CN103694326A - 截短表达的相思子毒素a链蛋白抗原及其应用 - Google Patents

截短表达的相思子毒素a链蛋白抗原及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种截短表达的相思子毒素A链蛋白抗原及其应用。本发明提供了tATA4片段，是如下（a）或（b）或（c）或（d）：（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）具有序列表的序列2所示的氨基酸序列的蛋白质；（c）由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（d）将序列2或序列4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列2或序列4衍生的蛋白质。本发明提供的tATA4片段可以作为抵抗相思子毒素攻击的疫苗的活性成分。本发明具有重大的应用价值和深远的应用前景。

Description

截短表达的相思子毒素A链蛋白抗原及其应用
技术领域
本发明涉及截短表达的相思子毒素A链蛋白抗原及其应用。
背景技术
随着生物技术的快速发展和生物毒素的开发利用，毒素在大规模杀伤性武器中的重要性已凸现出来，生物毒素及其生物恐怖的威胁与日俱增。作为B类生物战剂，相思子毒素被列入国际生物战剂核查清单，它和蓖麻毒素在分子结构和作用机制上具有高度相似性，由A-B链结构组成（A链为效应链，具有RNA N-糖苷酶活性；B链为结合链，介导A链进入细胞内发挥毒性作用）。相思子毒素小鼠腹腔LD50为0.04μg/kg，其毒性是蓖麻毒素的75倍。相思豆主要分布在亚热带地区，在我国的南方有广泛分布，常被用作装饰品的制作，甚至能在淘宝网上都能购买到大量的原料，而且在许多公开的专业刊物和互联网上都可以找到如何提取制备相思子毒素的详细资料，因此其恐怖威胁不容易忽视。尤其是面对东突、疆独、藏独等恐怖极端分子危害人类的恐怖活动新动态，在我国不排除发生相思子毒素的生物恐怖袭击可能性。
针对相思子毒素中毒，目前尚无预防疫苗、特异性抗毒素和解毒药。通过分析现有的研究进展和成果，美军的生防专家认为，疫苗研究是对抗其中毒的有效预防手段。因此，开展相思子毒素疫苗的研究，具有十分重要的军事和社会意义。
我国学者对相思子毒素生物战剂的侦检工作有了初步的发展，而对其疫苗作为医学防护的研究才刚刚起步，针对潜在相思子毒素的恐怖袭击尚无有效的免疫治疗和防护手段，因此迫切需要建立和发展具有自主知识产权的防护用品，保证及时采取应急措施和对策，将生物恐怖袭击造成的破坏降低到最低限度。
发明内容
本发明的目的是提供一种截短表达的相思子毒素A链蛋白抗原及其应用。
本发明提供了一种蛋白质，命名为tATA4片段，是如下（a）或（b）或（c）或（d）：（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）具有序列表的序列2所示的氨基酸序列的蛋白质；（c）由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（d）将序列2或序列4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列2或序列4衍生的蛋白质。
编码所述tATA4片段的基因也属于本发明的保护范围。
所述基因具体可为如下（1）或（2）或（3）或（4）或（5）或（6）或（7）的DNA分子：（1）编码区如序列表的序列1所示的DNA分子；（2）序列表的序列1所示的DNA分子；（3）具有序列表的序列1所示的核苷酸序列的DNA分子；（4）编码区如序列表的序列3所示的DNA分子；（5）序列表的序列3所示的DNA分子；（6）在严格条件下与（1）或（2）或（3）或（4）或（5）限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；（7）与（1）或（2）或（3）或（4）或（5）限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子。上述严格条件可为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65oC下杂交，然后用2×SSC、0.1%SDS和1×SSC、0.1%SDS各洗膜一次。
含有所述基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。所述重组载体具体可为重组表达载体。所述重组表达载体具体可为在pET-His表达载体的多克隆位点（如EcoRⅠ和NheⅠ酶切位点之间）正向插入了序列表的序列1所示的双链DNA分子得到的重组质粒。所述重组菌具体可为将所述重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)得到的重组菌。
本发明还保护所述tATA4片段在制备相思子毒素疫苗中的应用。所述相思子毒素为天然相思子毒素和/或相思子毒素-a。
本发明还保护所述tATA4片段和佐剂在制备相思子毒素疫苗中的应用。所述相思子毒素为天然相思子毒素和/或相思子毒素-a。所述佐剂具体可为铝佐剂。
本发明还保护一种相思子毒素疫苗，其活性成分为所述tATA4片段。所述疫苗还包括佐剂。所述佐剂具体可为铝佐剂。所述相思子毒素为天然相思子毒素和/或相思子毒素-a。
本发明以相思子毒素的A链为基础，从中截取得到了tATA4片段。与相思子毒素的A链相比，tATA4片段的毒性大幅降低，但保持了良好免疫原性。将tATA4片段免疫动物后，可以保护动物免受相思子毒素的攻击致死作用。综上所述，本发明提供的tATA4片段可以作为抵抗相思子毒素攻击的疫苗的活性成分。
本发明具有重大的应用价值和深远的应用前景。
附图说明
图1为pET-His表达载体的结构示意图。
图2为tATA4片段溶液进行15%SDS-PAGE的电泳图谱。
图3为tATA4片段和A链蛋白对BEAS-2B细胞的杀伤作用，细胞存活率结果。
图4为tATA4片段和A链蛋白对小鼠的毒性，相对体重结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
基于大量的序列分析、片段截取、毒性验证和免疫原性验证，本发明的发明人发现相思子毒素A链中的一个多肽片段兼具低毒性和良好的免疫原性，可以作为相思子毒素的疫苗使用。将该片段命名为tATA4片段，其编码基因如序列表的序列1所示。
pET-His表达载体（结构示意图见图1）：深圳市源动力生物技术开发公司。大肠杆菌BL21(DE3)：北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为CD601。BEAS-2B细胞（人肺上皮细胞）：ATCC细胞库，ATCC Number为CRL-9609TM。BALB/c小鼠：军事医学科学院动物中心，产品号为RB003。铝佐剂（铝剂，佐剂）：Thermo scientific公司，产品号为77161。羊抗兔IgG：北京鸿跃创新科技有限公司，产品编号为Hy-5506。
相思子毒素-a（abrin-a）：以市售的相思豆为原料，参照文献的方法制备得到相思子毒素-a；参考文献信息：【题名】相思子毒素-a的纯化及鉴定，【作者】李小兵谢光洪周昌芳张志刚宋文学周晓翠张乃生王兴龙高宏伟王哲，【机构】吉林大学畜牧兽医学院,吉林长春130062军事医学科学院军事兽医研究所,吉林长春130062，【刊名】中国兽医学报,2008(3):310-313。
如无特殊说明，实施例中的PBS缓冲液均为pH7.2、0.01M的PBS缓冲液。
实施例1、tATA4片段的制备
1、合成序列表的序列1所示的双链DNA分子（编码序列表的序列2所示的tATA4片段）。
2、以步骤1合成的双链DNA分子为模板，用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
F1：5’-CCG GAATTC GAAGATCGCCCGATCA-3’；
R1：5’-CTA GCTAGC ATCCGGCTGAAATGCCGTA-3’。
3、用限制性内切酶EcoRⅠ和NheⅠ双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶EcoRⅠ和NheⅠ双酶切pET-His表达载体，回收约2.9kb的载体骨架。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒。根据测序结果，对重组质粒进行结构描述如下：在pET-His表达载体的EcoRⅠ和NheⅠ酶切位点之间正向插入了序列表的序列1所示的双链DNA分子。重组质粒中，外源插入片段与载体骨架上的部分核苷酸形成序列表的序列3所示的融合基因，表达序列表的序列4所示的融合蛋白（具有His标签的tATA4片段）。
6、将步骤5得到的重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌。
7、将步骤6得到的重组菌接种至液体LB培养基，37℃、200rpm振荡培养至OD600nm约为0.6；然后，加入IPTG并使其浓度为0.01mM，然后20℃、200rpm振荡培养约12-14h，然后8000g离心10min，收集菌体。
8、取步骤7得到的菌体，用蛋白纯化A液（溶剂为pH7.5、20mM Tris-cl缓冲液，含0.5M NaCl）重悬后在冰浴中进行超声破碎（总时间为30min,功率为550W，每工作2s停3s），4℃、9000g离心15min,收集上清液。
9、取步骤8得到的上清液，进行亲和层析。
镍柱：HiTrapTM Chelating HP,5ml体积，购于GE公司，产品目录号：lot:10037610。
纯化过程：先用8体积份蛋白纯化A液和2体积份蛋白纯化B液（溶剂为pH7.5、20mMTris-cl缓冲液，含0.5M NaCl和0.5M咪唑）组成的混合液洗脱6个柱体积，以去除杂蛋白；然后用8体积份蛋白纯化A液和2体积份蛋白纯化B液组成的混合液洗脱10个柱体积，以收集目的蛋白，得到的过柱后溶液即为融合蛋白溶液，简称tATA4片段溶液。
将tATA4片段溶液进行15%SDS-PAGE。电泳图谱见图2的泳道1至3，可以观察到电泳纯的蛋白条带，相对分子量约为22kDa，与预期大小相符。
经BandScan凝胶图像分析软件分析，tATA4片段溶液中的蛋白纯度约为98%。
实施例2、制备全长蛋白
1、在pET-His表达载体的EcoRⅠ和NheⅠ酶切位点之间正向插入序列表的序列5所示的双链DNA分子（序列表的序列5所示的双链DNA分子编码序列表的序列6所示的A链蛋白），得到重组质粒。
2、将步骤1得到的重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌。
3、将步骤2得到的重组菌接种至液体LB培养基，37℃、200rpm振荡培养至OD600nm约为0.6；然后，加入IPTG并使其浓度为0.01mM，然后20℃、200rpm振荡培养约12-14h，然后8000g离心10min，收集菌体。
4、取步骤3得到的菌体，用蛋白纯化A液（溶剂为pH7.5、20mM Tris-cl缓冲液，含0.5M NaCl）重悬后在冰浴中进行超声破碎（总时间为30min,功率为550W，每工作2s停3s），4℃、9000g离心15min,收集上清液。
5、取步骤4得到的上清液，进行亲和层析。
具体参数同实施例1的步骤9。
得到的过柱后溶液即为融合蛋白（具有His标签的A链蛋白）溶液，简称A链蛋白溶液。
实施例3、tATA4片段的性能分析
一、Western印迹分析
将实施例1制备的tATA4片段溶液进行Western印迹分析（Western印迹分析采用的一抗为用实施例2制备的A链蛋白溶液免疫家兔后收集的血清，二抗为羊抗兔IgG），显示在22KDa附近有特异性显色带出现，说明tATA4片段能被A链蛋白特异性血清抗体所识别，具有良好的抗原性。
二、毒性分析
1、通过MTS法测定tATA4片段和A链蛋白对BEAS-2B细胞的杀伤作用
（1）将BEAS-2B细胞接种至96孔板（10000个细胞/孔），培养过夜使细胞贴壁。
（2）完成步骤（1）后，将孔分成三组（第一组的孔加入实施例1制备的tATA4片段溶液的3倍梯度稀释液，第二组的孔加入实施例2制备的A链蛋白溶液的3倍梯度稀释液，第三组的孔加入相思子毒素-a溶液的3倍梯度稀释液；均采用RPMI1640细胞培养基稀释，起始稀释液中的蛋白浓度为450μg/ml，设置5个稀释梯度，每个稀释度设置3个复孔，每孔加入100μl稀释液；同时设置5个阴性对照孔，每孔加入100μlRPMI1640细胞培养基），置于37℃温箱中培养24小时,弃上清。
（3）完成步骤（2）后，每孔加入100μl RPMI1640细胞培养基和20μl MTS试剂，37℃培养3h,酶联仪562nm处读数。
细胞存活率=实验组OD值/阴性对照组OD值。
各组的细胞存活率结果见图3（平均值）。tATA4片段较之abrin和A链蛋白的细胞毒性明显降低。
2、tATA4片段和A链蛋白对小鼠的毒性
第一组：将实施例1制备的tATA4片段溶液一次性腹腔注射BALB/c小鼠（分别设置4个注射剂量，1mg/只、0.5mg/只、0.1mg/只、0.05mg/只，均以蛋白量计；用PBS缓冲液调整蛋白浓度；每个注射剂量5只小鼠，每只小鼠的注射体积均为500μl），注射后每隔24h观察小鼠的生存状况并记录小鼠的体重，持续观察10天。
第二组：将实施例2制备的A链蛋白溶液一次性腹腔注射BALB/c小鼠（分别设置4个注射剂量，1mg/只、0.5mg/只、0.1mg/只、0.05mg/只，均以蛋白量计；用PBS缓冲液调整蛋白浓度；每个注射剂量5只小鼠，每只小鼠的注射体积均为500μl），注射后每隔24h观察小鼠的生存状况并记录小鼠的体重，持续观察10天。
第三组：将PBS缓冲液一次性腹腔注射BALB/c小鼠（5只小鼠，每只小鼠的注射体积为500μl），注射后每隔24h观察小鼠的生存状况并记录小鼠的体重，持续观察10天。
注射1mg A链蛋白后，该组小鼠均死亡。注射0.5mg A链蛋白后，该组3只小鼠死亡。注射0.1mg A链蛋白，该组小鼠均未死亡。注射0.05mg A链蛋白，该组小鼠均未死亡。
注射1mg tATA4片段、注射0.5mg tATA4片段、注射0.1mg tATA4片段、注射0.05mgtATA4片段，各组小鼠均未死亡。
将每24h测量的体重除以注射前的初始体重，得到相对体重，结果见图4（该组小鼠的平均值，只统计存活小鼠）。结果表明，tATA4片段较A链蛋白的毒性明显降低。
三、免疫原性分析
1、制备血清
实验动物采用BALB/c小鼠。
取实验动物，共免疫三次，第一次免疫和第二次免疫之间间隔2周，第二次和第三次免疫之间间隔2周，每次免疫1周后尾静脉取血并分离血清，每次免疫的方法均如下：用PBS缓冲液稀释实施例1制备的tATA4片段溶液，得到蛋白浓度为0.15mg/ml的稀释液，将100μl稀释液与100μl铝佐剂充分混合乳化，每只小鼠皮下两点共注射200μl。
采用间接ELISA法进行血清效价测定（采用实施例2制备的A链蛋白溶液作为包被原，包被浓度为5μg蛋白/ml,100μl/孔）。将未经任何免疫的BALB/c小鼠的血清作为阴性对照，将PBS缓冲液作为空白对照。以P/N≥2.1，P－N≥0.2作为阳性血清的判断标准。其中P/N=(标本OD490nm值－空白对照OD490nm值)/(阴性对照OD490nm值－空白对照OD490nm值)；P－N=标本OD490nm值－阴性对照OD490nm值。
对30只实验动物进行上述操作，第三次免疫1周后，血清效价均达到1×10－6以上。
2、攻毒实验
取20只步骤1中第三次免疫后1周的小鼠，分成四组，每组5只，分别处理如下：
第一组：腹腔注射相思子毒素-a溶液，每只小鼠的注射剂量为20×LD50；
第二组：腹腔注射相思子毒素-a溶液，每只小鼠的注射剂量为30×LD50；
第三组：腹腔注射相思子毒素-a溶液，每只小鼠的注射剂量为40×LD50；
第四组：腹腔注射相思子毒素-a溶液，每只小鼠的注射剂量为50×LD50；
每隔24h观察小鼠存活情况并记录小鼠的体重，共观察10天（每24小时为1天，注射前为0天，从注射开始计时，24小时后为1天，依次类推），结果见表1。tATA4片段能完全保护40×LD50的相思子毒素-a的攻击。
表1各组小鼠每24小时的体重（g）和生存率
Figure BDA0000434899850000061
3、血清的中和作用
（1）取步骤1中第三次免疫后1周的小鼠，眼球取血并收集血清。
（2）取未经任何免疫的BALB/c小鼠，眼球取血并收集血清。
（3）取30只新的BALB/c小鼠（体重约20g），分成六组，每组5只，分别处理如下：
第一组：每只小鼠腹腔注射500μl混合液Ⅰ（将相思子毒素-a溶液与250μl步骤（1）得到的血清混合，用PBS缓冲液将体积补至500μl，得到混合液Ⅰ，混合液Ⅰ中的相思子毒素含量为20×LD50）；
第二组：每只小鼠腹腔注射500μl混合液Ⅱ（将相思子毒素-a溶液与250μl步骤（1）得到的血清混合，用PBS缓冲液将体积补至500μl，得到混合液Ⅱ，混合液Ⅱ中的相思子毒素含量为30×LD50）；
第三组：每只小鼠腹腔注射500μl混合液Ⅲ（将相思子毒素-a溶液与250μl步骤（1）得到的血清混合，用PBS缓冲液将体积补至500μl，得到混合液Ⅲ，混合液Ⅲ中的相思子毒素含量为40×LD50）；
第四组：每只小鼠腹腔注射500μl混合液Ⅳ（将相思子毒素-a溶液与250μl步骤（1）得到的血清混合，用PBS缓冲液将体积补至500μl，得到混合液Ⅳ，混合液Ⅳ中的相思子毒素含量为50×LD50）；
第五组：每只小鼠腹腔注射500μl混合液Ⅴ（将相思子毒素-a溶液与250μl步骤（2）得到的血清混合，用PBS缓冲液将体积补至500μl，得到混合液Ⅴ，混合液Ⅴ中的相思子毒素含量为20×LD50）；
第六组：每只小鼠腹腔注射500μl混合液Ⅵ（将相思子毒素-a溶液与250μl步骤（2）得到的血清混合，用PBS缓冲液将体积补至500μl，得到混合液Ⅵ，混合液Ⅵ中的相思子毒素含量为30×LD50）；
每隔24h观察小鼠生存情况。
结果见表2。
表2各组小鼠中存活鼠的只数
攻毒1天后 攻毒2天后 攻毒3天后 攻毒4天后 攻毒5天后 攻毒6天后 攻毒7天后 生存率
第一组 5 5 5 5 5 5 5 100%
第二组 5 5 5 5 3 3 3 60%
第三组 5 5 5 3 2 2 2 40%
第四组 5 5 2 0 0%
第五组 0 0%
第六组 0 0%
Figure IDA0000434899930000011
Figure IDA0000434899930000021
Figure IDA0000434899930000031
Figure IDA0000434899930000041
Figure IDA0000434899930000051
Figure IDA0000434899930000061

Claims (10)

1.一种蛋白质，是如下（a）或（b）或（c）或（d）：
（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（b）具有序列表的序列2所示的氨基酸序列的蛋白质；
（c）由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（d）将序列2或序列4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列2或序列4衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下（1）或（2）或（3）或（4）或（5）或（6）或（7）的DNA分子：
（1）编码区如序列表的序列1所示的DNA分子；
（2）序列表的序列1所示的DNA分子；
（3）具有序列表的序列1所示的核苷酸序列的DNA分子；
（4）编码区如序列表的序列3所示的DNA分子；
（5）序列表的序列3所示的DNA分子；
（6）在严格条件下与（1）或（2）或（3）或（4）或（5）限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；
（7）与（1）或（2）或（3）或（4）或（5）限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌。
5.权利要求1所述蛋白质在制备相思子毒素疫苗中的应用。
6.权利要求1所述蛋白质和佐剂在制备相思子毒素疫苗中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述佐剂为铝佐剂。
8.一种相思子毒素疫苗，其活性成分为权利要求1所述蛋白质。
9.如权利要求8所述的疫苗，其特征在于：所述疫苗还包括佐剂。
10.如权利要求9所述的疫苗，其特征在于：所述佐剂为铝佐剂。
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