CN103725747A - 一种细菌对抗生素敏感性的鉴定方法及其设备 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物领域，特别涉及一种细菌对抗生素敏感性的鉴定方法及其设备。该方法包括：分别对已知的敏感菌、中度敏感菌和耐药菌进行抗生素诱导；提取细胞内代谢产物；对细胞内代谢产物进行质谱分析，得到质谱图；将质谱图所含有的信息转化为特征峰形式并将其对应的代谢物波峰值进行聚类分析，分别得到敏感、中度敏感和具有耐药性的菌株的聚类图谱，去掉分类错误的菌株，保存得到数据库；同样的步骤处理待测菌，将待测菌的代谢物波峰值与已得到的数据库合并，重新进行分类，得到待测菌在聚类图谱中的位置，由此得到待测菌的抗生素敏感性。本发明提供的细菌对抗生素敏感性的鉴定方法及其设备，缩短了鉴定需要的时间。

Description

一种细菌对抗生素敏感性的鉴定方法及其设备
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体而言，涉及一种细菌对抗生素敏感性的鉴定方法及其设备。
背景技术
药物敏感试验简称药敏试验（或耐药试验），是为了了解病原微生物对各种抗生素的敏感（或耐受）程度，以指导临床合理选用抗生素药物。
目前检测细菌对抗生素的敏感性常采用比浊法，是根据细菌在含有抗生素溶液中生长的数量状况来鉴定，但是，抗生素杀死细菌的过程是比较复杂的，有时细菌在刚接触抗生素时部分细菌被杀死，浊度下降，但由于部分细菌被诱导产酶后，细菌又开始重新生长，因此，检测细菌浊度的变化来得知对药物的敏感性需要较长时间来得到细菌对抗生素的敏感性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种细菌对抗生素敏感性的鉴定方法，以解决上述的问题。
在本发明的实施例中提供的一种细菌对抗生素敏感性的鉴定方法，包括下列步骤：（a）分别取多个同一菌种的已知对某一抗生素敏感、中度敏感和具有耐药性的菌株，分别对其进行抗生素诱导；
（b）分别将诱导后的菌株进行细胞内代谢产物的提取；
（c）分别对提取的细胞内代谢产物进行质谱分析，得到敏感菌质谱图，中敏菌质谱图和耐药菌质谱图；
（d）分别将敏感菌质谱图，中敏菌质谱图和耐药菌质谱图所含有的信息转化为特征峰形式；
（e）分别将特征峰形式对应的代谢物波峰值进行聚类分析，分别得到敏感、中度敏感和具有耐药性的菌株的聚类图谱，并将三者的数据进行保存得到数据库；
（f）取相同菌种的待测菌，重复步骤（a）-（d），将待测菌的代谢物波峰值与已得到的数据库合并，以相关度作为聚类参数进行分类，得到待测菌在聚类图谱中的位置，由此得到待测菌的抗生素敏感性。
优选地，所述同一菌种取自肠杆菌科、微球菌科、假单胞菌科、伯克氏菌科、李斯特菌科、链球菌科。
优选地，所述肠杆菌科包括不动杆菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、埃希氏菌属、克雷伯氏菌属、摩根菌属、苍白杆菌属、巴氏杆菌属、变形杆菌属、沙门氏菌属和沙雷氏菌属；
所述微球菌科包括葡萄球菌属；
所述假单胞菌科包括假单胞菌属；
所述伯克氏菌科包括伯克氏菌属；
所述李斯特菌科包括李斯特菌属；
所述链球菌科包括肠球菌属和链球菌属。
优选地，在所述步骤（a）中，所述抗生素诱导采用CLSI推荐的步骤进行。
优选地，在步骤（a）中，诱导时间为4-6h。
优选地，在步骤（a）中，诱导时间为4h。
优选地，在所述步骤（b）中，细胞内代谢产物的提取采用甲醇-氯仿法。
优选地，在所述步骤（e）中，进行所述聚类分析时，分类数量选择为3-8，且聚类错误的菌株数量低于总数量的5%，且去掉其数据。
本发明还提供了细菌对抗生素敏感性的鉴定方法的设备，包括：进样系统、分离系统、质谱系统、数据分析系统和报告系统；
所述进样系统为放置样品的部位；
所述分离系统将代谢提取物成分分开；
所述质谱系统对所述分开的代谢提取物成分进行质谱检测，得到质谱图；
所述数据分析系统将质谱图信息转化为特征峰形式的数据并获取数据库的信息对样品进行聚类定位；
所述报告系统是将样品聚类定位的信息输出。
本发明以已知对某一抗生素敏感、中度敏感和具有耐药性的同一菌种中的菌株为材料，由于诱导后的菌株中细胞内代谢产物成分的不同，将其进行聚类分析，得到敏感菌、中度敏感菌和具有耐药菌的聚类图谱，通过对待测菌与聚类图谱比较，得到待测菌在聚类图谱中的位置，以此进行鉴定，缩短了鉴定需要的时间。
附图说明
图1示出了本发明实施例1中大肠埃希菌对头孢他啶的敏感菌质谱图；
图2示出了本发明实施例1中大肠埃希菌对头孢他啶的中度敏感菌质谱图；
图3示出了本发明实施例1中大肠埃希菌对头孢他啶的耐药菌质谱图；
图4示出了本发明实施例1中大肠埃希菌对头孢他啶的敏感性数据库的聚类树状图；
图5示出了本发明实施例1测定的待测大肠埃希菌的聚类定位图；
图6示出了本发明实施例2中金黄色葡萄球菌对青霉素G的敏感菌质谱图；
图7示出了本发明实施例2中金黄色葡萄球菌对青霉素G的中度敏感菌质谱图；
图8示出了本发明实施例2中金黄色葡萄球菌对青霉素G的耐药菌质谱图；
图9示出了本发明实施例2中金黄色葡萄球菌对青霉素G的敏感性数据库的聚类树状图；
图10示出了本发明实施例2测定的待测金黄色葡萄球菌的聚类定位图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例子对本发明做进一步的详细描述。
一种细菌对抗生素敏感性的鉴定方法，包括下列步骤：
（a）分别取多个同一菌种的已知对某一抗生素敏感、中度敏感和具有耐药性的菌株，分别对其进行抗生素诱导；
（b）分别将诱导后的菌株进行细胞内代谢产物的提取；
（c）分别对提取的细胞内代谢产物进行质谱分析，得到敏感菌质谱图，中敏菌质谱图和耐药菌质谱图；
（d）分别将敏感菌质谱图，中敏菌质谱图和耐药菌质谱图所含有的信息转化为特征峰形式；
（e）分别将特征峰形式对应的代谢物波峰值进行聚类分析，分别得到敏感、中度敏感和具有耐药性的菌株的聚类图谱，去掉分类错误的菌株，将三者的数据进行保存得到数据库；
（f）取同一菌种的待测菌，重复步骤（a）-（d），将待测菌的代谢物波峰值与已得到的数据库合并，以相关度作为聚类参数进行分类，得到待测菌在聚类图谱中的位置，由此得到待测菌的抗生素敏感性。
分别取多个同一菌种的已知对某一抗生素敏感、中度敏感和具有耐药性的菌株，多个是为了得到的数据库具有统计学意义。
所采用的菌株为常见的致病菌株，其对抗生素的敏感已知。具体地，所述同一菌种取自肠杆菌科、微球菌科、假单胞菌科、伯克氏菌科、李斯特菌科、链球菌科；
所述肠杆菌科包括不动杆菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、埃希氏菌属、克雷伯氏菌属、摩根菌属、苍白杆菌属、巴氏杆菌属、变形杆菌属、沙门氏菌属和沙雷氏菌属；
所述微球菌科包括葡萄球菌属；
所述假单胞菌科包括假单胞菌属；
所述伯克氏菌科包括伯克氏菌属；
所述李斯特菌科包括李斯特菌属；
所述链球菌科包括肠球菌属和链球菌属。
优选地，在所述步骤（a）中，所述抗生素诱导采用CLSI推荐的步骤进行。CLSI即美国临床实验室标准化协会，其对于已知致病菌对抗生素的敏感性研究的最为权威，得到临床检测界的普遍认可。因此，对已知致病菌的抗生素诱导选择CLSI推荐的步骤进行，比较客观和公正。MIC配置为最低的有效抑菌浓度，检测灵敏可靠。
本发明中菌株对抗生素的敏感性根据纸片法的标准分为三种，分别为敏感，中度敏感和具有耐药性。敏感是指抑菌圈直径大于14mm；中度敏感为抑菌圈直径大于等于10mm，小于等于14mm；具有耐药性为抑菌圈直径小于10mm。
为了符合临床检测的标准，用MIC配置的抗生素对已知致病菌诱导不同的时间，为了缩短检测需要的时间，诱导时间为4-6h，得到的聚类图谱可以区分开敏感、中度敏感和具有耐药性的菌株，且分类的错误率在5%以下，符合临床检测的标准。因此，优选地，诱导时间为4-6h。
为了更快速的检测细菌对抗生素敏感性，优选地，诱导时间为4h。
本试验分别选用了常用的细胞内代谢产物的提取方法：醇-氯仿、酸碱法、热甲醇法，将提取后的细胞代谢产物分别进行质谱分析，得到采用醇-氯仿提取细胞内代谢产物其成分有230种，酸碱法提取细胞内代谢产物其成分有187种、热甲醇法提取细胞内代谢产物其成分有211种。优选地，在所述步骤（b）中，细胞内代谢产物的提取采用甲醇-氯仿法。
在所述步骤（e）中，进行所述聚类分析时，分类数量选择为3-8。
一种细菌对抗生素敏感性的鉴定方法的设备，包括：进样系统、分离系统、质谱系统、数据分析系统和报告系统；
所述进样系统为放置样品的部位；
所述分离系统将代谢提取物成分分开；
所述质谱系统对所述分开的代谢提取物成分进行质谱检测，得到质谱图；
所述数据分析系统将质谱图信息转化为特征峰形式的数据并获取数据库的信息对样品进行聚类定位；
所述报告系统是将样品聚类定位的信息输出。
本仪器是根据细菌对抗生素敏感性的鉴定方法的原理进行制备的，得到的检测细菌对某一抗生素的敏感性的仪器使用简便快捷。
本发明分别对表1中的细菌种类对相应抗生素的敏感性采用本发明提供的方法进行了数据库的构建，同时，各取多株待测菌对抗生素的敏感性进行了鉴定。表2为抗生素名称缩写对照表。在进行某一菌种对相对应的抗生素的敏感性进行数据库的构建时，各取多株已知对某一抗生素敏感、中度敏感和具有耐药性的菌株，取多株是为了使得到的数据库具有统计学意义，增加鉴定的准确度。之后，各取多株待测菌对抗生素的敏感性进行了鉴定，准确率均在95%以上。
表1细菌种类
Figure BDA0000462582180000091
表2抗生素名称缩写对照表
英文缩写 化学名 英文缩写 化学名
AMC 阿莫西林/棒酸 AMP 氨苄西林
AMK 阿米卡星 ATM 氨曲南
CAZ 头孢他啶 CIP 环丙沙星
CFP 头孢哌酮 CLI 克林霉素
CSL 头孢哌酮/舒巴坦 CXM 头孢呋辛
CTX 头孢噻肟 CZ 头孢唑林
ERY 红霉素 FOX 头孢西丁
FEP 头孢吡肟 GEH 高浓度庆大
GEN 庆大霉素 LEV 左氧氟沙星
IPM 亚胺培南 MEM 美洛培南
MNO 米诺环素 PEN 青霉素G
NIT 呋喃妥因 PIP 吡哌酸
RD 利福平 SXT 复方新诺明
SAM 氨苄西林/舒巴坦 TZP 哌拉西林
VA 万古霉素 LIN 林可霉素
由于某一菌种对相应抗生素敏感性的数据库的构建及对待测菌的鉴定所采用的方法相同，因此，不再一一列举，仅以大肠埃希菌对头孢他啶的敏感性和金黄色葡萄球菌对青霉素G的敏感性为例进行详细说明，详见实施例1和实施例2。
实施例1
大肠埃希菌对头孢他啶敏感性数据库建立以及待测大肠埃希菌对头孢他啶敏感性的鉴定。
（a）分别取60株已知对头孢他啶敏感的大肠埃希菌，50株已知对头孢他啶中度敏感大肠埃希菌，30株已知耐头孢他啶的大肠埃希菌；按CLSI推荐的ATCC25922对头孢他啶耐药MIC配置对菌株进行抗生素诱导，具体为：将每个菌株分别用0.9%生理盐水配成0.5麦氏单位；分别取0.4ml浓度为80μg/ml的头孢他啶加入1.6mlMH肉汤中，然后分别加入菌株悬浊液1ml，于37℃培养4小时。
（b）将培养液4℃离心，得沉淀物，加入1.5ml-45℃冷甲醇（灭活和提取双重作用）和0.75ml冷纯水，涡旋震荡混合，再加入-45℃氯仿1.5ml涡旋震荡混合，4℃下保存10分钟，在8000g下10分钟4℃离心，取上清液2ml，0.22μm针孔式滤膜过滤，过滤液装入低温管冻干，得到提取物，残留细菌活性被完全终止。
（c）将每个菌株的提取物分别溶于50μl吡啶中，涡旋震荡10分钟。加入60μl双三氟乙酰胺75℃硅烷化30分钟，取1μl于GC-MS进样。选择DB-5MS柱，0.25μm×30m×0.25mm，温度为280℃（柱温起始70℃保持5分钟，每分钟增加5℃并保持5分钟，最后增加到280℃），分流比10:1，流动相氦35.0cm/s，平衡时间3分钟。ESI质谱条件：扫描范围100-800m/z，间隔5s，检测器接口电压0.9KV，扫描速度1000u/s，ESI温度200℃，接口280℃，溶剂去除时间为6分钟。最后分别得到敏感菌、中敏菌、耐药菌的质谱图。分别于敏感菌、中敏菌、耐药菌的菌株中选取一株菌，质谱图如图1-图3所示，图1为敏感菌质谱图，图2为中敏菌质谱图，图3为耐药菌质谱图。
（d）分别将敏感菌质谱图，中敏菌质谱图和耐药菌质谱图导入MSFACTS软件，样本标号：敏感菌标记为敏1～敏60，中度敏感标记为中1～中50，耐药菌标记为耐1～耐30；进行基线校正（重叠峰匹配，峰对齐，数据标准化后得到代谢物特征峰），转化贮存为EXCEL格式的代谢物特征波峰列表。
（e）将数据EXCEL代谢物特征波峰列表导入多变量分析软件SPSS（一种通用的统计数据软件），选择谱系聚类，分类数量选择：3-8，系统将自动进行分类，得到耐药表型相似性关系树状谱，只有一个敏感菌被分到中敏菌区，去掉这个菌株的数据，得到图4。如图1所示，敏感菌、中敏菌、耐药菌被明显地区分。将准确的代谢物树状谱的数据命名为“大肠埃希菌对头孢他啶代谢物”，并储存到数据库中。
（f）分别取20株已知对头孢他啶敏感，中度敏感和具有耐药性的大肠埃希菌，进行步骤（a）-（b），然后放入本发明提供的细菌对抗生素敏感性的鉴定方法的设备中的进样系统，该设备对样品进行质谱分析，得到待测菌株的质谱图，然后将其转化为特征峰形式，将待测菌的代谢物波峰值与已得到的数据库“大肠埃希菌对头孢他啶代谢物”合并，以相关度作为聚类参数自动进行分类，得到该待测大肠埃希菌在聚类图谱中的位置，见图5。由此得到所有待测大肠埃希菌对头孢他啶的敏感性，所取样品测定结果都准确。
实施例2
金黄色葡萄球菌对青霉素G敏感性数据库建立以及待测金黄色葡萄球菌对青霉素G敏感性的鉴定。
（a）分别取60株已知对青霉素G敏感的金黄色葡萄球菌，50株已知对青霉素G中度敏感金黄色葡萄球菌，30株已知耐青霉素G的金黄色葡萄球菌；按CLSI推荐的ATCC29213对青霉素G耐药MIC配置对菌株进行抗生素诱导，具体为：将每个菌株分别用0.9%生理盐水配成0.5麦氏单位；分别取0.4ml浓度为1.25μg/ml的青霉素G加入1.6ml MH肉汤中，然后分别加入菌株悬浊液1ml，于37℃培养4小时。
（b）将培养液4℃离心，得沉淀物，加入1.5ml-45℃冷甲醇（灭活和提取双重作用）和0.75ml冷纯水，涡旋震荡混合，再加入-45℃氯仿1.5ml涡旋震荡混合，4℃下保存10分钟，在8000g下10分钟4℃离心，取上清液2ml，0.22μm针孔式滤膜过滤，过滤液装入低温管冻干，得到提取物，残留细菌活性被完全终止。
（c）将每个菌株的提取物分别溶于50μl吡啶中，涡旋震荡10分钟。加入60μl双三氟乙酰胺75℃硅烷化30分钟，取1μl于GC-MS进样。选择DB-5MS柱，0.25μm×30m×0.25mm，温度为280℃（柱温起始70℃保持5分钟，每分钟增加5℃并保持5分钟，最后增加到280℃），分流比10:1，流动相氦35.0cm/s，平衡时间3分钟。ESI质谱条件：扫描范围100-800m/z，间隔5s，检测器接口电压0.9KV，扫描速度1000u/s，ESI温度200℃，接口280℃，溶剂去除时间为6分钟。最后分别得到敏感菌、中敏菌、耐药菌的质谱图。分别于敏感菌、中敏菌、耐药菌的菌株中选取一株菌，质谱图如图6-8所示，图6为敏感菌质谱图，图7为中敏菌质谱图，图8为耐药菌质谱图。
（d）分别将敏感菌质谱图，中敏菌质谱图和耐药菌质谱图导入MSFACTS软件，样本标号：敏感菌标记为敏1～敏60，中度敏感标记为中1～中50，耐药菌标记为耐1～耐30；进行基线校正（重叠峰匹配，峰对齐，数据标准化后得到代谢物特征峰），转化贮存为EXCEL格式的代谢物特征波峰列表。
（e）将数据EXCEL代谢物特征波峰列表导入多变量分析软件SPSS（一种通用的统计数据软件），选择谱系聚类，分类数量选择：3-8，系统将自动进行分类，得到耐药表型相似性关系树状谱，只有一个中敏菌被分到耐药菌区，去掉这个菌株的数据，得到图9。如图3所示，敏感菌、中敏菌、耐药菌被明显地区分。将代谢物树状谱的数据命名为“金黄色葡萄球菌对青霉素G代谢物”，并储存到数据库中。
（f）分别取20株已知对青霉素G敏感，中度敏感和具有耐药性的金黄色葡萄球菌，进行步骤（a）-（b），然后放入本发明提供的细菌对抗生素敏感性的鉴定方法的设备中的进样系统，该设备对样品进行质谱分析，得到待测菌株的质谱图，然后将其转化为特征峰形式，将待测菌的代谢物波峰值与已得到的数据库“金黄色葡萄球菌对青霉素G代谢物”合并，以相关度作为聚类参数自动进行分类，得到该待测金黄色葡萄球菌在聚类图谱中的位置，见图10。由此得到所有待测金黄色葡萄球菌对青霉素G的敏感性，所取样品测定结果都准确。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种细菌对抗生素敏感性的鉴定方法，其特征在于，包括下列步骤：
（a）分别取多个同一菌种的已知对某一抗生素敏感、中度敏感和具有耐药性的菌株，分别对其进行抗生素诱导；
（b）分别将诱导后的菌株进行细胞内代谢产物的提取；
（c）分别对提取的细胞内代谢产物进行质谱分析，得到敏感菌质谱图，中敏菌质谱图和耐药菌质谱图；
（d）分别将敏感菌质谱图，中敏菌质谱图和耐药菌质谱图所含有的信息转化为特征峰形式；
（e）将特征峰形式对应的代谢物波峰值进行聚类分析，分别得到敏感、中度敏感和具有耐药性的菌株的聚类图谱，去掉分类错误的菌株，将三者的数据进行保存得到数据库；
（f）取相同菌种的待测菌，重复步骤（a）-（d），将待测菌的代谢物波峰值与已得到的数据库合并，以相关度作为聚类参数进行分类，得到待测菌在聚类图谱中的位置，由此得到待测菌的抗生素敏感性。
2.根据权利要求1所述的一种细菌对抗生素敏感性的鉴定方法，其特征在于，所述同一菌种取自肠杆菌科、微球菌科、假单胞菌科、伯克氏菌科、李斯特菌科或链球菌科。
3.根据权利要求2所述的一种细菌对抗生素敏感性的鉴定方法，其特征在于，所述肠杆菌科包括不动杆菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、埃希氏菌属、克雷伯氏菌属、摩根菌属、苍白杆菌属、巴氏杆菌属、变形杆菌属、沙门氏菌属和沙雷氏菌属；
所述微球菌科包括葡萄球菌属；
所述假单胞菌科包括假单胞菌属；
所述伯克氏菌科包括伯克氏菌属；
所述李斯特菌科包括李斯特菌属；
所述链球菌科包括肠球菌属和链球菌属。
4.根据权利要求1所述的一种细菌对抗生素敏感性的鉴定方法，其特征在于，在所述步骤（a）中，所述抗生素诱导采用CLSI推荐的步骤进行。
5.根据权利要求4所述的一种细菌对抗生素敏感性的鉴定方法，其特征在于，在步骤（a）中，诱导时间为4-6h。
6.根据权利要求4所述的一种细菌对抗生素敏感性的鉴定方法，其特征在于，在步骤（a）中，诱导时间为4h。
7.根据权利要求1所述的一种细菌对抗生素敏感性的鉴定方法，其特征在于，在所述步骤（b）中，细胞内代谢产物的提取采用甲醇-氯仿法。
8.根据权利要求1所述的一种细菌对抗生素敏感性的鉴定方法，其特征在于，在所述步骤（e）中，进行所述聚类分析时，分类数量选择为3-8。
9.一种用于实施权利要求1-8任意一项所述的细菌对抗生素敏感性的鉴定方法的设备，其特征在于，包括：进样系统、分离系统、质谱系统、数据分析系统和报告系统；
所述进样系统为放置样品的部位；
所述分离系统将代谢提取物成分分开；
所述质谱系统对所述分开的代谢提取物成分进行质谱检测，得到质谱图；
所述数据分析系统将质谱图信息转化为特征峰形式的数据并获取数据库的信息对样品进行聚类定位；
所述报告系统是将样品聚类定位的信息输出。
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