样，激光器是用于荧光测量的典型的照明源。激光束的功率分布是高度非均匀性的。这种功率分布通常符合高斯分布并且指数地离轴下降。但是，连续流动式PCR系统的扩增系统需要具有一致的功率分布的照明源，以照射管阵列的整体宽度。
最后，由于样品在管阵列中的流动式连续的，因此PCR系统必须能够在一个时间步骤中检测两个或更多微通道的频谱信息。但是，为了将频谱信息分配给正确的样品，发射该频谱信息的具体管需要处于管阵列中。因此，除光谱信息之外，端点检测系统提供空间信息。
图33为根据各种实施方式的用于在连续流动式PCR系统中检测频谱和空间信息的系统3300的示意性侧视图。系统3300包括激光器3310，线发生器3320、管阵列3330、成像透镜3340、摄谱仪3350以及成像器3360。激光器3310发射电磁辐射3311的入射射束。
线发生器3320从激光3310接收入射射束3311。线发生器3320将该入射射束3311变换成电磁辐射3321的入射线。换句话说，线发生器3320使入射射束3311的功率分布从非一致分配转换成一致分配。例如，线发生器3320为Powell透镜。在各种实施方式中，线发生器3320是衍射线发生器。
管阵列3330从线发生器3320接收入射线3321。管阵列3330包括与PCR系统的一个或多个微通道流体连通的一个或多个透明管。在各种实施方式中，一个或多个光学元件3322放置在线发生器3320与管阵列3320之间，以将来自线发生器3320的入射线3321导引至管阵列3330。如图33所示，例如，一个或多个光学元件3322允许系统3300包装在整体较小体积中。在各种实施方式中，镜子3325还放置在线发生器3320和管阵列3330之间，以将来自线发生器3320的入射线3321导引至管阵列3330。例如，镜子3325允许管阵列3330水平地设置在系统3300中。
成像透镜3340接收来自管阵列3330的反射电磁辐射3331，并且使反射电磁辐射3331聚焦。在各种实施方式中，一个或多个光学元件（未图示）放置在管阵列3330与成像透镜3340之间，以将来自管阵列3330的反射电磁辐射3331导引至成像透镜3340。在各种实施方式中，镜子3325放置在管阵列3330与成像透镜3340之间，以将来自管阵列3330的反射电磁辐射3331导引至成像透镜3340。例如，成像透镜3340是具有可变孔的宽光圈（wide-iris）透镜。在各种实施方式中，成像透镜3340包括一个或多个滤光器（未示出）。例如，该一个或多个滤光器从反射电磁辐射3331中去除入射线3321的反射。
摄谱仪3350接收来自成像透镜3340的聚焦的反射电磁辐射。摄谱仪3350从该聚焦的反射电磁辐射检测频谱强度。例如，摄谱仪3350可检测400至800纳米内的光谱波长。
成像器3360接收来自成像透镜3340的聚焦的反射电磁辐射。成像器3360检测频谱强度的位置。例如，成像器3360是CCD照相机。
在各种实施方式中，系统3300还包括处理器（未示出）。该处理器接收来自摄谱仪3350的谱强度并接收来自成像器3360的位置。该处理器根据频谱强度和位置确定移动经过管阵列3330的样品的强度值。
图34为根据各种实施方式的用于在连续流动式PCR系统中检测频谱和空间信息的系统3400的示意性俯视图。
图35为根据各种实施方式的管阵列板的示意性三维视图。
图36为根据各种实施方式的管阵列板的示意性俯视图。
图37为根据各种实施方式的管阵列板的示意性侧视图。
图38为示出根据各种实施方式的用于检测连续PCR系统中的光谱和空间信息的方法3800的流程图。
在方法3800的步骤3810中，利用激光器发射电磁辐射的入射射束。
在步骤3820中，利用线发生器接收来自激光器的入射射束并通过将该入射射束变换成电磁辐射的入射线。
在步骤3830中，利用管阵列接收来自线发生器的入射线，其中该管阵列包括与PCR系统的一个或多个微通道流体连通的一个或多个透明管。
在步骤3840中，利用成像透镜接收来自管阵列的反射电磁辐射并使该反射电磁辐射聚焦。
在步骤3850中，利用摄谱仪接收来自成像透镜的聚焦的反射电磁辐射并从聚焦的反射电磁辐射检测频谱强度。
在步骤3860中，利用成像器接收来自成像透镜的聚焦的反射电磁辐射并检测频谱强度的位置。
尽管结合各种实施方式描述了本教导，但并非旨在使本教导限于这些实施方式。相反，如本领域技术人员将理解的，本教导包括各种替代、修改和等同。
另外，在描述各种实施方式时，说明书可能将本方法和/或过程表现为步骤的具体序列。然而，就该方法或过程不依赖于本文所阐述的步骤的具体顺序的程度来说，该方法或过程不应局限于所描述的步骤的具体顺序。如本领域普通技术人员应理解的，步骤的其他序列也是可能的。因此，说明书中所阐述的步骤的具体顺序不应解释为对权利要求的限制。另外，涉及方法和/或过程的权利要求不应当局限于以所描述的顺序执行这些步骤，并且本领域技术人员可以容易地理解序列是可以改变的并且仍保持在各种实施方式的精神和范围内。

Claims (20)

1.一种用于高处理量聚合酶链式反应（PCR）扩增和分析的系统，包括：
PCR系统；以及
处理器，与所述PCR系统通信，所述处理器
指示所述PCR系统的液体处理系统获得用于PCR实验的多个样品和多个试剂，
指示所述PCR系统的流体泵送系统维持输送流体通过多个微通道的连续流动，以接收作为所述多个微通道中的小滴的来自所述液体处理系统的所述多个样品和所述多个试剂，并利用所述多个微通道的几何形状混合所述多个样品与所述多个试剂，从而在所述多个微通道中产生多个混合样品小滴，
从所述PCR系统的桥后检测系统接收用于所述多个混合样品小滴中每个混合样品小滴的一个或多个桥后检测值，以确定所述每个混合样品小滴是否正确地混合，
指示所述PCR系统的热循环仪维持一个或多个温度，所述一个或多个温度用于使所述多个微通道中的所述多个混合样品小滴的温度循环，以及
从所述PCR系统的端点检测系统接收用于所述多个混合样品小滴中每个混合样品小滴的一个或多个端点检测值，以对所述PCR实验进行分析。
2.如权利要求1所述的系统，其中所述处理器通过指示所述液体处理系统从第一样品支承设备吸移样品、从第二样品支承设备吸移测定试剂以及从容器吸移主混合物试剂，指示所述液体处理系统获得用于PCR实验的多个样品和多个试剂。
3.如权利要求1所述的系统，其中所述一个或多个桥后检测值包括所述每个混合样品小滴的时间戳。
4.如权利要求1所述的系统，其中所述一个或多个桥后检测值包括由所述每个混合样品小滴吸收或反射的电磁辐射的强度。
5.如权利要求1所述的系统，其中所述一个或多个桥后检测值包括：
电磁辐射的第一强度，该电磁辐射由所述每个混合样品小滴的样品的第一染料发射；
电磁辐射的第二强度，该电磁辐射由所述每个混合样品小滴的测定试剂的第二染料发射；以及
电磁辐射的第三强度，该电磁辐射由所述每个混合样品小滴的主混合物试剂的第三染料发射。
6.如权利要求1所述的系统，其中，如果所述处理器根据所述一个或多个桥后检测值确定所述每个混合样品小滴没有正确地混合，所述处理器还指示所述液体处理系统对所述每个混合样品小滴的样品和测定试剂进行重新采样。
7.如权利要求1所述的系统，其中所述一个或多个端点检测值包括所述多个微通道的微通道的位置和从该微通道检测的频谱强度。
8.一种用于高处理量聚合酶链式反应（PCR）扩增和分析的方法，包括：
使用处理器指示所述PCR系统的液体处理系统获取用于PCR实验的多个样品和多个试剂；
使用所述处理器指示所述PCR系统的流体泵送系统维持输送流体通过多个微通道的连续流动，以接收作为所述多个微通道中的小滴的来自所述液体处理系统的所述多个样品和所述多个试剂，并利用所述多个微通道的几何形状混合所述多个样品与所述多个试剂，从而在所述多个微通道中产生多个混合样品小滴；
使用所述处理器从所述PCR系统的桥后检测系统接收用于所述多个混合样品小滴的每个混合样品小滴的一个或多个桥后检测值，以确定所述每个混合样品小滴是否正确地混合；
使用所述处理器指示所述PCR系统的热循环仪维持一个或多个温度，所述一个或多个温度用于循环所述多个微通道中的所述多个混合样品小滴的温度；以及
使用所述处理器从所述PCR系统的端点检测系统接收用于所述多个混合样品小滴中每个混合样品小滴的一个或多个端点检测值，以对所述PCR实验进行分析。
9.如权利要求8所述的方法，其中指示液体处理系统获得用于PCR实验的多个样品和多个试剂包括指示所述液体处理系统从第一样品支承设备吸移样品、从第二样品支承设备吸移测定试剂以及从容器吸移主混合物试剂。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述一个或多个桥后检测值包括所述每个混合样品小滴的时间戳。
11.如权利要求8所述的方法，其中所述一个或多个桥后检测值包括由所述每个混合样品小滴吸收或反射的电磁辐射的强度。
12.如权利要求8所述的方法，其中所述一个或多个桥后检测值包括：
电磁辐射的第一强度，该电磁辐射由所述每个混合样品小滴的样品的第一染料发射；
电磁辐射的第二强度，该电磁辐射由所述每个混合样品小滴的测定试剂的第二染料发射；以及
电磁辐射的第三强度，该电磁辐射由所述每个混合样品小滴的主混合物试剂的第三染料发射。
13.如权利要求8所述的方法，还包括：如果根据所述一个或多个桥后检测值确定所述每个混合样品小滴没有正确地混合，使用所述处理器来指示所述液体处理系统对所述每个混合样品小滴的样品和测定试剂进行重新采样。
14.如权利要求8所述的方法，其中所述一个或多个端点检测值包括所述多个微通道的微通道的位置和从该微通道检测的频谱强度。
15.一种计算机程序产品，包括非瞬时且有形的计算机可读存储媒介，其内容包括具有指令的程序，所述指令在处理器上执行以执行用于高处理量聚合酶链式反应（PCR）扩增和分析的方法，所述方法包括：
提供系统，其中所述系统包括一个或多个不同软件模块，所述不同软件模块包括液体处理模块、流体泵送模块、桥后检测模块、热循环仪模块以及端点检测模块；
利用所述液体处理模块指示所述PCR系统的液体处理系统获得用于PCR实验的多个样品和多个试剂；
利用所述流体泵送模块指示所述PCR系统的流体泵送系统维持输送流体通过多个微通道的连续流动，以接收作为所述多个微通道中的小滴的来自所述液体处理系统的所述多个样品和所述多个试剂，并利用所述多个微通道的几何形状混合所述多个样品与所述多个试剂，从而在所述多个微通道中产生多个混合样品小滴；
利用所述桥后检测系统从所述PCR系统的桥后检测系统接收用于所述多个混合样品小滴中每个混合样品小滴的一个或多个桥后检测值，以确定所述每个混合样品小滴是否正确地混合；
利用所述热循环仪模块指示所述PCR系统的热循环仪所述维持一个或多个温度，所述一个或多个温度用于循环所述多个微通道中的所述多个混合样品小滴的温度；以及
利用所述端点检测模块从所述PCR系统的端点检测系统接收用于所述多个混合样品小滴中每个混合样品小滴的一个或多个端点检测值，以对所述PCR实验进行分析。
16.如权利要求15所述的计算机程序产品，其中指示液体处理系统获得用于PCR实验的多个样品和多个试剂包括：指示所述液体处理系统从第一样品支承设备吸移样品、从第二样品支承设备吸移测定试剂以及从容器吸移主混合物试剂。
17.如权利要求15所述的计算机程序产品，其中所述一个或多个桥后检测值包括所述每个混合样品小滴的时间戳。
18.如权利要求15所述的计算机程序产品，其中所述一个或多个桥后检测值包括通过所述每个混合样品小滴吸收或反射的电磁辐射的强度。
19.如权利要求15所述的计算机程序产品，其中所述一个或多个桥后检测值包括：
电磁辐射的第一强度，该电磁辐射由所述每个混合样品小滴的样品的第一染料发射；
电磁辐射的第二强度，该电磁辐射由所述每个混合样品小滴的测定试剂的第二染料发射；以及
电磁辐射的第三强度，该电磁辐射由所述每个混合样品小滴的主混合物试剂的第三染料发射。
20.如权利要求15所述的计算机程序产品，还包括：如果根据所述一个或多个桥后检测值确定所述每个混合样品小滴没有正确地混合，指示所述液体处理系统使用所述液体处理模块对所述每个混合样品小滴的样品和测定试剂进行重新采样。
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