CN103713130B - 用于循环肿瘤细胞快速检测的适配子型生物传感器 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于循环肿瘤细胞快速检测的适配子型生物传感器，还涉及该传感器的制备方法和应用，该适配子型生物传感器包括压电基底、反射栅阵列和叉指换能器，所述压电基底上依次附着有铬膜和金膜，所述金膜表面包被有适配子，所述适配子为碱基序列如ＳＥＱＩ？ＤＮＯ：1所示的寡核苷酸单链。本发明建立了一种高灵敏性、高特异性和高亲和力的适配子型生物传感器用于循环肿瘤细胞的快速检测，可辅助用于肿瘤转移的早期诊断。

Description

用于循环肿瘤细胞快速检测的适配子型生物传感器
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于循环肿瘤细胞快速检测的适配子型生物传感器，还涉及该传感器的制备方法和应用。
背景技术
肿瘤是直接威胁人类生命健康的重要致死性疾病，近年来其发病率逐渐上升，预计到2030年因肿瘤死亡的人数将达到1500万。研究证实，恶性肿瘤患者死亡的最主要原因是肿瘤转移的发生，其占肿瘤相关死亡的90%。肿瘤转移是一个涉及多步骤多因素的复杂过程，肿瘤细胞在原发灶侵袭、脱落进入循环系统是肿瘤转移的最初阶段，大部分肿瘤细胞由于机体的免疫系统的识别，杀伤及自身凋亡在短期内死亡，只有极少数存活下来转移到血液、骨髓、淋巴结或远处器官，发展为转移灶。肿瘤转移在疾病的分期、治疗及进展中发挥着决定性的作用，因此，肿瘤转移的早期发现对肿瘤复发和预后的判断至关重要，并对指导临床治疗有重大意义。
循环肿瘤细胞（circulatingtumorcells，CTCs）是自发或因诊疗操作过程中由实体瘤或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞。研究证实：CTCs存在于乳腺癌、肺癌、膀胱癌、结直肠癌、前列腺癌及卵巢癌中，并且与患者的临床分期、患者生存期、肿瘤复发、转移及治疗效果密切相关。与传统的免疫组织化学方法、影像学表现及肿瘤血清学标志物相比，由于外周血液获取容易且相对无创，CTCs被认为是实时的“液体活检”，其为肿瘤早期诊断和疗效的实时监测提供了新的方向。但是，外周血循环中CTCs数目极少，肿瘤患者血液中每106-107个白细胞中含有1个CTC，并且CTCs释放入血呈现不连续性和异质性，这使得CTCs快速、灵敏的检测一直受到挑战。因此，迫切需要发展一种灵敏度高、特异性好、无需标记、实时监测、操作简单的CTCs检测方法。
目前，CTCs的检测包括富集和检测两个步骤，其中为了实现CTCs的检测主要包括以下两种策略：①免疫表型的分析方法（CellSearch，EPISPOT，CTC-chip等），②通过PCR扩增恶性细胞突变的方法。但是这些方法由于需特殊检测仪器和操作复杂而受限，同时技术上需要荧光或生物学标记，且结果存在重复性差，假阳性，难以标准化判定等问题。
生物传感器(biosensor)是对生物物质敏感并将其浓度转换为电信号进行检测的仪器，由固定化的生物敏感材料作识别元件（包括酶、抗体、抗原、微生物、细胞、组织、核酸等生物活性物质）与适当的理化换能器（如氧电极、光敏管、场效应管、压电晶体等等）及信号放大装置构成的分析工具或系统。生物传感器由于集高效、灵敏、特异、结构小巧、经济实用等优点于一身，目前已成为生命科学领域的研究热点。近年来，随着声光、微电子技术的发展，一种新型传感器——漏声表面波(LeakySurfaceAcousticWave,LSAW)传感器逐渐发展起来。它利用了压电晶体的特殊切向（如：Y方向切割36°旋转、X方向传播的LiTaO3晶体）激励出LSAW，当LSAW传播路径表面的质量负载发生微小改变时（靶序列与固定的探针发生反应），传感器表面的边界条件将发生改变，导致LSAW传播的频率和相位发生相应的改变，此时从传感器输出换能器提取的电信号的频率和相位即可随之发生变化，从而可极为敏感地探测出与传感器晶体表面固定的探针发生特异性反应的待测靶物质。总体上讲，LSAW传感器具有如下几个优点：1）高灵敏度，高精度；2）重复性及可靠性更好；3）功耗低；4）结构工艺性好。这使LSAW传感器具有了非常广泛的应用前景。
适配子（aptamer）是通过指数富集配基系统进化技术（SELEX）筛选得到的DNA或RNA核酸序列。SELEX是一种从大容量寡核苷酸文库中经反复分离扩增步骤得到针对靶分子的高亲和力高特异性核酸配基—适配子的体外筛选技术，主要包括结合、分离、洗脱、扩增和调节五个步骤。首先将包含有1013-1015个随机序列的核苷酸序列库（ssDNA文库、RNA文库）与靶分子混合温育，随后通过物理方法分离出结合了靶分子的核苷酸序列。洗脱收集获得结合序列，并将结合序列进行聚合酶链式反应（PCR）扩增生成次级文库，用于下轮筛选。一帮通过6-20轮SELEX循环，对已达到高亲和力的扩增产物进行克隆测序，从而获得特异性识别靶分子的适配子。
在生物传感器的构建方面，适配子可以高特异性和亲和力的识别靶分子，其与靶分子结合的解离常数可达到10-9-10-12；同时适配子还具有稳定性和重复性好、可反复使用和长期保存、筛选周期很短、对温度不敏感、变性之后还可以复性而恢复原来的三维结构等优势，是一种高效、快速的检测手段。另外，适配子还具有一些优于抗体的优点：1）适配体是通过体外筛选获得，如SELEX筛选周期一般为2-3个月，最快的只需2周，而制备单克隆抗体则至少需要3-6个月，且成本昂贵；2）适配子是通过化学法合成的，因而可以在适配子上灵活修饰多种基因，使其具有多种功能；3）抗体的蛋白质决定了它容易变性，传统免疫生物传感器化学和物理性质的不稳定限制了生物传感器的应用范围，而适配子具有化学稳定性，在pH2-12的宽范围内保持稳定，并具有一定的热复性；4）适配子组成简单，一般由几十个核苷酸（少于100nt）组成，因而适配子的设计相对简单。由于适配子拥有抗体无法比拟的优势，利用适配子设计生物传感器对循环肿瘤细胞进行识别和检测，具有极其重要的意义。
基于以上理论，本发明结合生物传感器的高灵敏性和适配子的高特异性和高亲和力，建立一种用于循环肿瘤细胞快速检测的适配子型生物传感器，以满足对肿瘤转移早期判定的需求。
发明内容
有鉴于此，本发明首先提供一种可高特异性和高亲和力的识别循环肿瘤细胞的适配子，即碱基序列如ＳＥＱＩＤＮＯ：1所示的单链寡核苷酸。该单链寡核苷酸通过指数富集配基系统进化技术（SELEX）筛选得到。其筛选过程采用完整的MCF-7细胞作为复合靶分子，并采用Romas细胞和K562细胞进行反向、消减筛选，故对循环肿瘤细胞具有高特异性和高亲和力，特别适合作为适配子用于循环肿瘤细胞检测的生物传感器。
本发明的目的就在于上述的单链寡核苷酸在用于循环肿瘤细胞快速检测的适配子型生物传感器中的应用。具体地，本发明提供一种高灵敏性、高特异性和高亲和力的用于循环肿瘤细胞快速检测的适配子型生物传感器。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
用于循环肿瘤细胞快速检测的适配子型生物传感器，包括压电基底、反射栅阵列和叉指换能器，所述压电基底上依次附着有铬膜和金膜，所述金膜表面包被有适配子，所述适配子为碱基序列如ＳＥＱＩＤＮＯ：1所示的单链寡核苷酸。本发明的单链寡核苷酸作为适配子用于循环肿瘤细胞快速检测的适配子型生物传感器，并不限于上述生物传感器的构成，现有技术中已有的生物传感器构成均涵盖在本发明的范围内。
进一步，所述适配子最小自由能为-5.20kcal/mol，其二级构象结构如下式所示：
该适配子的序列为5'-SH-GCAGTTGATCCTTTGGATACCCTGG-3'，其5'端通过巯基法固定在金膜上，其核苷酸序列及形成的二级构象，决定了其能更好的识别循环肿瘤细胞。
进一步，所述压电基底采用Y36°切X传方向的LiTaO3晶体制成。LiTaO3晶体以其优良的温度稳定性和较高的耦合系数特性受到大多数声表器件制造商的青睐，而LiTaO3在Y36°切X传方向具有优良的漏表面波(LSAW)特性，其耦合系数为0.047，温度系数为32×10-6/℃，特别适合用于本发明。
进一步，所述金膜厚度为40nm。
本发明另提供一种上述用于循环肿瘤细胞快速检测的适配子型生物传感器的制备方法，该方法操作简单，制备出的生物传感器具有高灵敏性、高特异性和高亲和力等特点。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
用于循环肿瘤细胞快速检测的适配子型生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
A、生物传感器的预处理：金膜表面在包被适配子前，对其进行清洁处理，去除金膜表面的杂质；
B、适配子的预处理：所述适配子在95℃变性5min，然后迅速冰浴5min；
C、适配子的包被：采用巯基法将适配子固定于金膜表面，再用6-巯基-1-己醇（又名6-巯基己-1-醇、6-巯基己醇）对未与适配子结合的金膜进行封闭处理。
步骤A所述的生物传感器的金膜处理后，更易于适配子的结合固定。进一步，所述步骤A生物传感器的预处理是金膜表面在包被适配子前，先后分别用Piranha溶液、1mol/LNaOH和1mol/LHCl各浸泡生物传感器金膜10min，然后用磷酸盐缓冲液和去离子水分别清洗生物传感器3次，氮气吹干。
进一步，所述步骤B适配子的预处理是将适配子溶解于包含10mmol/LTris-HCl、1mmol/LEDTA、1mol/LNaCl和1mmol/LTCEP（化学名称：三(2-羧乙基)膦，英文名称：Tris(2-carboxyethyl)phosphine）的缓冲液中，并在95℃变性5min，然后迅速冰浴5min。
进一步，所述步骤C适配子包被时，适配子的浓度为2μmol/L，包被操作于4℃反应24h。用2μmol/L浓度的适配子进行包被，生物传感器的相位变化最大，为最佳的固定浓度。
本发明还提供一种上述用于循环肿瘤细胞快速检测的适配子型生物传感器快速检测循环肿瘤细胞的方法，其检测快速，识别性强。技术方案为：
快速检测循环肿瘤细胞的方法，包括以下步骤：
a、将上述的用于循环肿瘤细胞快速检测的适配子型生物传感器表面的适配子与循环肿瘤细胞进行杂交反应，反应条件为在包含Ca2+和Mg2+的磷酸盐缓冲液中，于37℃反应30min，所述磷酸盐缓冲液的pH为7.4；
b、由生物传感器的相位变化获取循环肿瘤细胞的检测数据。
进一步，所述步骤a的反应条件为在包含1mmol/LCa2+和1mmol/LMg2+的1mmol/L磷酸盐缓冲液中，于37℃反应30min，所述磷酸盐缓冲液的pH为7.4。
进一步，选用循环肿瘤细胞MCF-7细胞为靶细胞。MCF-7细胞为人类乳腺癌细胞，研究证明，外周血中MCF-7细胞与乳腺癌患者的临床分期，乳腺癌的复发、转移及治疗效果相关。因此，本发明以MCF-7细胞作为靶细胞，用以建立用于循环肿瘤细胞检测的适配子型生物传感器检测技术平台，由生物传感器的相位变化获取循环肿瘤细胞的检测数据。
本发明的有益效果：
1）本发明利用了生物传感器检测循环肿瘤细胞具有的高灵敏度、高精度、重复性及可靠性更好、功耗低、结构工艺性好等优点；2）本发明适配子作为生物传感器的识别分子，与传统的传感器识别分子抗体相比，具有与靶分子结合的亲和力和特异性更强、稳定性和重复性更好、可反复使用和长期保存、筛选周期短等优势；3）本发明用于循环肿瘤细胞的检测灵敏度高，能够检测到靶细胞的浓度为32细胞/mL；4）本发明用于循环肿瘤细胞的检测无需对探针进行荧光或生物学修饰，即无需标记，提高了检测的重复性，同时降低了检测的成本；5）本发明进行循环肿瘤细胞检测的整个过程可通过传感器的检测系统进行实时监测。综上，本发明建立了一种高灵敏性、高特异性和高亲和力的适配子型生物传感器用于循环肿瘤细胞的快速检测，可辅助用于肿瘤转移的早期诊断。
附图说明
图1为本发明提供的用于循环肿瘤细胞快速检测的适配子型生物传感器的结构示意图；其中，5为输入的反射栅阵列，6为输入的叉指换能器，7为生物学反应区（即固定有适配子的金膜区域），8为输出的叉指换能器，9为输出的反射栅阵列。
图2为本发明提供的用于循环肿瘤细胞快速检测的适配子型生物传感器的剖面图；其中，1为压电基底，2为铬膜，3为金膜，4为固定的适配子。
图3为包被不同浓度的适配子时，生物传感器的相位变化图，检测的循环肿瘤细胞的浓度为105细胞/mL。
图4为本发明提供的用于循环肿瘤细胞快速检测的适配子型生物传感器在检测不同浓度循环肿瘤细胞时的实时相位变化；其中，a为空白对照，b为101细胞/mL，c为102细胞/mL，d为103细胞/mL，e为104细胞/mL，f为105细胞/mL，g为106细胞/mL，h为107细胞/mL。
图5为本发明提供的适配子型生物传感器的特异性验证图；其中，A为MCF-7细胞，B为Roams细胞，C为K562细胞。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面参照附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例1生物传感器的制作
按图1和图2所示的结构，进行生物传感器的制作，其中，1为压电基底，2为铬膜，3为金膜，4为固定的适配子，5为输入的反射栅阵列，6为输入的叉指换能器，7为生物学反应区（即固定有适配子的金膜区域），8为输出的叉指换能器，9为输出的反射栅阵列。
1）钽酸锂(LiTaO3)晶体加工：在制作SAW（SURFACEACOUSTICWAVE，声表面波）器件中，LiTaO3晶体以其优良的温度稳定性和较高的耦合系数特性受到青睐。LiTaO3晶体在Y36°切-X传播方向具有优良的漏表面波(LSAW)特性，其耦合系数为4.7%，温度系数为-32×10-6/℃。因此本研究采用Y36°切割X方向传播的LiTaO3单晶基作为压电基底。
2）叉指换能器的制作：
（1）LiTaO3晶体基片清洗：对基片用酸、碱清洗液进行浸泡和清洗，辅助用超声、兆声系统进行处理。
（2）LiTaO3晶体镀膜：用电子束蒸发或直流溅射法进行镀膜，金膜厚度为40nm。
（3）叉指换能器电极的光刻：在传感器的两侧通过光刻技术加工而形成两个单相叉指换能器，这些电极条互相交叉放置，两端由汇流条连在一起，其形状如同交叉平放的两排手指，故称为叉指电极。
3）反射栅阵列的制作：两个单相叉指换能器外侧加入反射栅阵列，这样可以使信号在两个换能器之间反复传播，成倍地增加了有用信号传播路径的长度，这样一个反复过程在检测上等于放大了被检测信号。
实施例2用于循环肿瘤细胞快速检测的适配子型生物传感器的制作
1）生物传感器的预处理：将实施例1的生物传感器生物学反应区金膜表面在包被适配子前，先后分别用Piranha溶液、1.0mol/LNaOH和1.0mol/LHCl各浸泡生物传感器金膜10min，然后用磷酸盐缓冲液和去离子水分别清洗生物传感器3次，氮气吹干。
2）适配子的预处理：按ＳＥＱＩＤＮＯ：1的序列，采用固相亚磷酸酰胺法利用DNA自动合成仪合成适配子，并分离纯化后备用。将适配子溶解于包含10mMTris-HCl、1mMEDTA、1.0MNaCl和1mMTCEP的缓冲液中，并在95℃变性5min，然后迅速冰浴5min。
3）细胞的培养及预处理：MCF-7细胞、Romas细胞及K562细胞购自美国标准生物品收藏中心。MCF-7细胞培养在10%胎牛血清DMEM培养基（GIBCO，美国），Romas细胞及K562细胞培养在10%胎牛血清RPMI1640培养基（GIBCO，美国）。上述细胞置于5%CO237℃培养箱培养48h后，1500rpm离心5min，之后重悬于包含0.5%Tween-20和1%BSA的磷酸盐缓冲液，孵育30min。然后1500rpm离心5min，最后细胞重悬于包含1mMCa2+and1mMMg2+的磷酸盐缓冲液。
4）适配子的包被：将不同浓度预处理的适配子（0.5μM、1.0μM、2.0μM、4.0μM、8.0μM）采用巯基法自组装于生物传感器表面。条件为4℃反应24h。包被不同浓度的适配子时，生物传感器的相位变化见图3。从图3可以看出，适配子最佳的固定浓度为2.0μM。
5）生物传感器金膜表面在包被适配子后，利用6-巯基-1-己醇对未与适配子结合的金膜进行封闭处理。
6）将封闭好的生物传感器联入检测系统，待传感器在气相中稳定后，在传感器的金膜表面加入待检测的循环肿瘤细胞，使循环肿瘤细胞与生物传感器表面的适配子进行杂交反应，反应条件为包含1mMCa2+和1mMMg2+的1mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)，37℃反应30min。
7）利用生物传感器的相位变化对循环肿瘤细胞与适配子的杂交反应进行检测。本发明提供的用于循环肿瘤细胞快速检测的适配子型生物传感器在检测不同浓度循环肿瘤细胞时的实时相位变化见图4，可见不同浓度的循环肿瘤细胞有明显的相位变化差异。
实施例3用于循环肿瘤细胞快速检测的适配子型生物传感器检测特异度的测定
以MCF-7作为靶细胞，Romas细胞和K562细胞作为干扰细胞，浓度均为107细胞/mL，用实施例2制得的适配子生物传感器进行检测。测定结果见图5，可见本发明的用于循环肿瘤细胞快速检测的适配子型生物传感器的检测具有特异性。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (8)

1.用于循环肿瘤细胞快速检测的适配子型生物传感器，包括压电基底(1)、反射栅阵列和叉指换能器，其特征在于：所述压电基底(1)上依次附着有铬膜(2)和金膜(3)，所述金膜(3)表面包被有适配子(4)，所述适配子(4)为碱基序列如SEQIDNO：1所示的单链寡核苷酸，其特征在于：所述适配子(4)最小自由能为-5.20kcal/mol。
2.根据权利要求1所述的用于循环肿瘤细胞快速检测的适配子型生物传感器，其特征在于：所述压电基底(1)采用Y36°切X传方向的LiTaO3晶体制成。
3.根据权利要求1所述的用于循环肿瘤细胞快速检测的适配子型生物传感器，其特征在于：所述金膜(3)厚度为40nm。
4.权利要求1至3任一项所述的用于循环肿瘤细胞快速检测的适配子型生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、生物传感器的预处理：金膜表面在包被适配子前，对其进行清洁处理，去除金膜表面的杂质；
B、适配子的预处理：所述适配子在95℃变性5min，然后迅速冰浴5min；
C、适配子的包被：采用巯基法将适配子固定于金膜表面，再用6-巯基-1-己醇对未与适配子结合的金膜进行封闭处理。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤A生物传感器的预处理是金膜表面在包被适配子前，先后分别用Piranha溶液、1mol/LNaOH和1mol/LHCl各浸泡生物传感器金膜10min，然后用磷酸盐缓冲液和去离子水分别清洗生物传感器3次，氮气吹干。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤B适配子的预处理是将适配子溶解于包含10mmol/LTris-HCl、1mmol/LEDTA、1mol/LNaCl和1mmol/LTCEP的缓冲液中，并在95℃变性5min，然后迅速冰浴5min。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤C适配子包被时，适配子的浓度为2μmol/L，包被操作于4℃反应24h。
8.快速检测循环肿瘤细胞非疾病诊断的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、将权利要求1至4任一项所述的用于循环肿瘤细胞快速检测的适配子型生物传感器表面的适配子与循环肿瘤细胞进行杂交反应，反应条件为在包含Ca2+和Mg2+的磷酸盐缓冲液中，于37℃反应30min，所述磷酸盐缓冲液的pH为7.4；
b、由生物传感器的相位变化获取循环肿瘤细胞的检测数据。
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