CN103688165A - 磁致电泳的分析物选择和富集 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于磁致电泳的分析物选择和富集的设备及方法。其中，有磁标记的分析物，尤其细胞（16），可以在流动中从试样中动力地分离，使它们高浓度地存在于减小的试样体积内。尤其是，分析物选择可以连接分析器（30）。

Description

磁致电泳的分析物选择和富集

本发明涉及磁致电泳的分析物的选择和富集。

作为分析物主要是所关注的细胞。在细胞测量和细胞探测领域内，已知光学测量方法，如散光或荧光测量，以及磁性探测方法，此时要探测的细胞类型借助磁性标签作标记。

尤其已知一些基于磁性的测量方法，其中借助磁致电泳从复合的细胞悬浮液，例如血液试样，分选出有磁标记的细胞。做磁标记尤其通过在复合的细胞试样内引入细胞特有的标记来实现。磁致电泳迄今使用于分选有磁标记的细胞或一般的磁性粒子。

对于在诊断和科学研究的细胞测量，恰好也需要测量仅以非常低的浓度存在于血液试样内的细胞类型，例如播散性肿瘤细胞。此时通过试样制备造成的细胞损失是附加带来的最严重缺点。因此为了定量表示细胞的浓度，或还为了可靠证实规定的细胞，有必要由一种具有复杂背景的悬浮液实施要确定的细胞的上述富集。

细胞的这种富集迄今通过离心分离技术、免疫色谱分离法或借助磁力富集（MACS）实现。这些方法共同的缺点是，静力式地进行富集，亦即细胞富集在容器壁上或离心管的一个区段内。这些方法的富集因子在101至104的范围内并且不够高。除此之外，尤其在离心分离技术的情况下不能避免细胞承受机械负荷。

迄今已知的用于动力式细胞富集的磁致电泳法，同样具有富集因子低的缺点，它不超过100倍富集。作为已知的在层流内磁致电泳法的例子，列举了Jung等人在Applied Physics letters93,223902,2008中的公开文件。

本发明要解决的技术问题是，能够借助磁致电泳的分析物选择和富集，实现要探测的分析物在试样悬浮液内更高的浓度。

上述技术问题通过按专利权利要求1所述的设备得以解决。在专利权利要求11中给出了一种用于磁致电泳的分析物选择和富集的方法。本发明有利的扩展设计是从属权利要求的技术主题。

按本发明的用于磁致电泳的分析物选择和富集的设备，包括流动通道，用于富集的第一磁性单元，以及用于定位有磁标记的分析物的第二磁性单元。其中，规定在第一通道段内富集和定位分析物。为此，第一通道段包括这些磁性单元。在第二通道段内进行分离。所述流动通道在第二通道段内分解为至少两个分通道。这些分通道中的第一分通道在第三通道段内延伸。该分通道具有比在第一通道段内的流动通道小的横截面积。这样做的优点是，有磁标记的分析物可以引入此横截面积较小的分通道内，并因而在此分通道内每单位区段长度存在比在横截面积较大的流动通道内小很多的试样体积。通过这种减小试样体积能够达到高度增浓。

也就是说，通过恰当配置磁性单元，尤其导致有磁标记的分析物三维富集和导引，通过对通道的几何设计，这允许或能够达到试样体积所述的减小。通过沿流动方向收缩通道，富集因子能达到大于100。

按本发明一项有利的扩展设计，在第三通道段内第一分通道具有一个横截面积，它小于第一通道段内流动通道横截面积的二分之一。尤其是，它小于第一通道段内流动通道横截面积的1/10。例如所述第一分通道是一个微型射流通道。

优选地，在复合介质内，例如在血液试样内，进行细胞分析物的选择和富集。分析物，亦即细胞，具有在1与20μm之间变化的直径。典型地，测量直径为7至12μm的血液白细胞。对于所述的这种细胞的选择和富集，首先关注直径约有3μm的细胞类型，例如血小板，以及直径在8与12μm之间的细胞类型。CD4+-细胞例如有直径约7μm。但在一种细胞类型内部直径是变动的。肿瘤细胞典型地具有的直径为10至20μm。除细胞外，尤其还可以富集典型的直径为100nm至20μm有磁标记的聚合血球，所谓Bead，或也可以富集小的分析物，例如病毒。

优选地，分析物试样通过宽度很大的微型射流通道导引，它是直径的10至1000倍。原则上可以实现10μm至10000μm的通道直径。其中尺寸下限，亦即最小直径，受分析物直径的限制，以及尺寸上限受下述条件的限制，亦即通道内应主要能存在层流的流动。

按本发明另一项有利的扩展设计，一个第二分通道具有的横截面积和/或多个第二分通道具有的总的横截面积，足够大，能将试样体积送出，试样体积通过第一通道段内的流动通道进入第三通道段内的分通道。因此较大的第二分通道承担的任务是，送出存在的已从其中选出有标记的分析物的试样体积。如此引出试样体积是有利的和有特别重要的功能性意义，因为要不然会在试样流内造成速度梯度和例如导致干扰的涡流。

尤其是，第二分通道的横截面积和/或多个第二分通道总的横截面积如此大，以致不会明显影响试样体积的流动特性。也就是说，第二分通道或多个第二分通道设计为，不干扰试样体积内有磁标记的分析物的富集和定位。优选地，第二分通道的直径在100μm至10000μm之间。

按本发明一项有利的扩展设计，第三通道段内的第一分通道与第一通道段内的流动通道沿同一个方向延伸。也就是说，对于要选择的试样，流动方向没有拐弯地进行。仅试样体积中不打算选择的部分才从第一通道段原始的方向偏转。如此配置再次带来涉及流动特性方面的一些优点。

按本发明另一项有利的扩展设计，第一磁性单元在第一通道段内设置为，由此能产生梯度磁场，该梯度磁场将有磁标记的分析物在流动通道内部富集在通道底部。

尤其是，在第三通道段内第一分通道的通道底部与在第一通道段内流动通道的通道底部处于同一个高度。通道底部连续通过这些分段的所述的平面状延伸，再次带来不会引起不利地影响流动的优点。

按本发明另一项有利的扩展设计，第二磁性单元在第一通道段内设置为，由此有磁标记的分析物在流动通道内部沿一条轴线富集，这条轴线在第三通道段内在第一分通道的内部继续延伸。也就是说，有磁标记的分析物在第一通道段内富集在一条轴线上，该轴线将所述分析物直截了当地引入第一分通道内。

在第三通道段内还可以设置去往第一分通道的通道供给装置。这种在分析物分离的通道段后的通道供给装置其优点是，还可以将第二种标记提供给分析物。例如，借助通道供给装置可以将其他标记供给分析物以及例如通过抗体连接。若第一分通道将选择的分析物直接输入尤其用于细胞的测量装置，则这种通道供给装置具有突出的优点。第三通道段尤其还包括所述的测量装置。

用于分析物选择和富集的设备例如还包括分析物探测或分析物计数装置，尤其具有磁阻式传感器，所述装置安置在第二通道段末端或在第三通道段内。

尤其是，有磁标记的分析物的富集和导引可以通过磁标记的类型和/或通过设备内调整的流动速度来影响。流动速度则可以通过微型射流尺寸的设计来调整。此外，富集和导引还可以采取措施优化，亦即将磁致电泳的导引线有关其磁渗透性以及有关相对于流动方向的、其按此设置的角度设计为，能实现有磁标记的分析物的严格定位。可通过第一磁性装置产生的梯度磁场尤其是另一个调整螺钉，来优化一种规定的分析物类型，例如一种规定的细胞类型的富集。

例如，设备也可以具有多个已说明的磁致电泳的富集和选择段的一种串联排列布局，也就是说，串联多个尤其不同设计的富集和选择段。

在按本发明的用于磁致电泳的分析物选择和富集的方法中，造成含有磁标记的分析物试样的流动，试样中有磁标记的分析物在梯度磁场中动力式地富集和定位，从而使有磁标记的分析物集中在试样的部分体积内，以及这一部分体积与试样的其余体积动力式地分离。在一种尤其是细胞悬浮液的试样内分析物的这种动力富集和尤其是增浓，与迄今的方法相比其优点是，分析物，亦即尤其细胞，可以在没有机械负荷的情况下无应力地高度增浓，所以分析物能定量和测量。

按本发明一项有利的扩展设计，在此方法中有磁标记的分析物的富集和定位在流动通道内三维地进行，并以这样的方式，亦即借助第一磁性单元在通道内壁上实现富集，以及借助第二磁性单元沿一条轴线实现定位。在这里所述轴线按流动方向沿通道内壁延伸。这种三维富集和定位具有的优点是，选出的分析物可以在一个分通道内继续导送，此分通道盛装比富集流动通道小许多的体积。

例如在此方法中为选择的尤其是细胞的分析物提供其他标记。附加的标记尤其具有抗体，它们可以在细胞表面上连接特征同位素。本步骤的优点是，可给要选择的有磁标记的细胞加上另一些标记，而这些标记例如为了进一步的细胞测量是必要的。尤其是，如此做了附加标记的细胞被直接供给另一个细胞测量装置。尤其是，通过按本发明的设备进行富集和定位以及接着的选择，为此将细胞试样注入所述设备内。

所述的动力式富集突出的优点是，细胞可以在没有尤其由于机械负荷引起的应力的情况下，供给进一步导引的分析器。例如在选择后可以作荧光标记，以及耗费少量标记从事显微镜检查或流动细胞度量。

因为选择和富集可以直接与随后的加工或化验步骤结合，所以有利地缩短分析时间和不必进行试样转移。从而又带来无损失加工的优点，这涉及例如用于确定浓度的有标记的分析物的损失，以及减少消耗品，例如吸管头。

图1表示通过通道10剖开示出的横截面，该通道10从左向右被悬浮液15，例如血液试样流过。流动方向用箭头40表示，亦即至少一个用于试样15的进口处于通道10左侧，以及至少一个出口处于通道10右侧。悬浮液15至少含有一种类型的携带磁性标记的细胞16。这些有磁标记的细胞16首先在通道左段通过安置在通道底部下方的永久磁铁20朝通道底部方向偏转，并因而富集在通道底部。人们也将通道10具有永久磁铁20的这一区段称为富集段11。此外，所述富集段还用于有磁标记的细胞16的定位。为此，在通道底部上方，亦即在通道内侧，或作为替代方式进入通道底部内，设有另一些磁性装置21。用作导引线的尤其铁磁性条带21适合用于对有磁标记的细胞16的定位，这些铁磁性条带21在图1中只能看到各自的横截面。可以说条带21向图纸平面内延伸。

在定位和富集段11之后，接着将有磁标记的细胞16与其余悬浮液15分离。在选择区12内可以说存在多个流出方向40，这些流出方向40在图2所示的俯视图中能更清楚地看出。而图1所示的横截面清楚表明通道10在分离段12的末端收缩成微型射流通道13，基本上只还有在小的试样体积15内的有磁标记的细胞16才流动通过它。此外在微型射流通道13的区域内示意性表示出了探测设备30，它例如可以是显微镜检查设备或细胞流量计。所耦接的这种分析器具有的优点是，可以在无应力的情况下计算选择和富集的细胞16。

图2表示通道10的俯视图，它有三个区段，亦即定位和富集段11、分离段12以及微型射流段13。在通道10左侧在富集段11的区域内，按人字形结构设置铁磁性导引线21，它们将有磁标记的细胞16朝通道中心方向导引。因此所述的增浓是在平面内实现。与此同时，有磁标记的细胞16被所述安置在通道10下方的、在图中不能看到的永久磁铁朝通道底部方向拉近，这揭示了富集时的第三维度。己富集和定位的这些细胞16然后在分离段12的区域内流入微型射流通道101内。该微型射流通道包括比其余通道10小得很多的试样体积15。除微型射流通道100外，细胞试样15还可以从其左边和右边流出，这种情况通过三个具有箭头40的流动方向表示。在这里，分段101在微型射流通道100的左和右y形地离开中心流动方向延伸。整个通道体积15或通道几何尺寸在这里设计为，主要在分离段12的区域内不会在流动40内导致紊流，否则会干扰磁力富集和定位。与此相应地，流出区101必须包括足够大的试样体积15，从而可补偿在微型射流通道100上的收缩。富集段选择用A、微型射流段用B和侧面流出段用C作标记的这三个区域，可以在图3所示的正视图中看出。

图3的正视图未按尺寸比例地表示出富集流动通道A、微型射流段13，3以及在微型射流段B左侧和右侧的流出段C的不同的横截面。此示意图应清楚表示，微型射流段100选择得很狭窄，使有磁标记的细胞16能占据通道体积15的大部分，亦即高度增浓，并因而保证与此微型射流段100耦接的分析器30能可靠度非常高地实现单细胞探测。

图4再次表示流动通道10的俯视图。与图2中的实施形式相似，在第一分段11内包括磁力富集和定位段的流动通道10，与有磁标记的细胞16引入其中的分通道100沿一条共同的轴线延伸。在其中实施从悬浮液15分离有磁标记的细胞16的第二通道段12内，分通道101垂直于流动通道10向外延伸。它们仍有比分通道100大得多的宽度。分通道100尤其是一种微型射流通道。除了将容纳大部分原始试样液体15的分通道100垂直引出外，此实施形式还表示了与图2中y形结构设计的流动通道10相比的另一种改变，亦即制作在分通道100两侧的通道供给装置31。它们尤其设计用于提供附加的标记19。也就是说，在有磁标记的细胞16通过富集在通道底部上并通过磁致电泳定位沿磁力导引线21被引入分通道100内之后，给它们加上其他标记19，这些标记19给细胞16为了继续进行的细胞测量30做准备。有双重标记的细胞18经由微型射流通道100引入细胞测量装置30。所述附加的标记19可例如涉及荧光标记，以及与之相应地，细胞测量装置30涉及荧光探测器。

Claims (15)

1.一种用于磁致电泳的分析物选择和富集的设备，包括

-流动通道（10），

-用于富集的第一磁性单元（20），以及

-用于定位有磁标记的分析物（16）的第二磁性单元（20），

其中，在第一通道段（11）内设置这些磁性单元（10、20），以及在第二通道段（12）内所述流动通道（10）分解为至少两个分通道（100、101），以及在第三通道段（13）内第一分通道（100）具有比在第一通道段（11）内的流动通道（10）小的横截面积。

2.按照权利要求1所述的设备，其中，在第三通道段（13）内第一分通道（100）具有的横截面积，小于第一通道段（11）内流动通道（10）横截面积的二分之一，尤其小于第一通道段（11）内流动通道（10）横截面积的十分之一。

3.按照权利要求1或2之一所述的设备，其中，第二分通道（101）具有的横截面积和/或多个第二分通道（101）具有的总的横截面积，足够大，能将试样体积送出，试样体积通过第一通道段（11）内的流动通道（10）进入第三通道段（13）内的分通道（100、101）。

4.按照权利要求3所述的设备，其中，第二分通道（101）的横截面积和/或多个第二分通道（101）总的横截面积如此大，不会明显影响试样体积的流动特性，从而不干扰试样体积内有磁标记的分析物（16）的富集和定位。

5.按照前列诸权利要求之一所述的设备，其中，第三通道段（13）内的第一分通道（100）与第一通道段（11）内的流动通道（10）沿同一个方向延伸。

6.按照前列诸权利要求之一所述的设备，其中，第一磁性单元（20）在第一通道段（11）内设置为，由此能产生梯度磁场，该梯度磁场将有磁标记的分析物（16）在流动通道（10）内部富集在通道底部。

7.按照权利要求6所述的设备，其中，在第三通道段（13）内第一分通道（100）的通道底部与在第一通道段（11）内流动通道（10）的通道底部在同一个高度上延伸。

8.按照前列诸权利要求之一所述的设备，其中，第二磁性单元（21）在第一通道段（11）内设置为，由此有磁标记的分析物（16）在流动通道（10）内部沿一条轴线富集，这条轴线在第三通道段（13）内在第一分通道（100）的内部继续延伸。

9.按照前列诸权利要求之一所述的设备，包括向第三通道段（13）内第一分通道（100）供给的通道供给装置（31）。

10.按照前列诸权利要求之一所述的设备，所述设备在第三通道段（13）内包括分析物测量装置（30），它尤其设计用于细胞测量。

11.一种用于磁致电泳的分析物选择和富集的方法，其中，造成含有磁标记的分析物（16）试样的流动，有磁标记的分析物（16）在梯度磁场中动力地富集和定位，从而使有磁标记的分析物（16）集中在试样的部分体积内，以及将这一部分体积与试样的其余体积动力地分离。

12.按照权利要求11所述的方法，其中，有磁标记的分析物（16）的富集和定位在流动通道（10）内三维地进行，并以这样的方式，亦即借助第一磁性单元（20）在通道内壁上实现富集，以及借助第二磁性单元（21）沿一条轴线实现定位，在这里所述轴线按流动方向沿通道内壁延伸。

13.按照权利要求11或12之一所述的方法，其中，将选择的分析物供给其他标记。

14.按照权利要求11至13之一所述的方法，其中，将分析物试样注入按照权利要求1至10之一所述的设备中。

15.按照权利要求11至14之一所述的方法，其中，在进行分析物选择之后进行分析物的测量。

Images