多巴反应性肌张力障碍相关基因突变、其检测方法及其用途
技术领域
本发明属于分子病理学领域,特别涉及多巴反应性肌张力障碍相关基因突变。
背景技术
在1976年,多巴反应性肌张力障碍(dopa responsive dystonia,DRD)首次被Segawa等报道,被称为伴有明显昼间波动的遗传性进行性肌张力障碍(hereditary progressive dystonia with marked diurnalfluctuation,HPD)或Segawa病(Segawa M,Hosaka A,Miyagawa F,et al.Hereditary progressive dystonia with marked diumalfluctuation.Adv Neuro,1976,14:215-233.)。DRD是一种少见的遗传性运动障碍疾病,常发于儿童或青少年,以肌张力障碍或步态异常为首发症状,发病率约为每百万人0.5-1例(Segawa M,Nomura Y,Nishiyama N.Autosomal dominant guanosine triphosphatecyclohydrolase I deficiency(Segawa disease).Ann Neurol 2003:54(Suppl6):S32–45.)。
大多数DRD呈常染色体显性遗传(autosomal dominan,AD),致病基因为三磷酸鸟苷环化水解酶I基因(guanosine triphosphatecyclohydrolase I,GCH1);少数呈常染色体隐性遗传(autosomalrecessive,AR),致病基因为酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylabe,TH)基因;个别可呈散发性。
随着分子遗传学研究的发展,已发现70多种位于GCH1基因编码区或内含子外显子结合区的不同突变;其中约52%为错义突变,17%为无义突变,11%为剪切点突变,20%为缺失或插入突变。目前,在AR-DRD家系中已报道的8种TH基因突变(3种纯合子突变,5种复合杂合子突变),主要位于外显子内,仅有1种突变位于内含子内。外显子内的突变中,除第14外显子的1493A→G突变导致TH四聚体区的氨基酸改变外,其余突变均导致TH催化区内不同位点的氨基酸改变,对TH的结构与功能产生不同程度的影响,第11内含子的分支点序列内24T→A突变可引起其他分支点序列的启动,导致TH的Pre-mRNA剪接错误,产生错误的mRNA,从而导致了整个遗传信息的改变。
多巴反应性肌张力障碍(DRD)常染色体隐性遗传家系TH基因的新突变发现,有利于完善DRD患者的分子诊断,也可为研究DRD的发病机理提供重要线索。
因此,本领域仍然需要发现DRD相关的TH基因突变,以及检测DRD相关疾病的方法。
发明内容
本发明人经过不懈的努力,发现了多巴反应性肌张力障碍(DRD)常染色体隐性遗传家系TH基因的新突变,并由此提供了下述发明:
本发明涉及多巴反应性肌张力障碍(DRD)常染色体隐性遗传家系TH基因新的复合杂合错义突变,具体为:c.1004C>T(p.A335V)和c.1451G>A(p.R484H)。
在第一方面,本发明涉及DRD的生物标记物,即突变的TH基因或TH蛋白,所述生物标记物是具有选自如下的突变的TH基因或TH蛋白:
错义突变(c.1004C>T,p.A335V);
错义突变(c.1451G>A,p.R484H)。
在一个实施方案中,本发明的突变TH基因为具有以下突变的SEQID NO:1:
错义突变c.1004C>T;和/或
错义突变c.1451G>A。
在一个实施方案中,本发明的突变的TH蛋白为具有以下突变的SEQID NO:2:
错义突变p.A335V;和/或
错义突变p.R484H。
在第二方面,本发明涉及一种检测DRD的方法,所述方法包括检测受试者的TH基因或TH蛋白中是否存在突变位点,如果有突变位点,则所述受试者被鉴定为患有DRD或易患DRD,或者其后代会患有DRD或易患DRD,所述突变位点选自如下任一种或其组合:
错义突变(c.1004C>T,p.A335V);和
错义突变(c.1451G>A,p.R484H)。
在一个实施方案中,TH蛋白为SEQ ID NO:2的序列表示。
在一个实施方案中,TH基因为SEQ ID NO:1的序列表示。
在一个实施方案中,本发明的检测DRD的方法包括如下至少一组引物扩增的步骤:
SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4;
SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。
在一个实施方案中,本发明的检测DRD的方法中检测突变位点通过选自如下的技术进行:测序、电泳、核酸杂交、原位杂交、PCR、逆转录酶链反应和变性高效液相色谱。
在本发明第二方面的方法中,优选检测纯合的突变TH基因。
在第三方面,本发明涉及一种检测突变TH基因或TH蛋白的方法,所述方法包括检测受试者的TH基因或TH蛋白中是否存在突变位点,所述突变位点选自如下任一种或其组合:
错义突变(c.1004C>T,p.A335V);和
错义突变(c.1451G>A,p.R484H)。
在一个实施方案中,TH蛋白为SEQ ID NO:2的序列表示。
在一个实施方案中,TH基因为SEQ ID NO:1的序列表示。
在一个实施方案中,本发明的检测突变TH基因或TH蛋白的方法包括如下至少一组引物扩增的步骤:
SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4;
SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。
在一个实施方案中,本发明的检测突变TH基因或TH蛋白的方法中检测突变位点通过选自如下的技术进行:测序、电泳、核酸杂交、原位杂交、PCR、逆转录酶链反应和变性高效液相色谱。
在第四方面,本发明涉及通过PCR检测突变TH基因或TH蛋白中使用的引物对,所述突变是选自如下任一种或其组合:
错义突变(c.1004C>T,p.A335V);和/或
错义突变(c.1451G>A,p.R484H),
其中所述引物对分别基于选自如下的位置在基因组序列或cDNA序列上前后设计,使得扩增该位置:cDNA序列第1004位和第1451位。
在第五方面,本发明涉及与突变TH基因互补的核酸探针,所述突变是选自如下任一种或其组合:
错义突变c.1004C>T;和/或
错义突变c.1451G>A,
所述探针与突变TH基因的互补区包括选自如下的基因组序列或cDNA序列上的位置:cDNA序列第1004位和第1451位。
在第六方面,本发明涉及检测突变TH基因或TH蛋白的试剂盒,包含一组或多组引物对,其中所述突变是选自如下任一种或其组合:
错义突变(c.1004C>T,p.A335V);和
错义突变(c.1451G>A,p.R484H),
其中所述引物对分别基于选自如下的位置在基因组序列或cDNA序列上设计,使得其扩增产物涵盖该位置:cDNA序列第1004位和第1451位。
在一个实施方案中,所述检测突变TH基因或TH蛋白的试剂盒包含选自如下的至少一组引物:
SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4;
SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。
在第七方面,本发明涉及检测突变TH基因的试剂盒,包含一个或多个核酸探针,所述突变是选自如下任一种或其组合:
错义突变c.1004C>T;和
错义突变c.1451G>A,
所述探针与突变TH基因上包含选自如下位置的基因组序列或cDNA序列上的区域互补:cDNA序列第1004位和第1451位。
在第八方面,本发明涉及TH基因的突变外显子9和/或突变外显子14。
在本发明中,引物对SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4用于扩增TH基因的野生型或突变外显子9;引物对SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6用于扩增TH基因的野生型或突变外显子14。
本发明发现了多巴反应性肌张力障碍相关基因的2个新的突变位点,对该基因位点的检测可能用于DRD患者的辅助诊断,并且可能有利于明确DRD患者的分子诊断。因此,本发明的检测突变TH基因或TH蛋白的方法可以用于诊断DRD的目的,例如产前诊断、植入前遗传学诊断(PGD)、患者筛查。然而,本发明的方法并不仅限于用于诊断疾病的目的。
另外,本发明的检测突变TH基因或TH蛋白的方法也可以用于非诊断疾病的目的。所述的非检测疾病的目的包括但不限于研究SNP分布和多态性,用于家族演化研究。本发明可以对DRD的发病机理提供重要线索,对DRD的诊断治疗具有十分重要的意义。这样的应用也是本领域技术人员可以理解的。
例如,根据本文的描述可以看出,有些个体携带本发明所述的突变TH基因但不患DRD,例如仅一条染色体携带突变的杂合基因型。对这部分人群的检测可以任何不涉及诊断疾病的目的,因为这些个体并不患病。但对于他们进行检测的结果可以作为例如有用信息使用,例如作为育前检查的重要指标,指导生育,或者用于突变携带者筛查,或者作为SNP分布和多态性研究的工具或者追踪基因突变或家族演化。
野生型TH基因序列和TH蛋白序列说明
人TH基因的序列(SEQ ID NO:1)(下划线标明突变位置):
ATGCCCACCCCCGACGCCACCACGCCACAGGCCAAGGGCTTCCGCAGGGCCGTGTCTGAGCTGGACGCCAAGCAGGCAGAGGCCATCATGGTAAGAGGGCAGGGCGCCCCGGGGCCCAGCCTCACAGGCTCTCCGTGGCCTGGAACTGCAGCCCCAGCTGCATCCTACACCCCCACCCCAAGGTCCCCGCGGTTCATTGGGCGCAGGCAGAGCCTCATCGAGGACGCCCGCAAGGAGCGGGAGGCGGCGGTGGCAGCAGCGGCCGCTGCAGTCCCCTCGGAGCCCGGGGACCCCCTGGAGGCTGTGGCCTTTGAGGAGAAGGAGGGGAAGGCCGTGCTAAACCTGCTCTTCTCCCCGAGGGCCACCAAGCCCTCGGCGCTGTCCCGAGCTGTGAAGGTGTTTGAGACGTTTGAAGCCAAAATCCACCATCTAGAGACCCGGCCCGCCCAGAGGCCGCGAGCTGGGGGCCCCCACCTGGAGTACTTCGTGCGCCTCGAGGTGCGCCGAGGGGACCTGGCCGCCCTGCTCAGTGGTGTGCGCCAGGTGTCAGAGGACGTGCGCAGCCCCGCGGGGCCCAAGGTCCCCTGGTTCCCAAGAAAAGTGTCAGAGCTGGACAAGTGTCATCACCTGGTCACCAAGTTCGACCCTGACCTGGACTTGGACCACCCGGGCTTCTCGGACCAGGTGTACCGCCAGCGCAGGAAGCTGATTGCTGAGATCGCCTTCCAGTACAGGCACGGCGACCCGATTCCCCGTGTGGAGTACACCGCCGAGGAGATTGCCACCTGGAAGGAGGTCTACACCACGCTGAAGGGCCTCTACGCCACGCACGCCTGCGGGGAGCACCTGGAGGCCTTTGCTTTGCTGGAGCGCTTCAGCGGCTACCGGGAAGACAATATCCCCCAGCTGGAGGACGTCTCCCGCTTCCTGAAGGAGCGCACGGGCTTCCAGCTGCGGCCTGTGGCCGGCCTGCTGTCCGCCCGGGACTTCCTGGCCAGCCTGGCCTTCCGCGTGTTCCAGTGCACCCAGTATATCCGCCACGCGTCCTCGCCCATGCACTCCCCTGAGCCGGACTGCTGCCACGAGCTGCTGGGGCACGTGCCCATGCTGGCCGACCGCACCTTCGCGCAGTTCTCGCAGGACATTGGCCTGGCGTCCCTGGGGGCCTCGGATGAGGAAATTGAGAAGCTGTCCACGCTGTACTGGTTCACGGTGGAGTTCGGGCTGTGTAAGCAGAACGGGGAGGTGAAGGCCTATGGTGCCGGGCTGCTGTCCTCCTACGGGGAGCTCCTGCACTGCCTGTCTGAGGAGCCTGAGATTCGGGCCTTCGACCCTGAGGCTGCGGCCGTGCAGCCCTACCAAGACCAGACGTACCAGTCAGTCTACTTCGTGTCTGAGAGCTTCAGTGACGCCAAGGACAAGCTCAGGAGCTATGCCTCACGCATCCAGCGCCCCTTCTCCGTGAAGTTCGACCCGTACACGCTGGCCATCGACGTGCTGGACAGCCCCCAGGCCGTGCGGCGCTCCCTGGAGGGTGTCCAGGATGAGCTGGACACCCTTGCCCATGCGCTGAGTGCCATTGGCTAG
人TH蛋白的序列(SEQ ID NO:2)(下划线标明突变位置):
MPTPDATTPQAKGFRRAVSELDAKQAEAIMVRGQGAPGPSLTGSPWPGTAAPAASYTPTPRSPRFIGRRQSLIEDARKEREAAVAAAAAAVPSEPGDPLEAVAFEEKEGKAVLNLLFSPRATKPSALSRAVKVFETFEAKIHHLETRPAQRPRAGGPHLEYFVRLEVRRGDLAALLSGVRQVSEDVRSPAGPKVPWFPRKVSELDKCHHLVTKFDPDLDLDHPGFSDQVYRQRRKLIAEIAFQYRHGDPIPRVEYTAEEIATWKEVYTTLKGLYATHACGEHLEAFALLERFSGYREDNIPQLEDVSRFLKERTGFQLRPVAGLLSARDFLASLAFRVFQCTQYIRHASSPMHSPEPDCCHELLGHVPMLADRTFAQFSQDIGLASLGASDEEIEKLSTLYWFTVEFGLCKQNGEVKAYGAGLLSSYGELLHCLSEEPEIRAFDPEAAAVQPYQDQTYQSVYFVSESFSDAKDKLRSYASRIQRPFSVKFDPYTLAIDVLDSPQAVRRSLEGVQDELDTLAHALSAIG
附图说明
图1示出常染色体隐性DRD家系的两名患者(II1、II2)及其父母(I1、I2)的关系图。
图2示出对图1中亲代H1和H2的测序结果,(A)I1的TH基因8号外显子的测序结果;(B)I2的TH基因8号外显子的测序结果;(C)I1的TH基因12号外显子的测序结果;(D)I2的TH基因12号外显子的测序结果。
具体实施方式
突变型多巴反应性肌张力障碍相关TH基因与野生型多巴反应性肌张力障碍相关TH基因在序列上的区别是c.1004C>T和c.1451G>A,其中c.1004C>T表示野生型TH基因第1004位的碱基为C,突变型DRD相关基因的第1004位碱基突变为T;c.1451G>A表示野生型TH基因第1451位的碱基为G,突变型DRD相关基因的第1451位碱基突变为A。
在本发明中,采用本领域通用表示法表示突变。c.1004C>T表示cDNA第1004位核苷酸由C变成T;p.A335V表示蛋白质水平第335位密码子由A变成V;c.1451G>A表示cDNA第1451位核苷酸由G变成A;p.R484H表示蛋白质水平第484位密码子由变成H。
野生型人TH基因的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
野生型人TH蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
对于本发明说明书和权利要求书中,提及基因序列,本领域技术人员应当理解,实际包括互补双链的任意一条,或者两条。为了方便,在本说明书和权利要求书中,虽然多数情况下只给出了一条链,但实际上也公开了与之互补的另一条链。例如提及TH基因的cDNA序列,实际上包括该序列以及其互补序列。例如,提及SEQ ID NO:1,实际包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解,利用一条链可以检测另一条链,反之亦然。
在本发明中,复合杂合突变是指患者两条同源染色体上的TH基因各有一个不同的杂合突变,在本发明中一个杂合突变遗传自父亲,一个杂合突变遗传自母亲。
本申请中的基因序列包括DNA形式或RNA形式,公开其中一种,意味着另一种也被公开。例如提及TH基因的cDNA序列,实际也包括相应的RNA序列。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解,下面的实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著,黄培堂等译的《分子克隆实验指南》,第三版,科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例:
发明人采集到一个二代遗传的常染色体隐性DRD家系,家系内2名患者(男性1名,女性1名)表现为步态异常和肌张力障碍,对小剂量多巴制剂有显著而持续的疗效。如图1所示,两名患者分别是(II1、II2),他们是兄妹关系。他们的父母(I1、I2)表型正常,I1和I2各携带一个突变(如图2所示),I1携带c.1004C>T,I2携带c.1451G>A,而遗传给II1、II2后,II1、II2都携带两个突变,从而出现临床表型。II1是先证者。
分别对该常染色体隐性DRD家系内2名DRD患者(II1、II2)及其父母(I1、I2),200名健康对照者的基因组中多巴反应性肌张力障碍相关TH基因进行检测,通过PCR扩增,产物纯化,测序的方法获得多巴反应性肌张力障碍相关基因9号外显子及14号外显子的序列,结合序列测定比对结果,发现多巴反应性肌张力障碍相关TH基因的2个新的突变位点。
1.多巴反应性肌张力障碍相关基因的2个新的突变位点的发现具体步骤如下:
1)DNA提取
分别采取上述的2名DRD患者及其父母的外周静脉血,每人5mL,经枸橼酸钠抗凝,常规酚/氯仿法提取基因组DNA,分光光度计测DNA含量,并稀释至20ng/μL;
2)PCR扩增
根据多巴反应性肌张力障碍TH基因:
9外显子的核苷酸序列设计如下的引物:
正向引物:5'GAGGACGTCTCCCGCTTC 3'(SEQ ID NO:3)
反向引物:5'AGCAGGCAGCACACTTCAC 3'(SEQ ID NO:4)
14外显子的核苷酸序列设计如下的引物:
正向引物:5'CTGGAAGAGGCCTCAGTGTC 3'(SEQ ID NO:5)
反向引物:5'AGGACAGGACCTCACCACAG 3'(SEQ ID NO:6)
PCR反应体系:10μL
反应条件如下面的表1所示:
表1:PCR反应条件
得到的PCR产物可以在4℃保存。
3)测序
将步骤2中获自家系中2名DRD患者及其父母的PCR扩增产物进行DNA测序,测序在深圳华大基因科技有限公司进行。
其中,作为示例显示,对于父母(I1、I2)的测序结果见图2:
(A)I1的TH基因8号外显子的测序结果:
GCCCGGGACTTCCTGGCCAGCCTGG[C/T]CTTCCGCGTGTTCCA(SEQ ID NO:11和12);
(B)I2的TH基因8号外显子的测序结果:
GCCCGGGACTTCCTGGCCAGCCTGGCCTTCCGCGTGTTCCA(SEQ ID NO:11);
(C)I1的TH基因12号外显子的测序结果:
CTATGCCTCACGCATCCAGCGCCCCTTCTCCGTGAAGTTCG(SEQ ID NO:13);
(D)I2的TH基因12号外显子的测序结果:
CTATGCCTCACGCATCCAGC[G/A]CCCCTTCTCCGTGAAGTTCG(SEQ ID NO:13和14)。
对于获自该DRD家系内的2名患者的PCR扩增样品,测得的序列如下所示(下划线为外显子序列,突变位点用边框标示出)。
突变外显子9(SEQ ID NO:7):
GAGGACGTCTCCCGCTTCctgaagggtgtgcccagacgggaggggcgcagagccggggggccggggatggtcagccaagcgccccaccccagcgcggctccagcccgtcccggctcggcagtgacccgcgtggccccttgcagagcgcac gggcttccagctgcggcctgtggccggcctgctgtccgcccgggacttcc tggccagcctgg cttccgcgtgttccagtgcacccagtatatccgccac gcgtcctcgcccatgcactcccctgagccgtgagtgcgcgccctggccgccagcccgagggtggggggtgcgacgggcggcccctcagcccccttctccctcctacgcgcagggactgctgccacgagctgctggggcacgtgcccatgctggccgaccgcaccttcgcgcagttctcgcaggtacgccgcggcctcggagggagccggggtcacccaggggctggcttggcgccgggggcgggcggggatcgatgtgcgggtggGTGAAGTGTGCTGCCTGCT
突变外显子14(SEQ ID NO:8):
CTGGAAGAGGCCTCAGTGTCccgcctgtgaccagttggctcagaaaagccctgggagctctgagccactgtgaaggtggaaacgcggcccctggcctcccctctcctggaggctgcagactctgcccgccagttgacgagggctctgccgctctcctccccagg
agctatgcctcacgcatccagc ccccttctccgtg aagttcgacccgtacacgctggccatcgacgtgctggacagcccccaggc cgtgcggcgctccctggagggtgtccaggatgagctggacacccttgccc atgcgctgagtgccattggctaggtgcacggcgtccctgagggcccttcccaacctcccctggtcctgcactgtcccggagctcaggccctggtgaggggctgggtcccgggtgccccccatgccctccctgctgccaggctcccactgcccctgcacctgcttctcagcgcaacagctgtgtgtgcccgtggtgaggttgtgctgcCTGTGGTGAGGTCCTGTCCT
家系中2名正常人各有以下一种序列形式,测得的序列如下所示(下划线为外显子序列,突变前的碱基c/g用边框标示出)。
野生型外显子9(SEQ ID NO:9):
GAGGACGTCTCCCGCTTCctgaagggtgtgcccagacgggaggggcgcagagccggggggccggggatggtcagccaagcgccccaccccagcgcggctccagcccgtcccggctcggcagtgacccgcgtggccccttgcaga
gcgcac gggcttccagctgcggcctgtggccggcctgctgtccgcccgggacttcc tggccagcctgg cttccgcgtgttccagtgcacccagtatatccgccac gcgtcctcgcccatgcactcccctgagccgtgagtgcgcgccctggccgccagcccgagggtggggggtgcgacgggcggcccctcagcccccttctccctcctacgcgcagggactgctgccacgagctgctggggcacgtgcccatgctggccgaccgcaccttcgcgcagttctcgcaggtacgccgcggcctcggagggagccggggtcacccaggggctggcttggcgccgggggcgggcggggatcgatgtgcgggtggGTGAAGTGTGCTGCCTGCT
野生型外显子14(SEQ ID NO:10):
CTGGAAGAGGCCTCAGTGTCccgcctgtgaccagttggctcagaaaagccctgggagctctgagccactgtgaaggtggaaacgcggcccctggcctcccctctcctggaggctgcagactctgcccgccagttgacgagggctctgccgctctcctccccagg
agctatgcctcacgcatccagc ccccttctccgtg aagttcgacccgtacacgctggccatcgacgtgctggacagcccccaggc cgtgcggcgctccctggagggtgtccaggatgagctggacacccttgccc atgcgctgagtgccattggctaggtgcacggcgtccctgagggcccttcccaacctcccctggtcctgcactgtcccggagctcaggccctggtgaggggctgggtcccgggtgccccccatgccctccctgctgccaggctcccactgcccctgcacctgcttctcagcgcaacagctgtgtgtgcccgtggtgaggttgtgctgcCTGTGGTGAGGTCCTGTCCT
完成家系共分离的验证。
4)结果分析:
2名多巴反应性肌张力障碍患者TH基因的9号外显子的第1004位均发生了C→T的突变,14号外显子的第1451位均发生了G→A的突变。
9号外显子的第1004位发生C→T的突变,该突变导致多巴反应性肌张力障碍患者TH基因的编码蛋白质的第335位氨基酸序列由变为丙氨酸(A)变为缬氨酸(V);14号外显子的第1451位发生了G→A的突变,该突变导致多巴反应性肌张力障碍患者TH基因的编码蛋白质的第484位氨基酸序列由精氨酸(R)变为组氨酸(H)。
2验证过程实施例
此外,本发明人还进一步对该家系外的200个正常人的多巴反应性肌张力障碍患者TH基因进行了突变筛查,方法同上。未发现上述的C→T突变及G→A的突变,排除了单个核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism,SNP)的可能性,确定上述的T→G突变是该常染色体显性遗传DRD家系的致病基因突变。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述,本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导,可以对那些细节进行各种修改和替换,这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。