CN103674947B - 一种痕量铜离子可视化快速检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种痕量铜离子可视化快速检测方法，以罗丹明B螺环内酰胺衍生物为Cu²⁺识别探针，结合Fe₃O₄磁性纳米粒子实现对Cu²⁺的高灵敏可视化快速检测。本发明利用磁性纳米粒子上修饰的罗丹明B螺环内酰胺衍生物可以特异结合铜离子并产生变色（由淡黄色变到粉紫色）的特点和磁性纳米粒子的富集作用，实现了对痕量Cu^2+？的可视化快速检测。该铜离子可视化快速检测方法具有快速、简单、高灵敏度、可视化、高特异性、低成本等特点，可用于各种水环境样品中痕量铜离子的快速可视化检测。

Description

一种痕量铜离子可视化快速检测方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种痕量铜离子可视化快速检测方法。

背景技术

铜元素是人体内继铁、锌后第三丰富的过渡金属元素，它广泛参与了生命体系中的一系列过程，是人体必须元素之一。但是作为重金属元素，铜具有很强的毒性，过量的铜摄入会对人体产生伤害。比如，铜(II)是一种潜在的诱变剂，高剂量的铜(II)离子可能导致哺乳动物细胞染色体的断裂和纺锤体干扰。威尔逊氏及门克斯病也是两种与铜代谢紊乱密切相关的人类遗传性疾病。所以，我国政府对水环境中铜离子的含量进行了严格限制，国标地表水环境质量标准（GB3838-2002）规定铜离子检测标准为0.01(I类)-1.0（II-V类）mg/L，饮用水的标准规定，铜离子的含量不得超过20μM。近些年来，随着经济的快速发展，作为有色过渡金属的铜被广泛应用在工业和农业的生产过程。但是由于过度的开发和利用，导致了环境特别是水环境中铜离子的严重污染。因此对环境和人体中的铜离子浓度进行现场快速检测具有重要意义。

目前，铜离子的检测方法主要有原子光谱法，电化学分析法，分子吸收光谱法，荧光光谱法，ICP-MS，ICP-AES等。但是，这些方法需要用到大型仪器，检测过程繁琐，无法用于现场的实时快速检测。相较上述的传统方法，比色法有其优势之处，如快速、便携、成本低、直观、可现场分析等。目前报道较多的比色法主要是基于有机聚合物与铜离子的络合显色或通过纳米金凝聚产生颜色变化。如专利GN102863725A发明了一种基于裸眼目视比色法检测水质中铜离子的聚合物探针—P(NVP-co-GMA-g-H)，并在此基础上制备了凝胶探针—P(NVP-co-Bis-(GMA-g-H))。但是由于合成有机聚合物的步骤繁琐，耗时较长且分离提纯过程困难，限制了其在铜离子检测中的应用。樊江莉等设计合成了一种新型罗丹明B衍生物探针，可实现对较低浓度的Cu²⁺的裸眼检测，制成试纸可检测mg/L级别含Cu²⁺水样。但是此方法的灵敏度不够，只达到1×10^-6mol/L。QuXiaogang课题组报道了一种基于Cu⁺离子催化点击化学反应方法，将碳纳米管结合到磁性二氧化硅纳米颗粒上，通过碳纳米管催化底物TMB显色间接测定Cu²⁺离子的浓度。同样使用电击化学的方法，JiangXingyu课题组发展了一种基于纳米金的检测Cu²⁺的方法。将叠氮化合物与三炔基化合物分别通过金巯键连接在纳米金的表面，用抗坏血酸钠将Cu²⁺还原为Cu⁺，在Cu⁺的催化下，叠氮化合物与三炔基化合物发生环加成反应，促使分散的纳米金稳定的结合在一起，通过纳米金颜色的变化检测铜离子。此方法快速、稳定、选择性好、检测限在20μM。这些点击化学反应是采用Cu(I)配合物催化，此类催化剂要求去除氧气，以免被氧化而失效，因此限制了点击化学在铜离子现场检测的应用。总之，上述所有快速检测方法存在着或成本高、或稳定性差、或灵敏度低和抗基体干扰能力较低等缺点，很难用于实际样品中痕量铜离子的检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种痕量铜离子可视化快速检测方法，利用磁性纳米粒子上修饰的罗丹明B螺环内酰胺衍生物可以特异结合铜离子并产生变色（由淡黄色变到粉紫色）的特点和磁性纳米粒子的富集作用，实现了对痕量Cu²⁺的可视化快速检测。该铜离子可视化快速检测方法具有快速、简单、高灵敏度、可视化、高特异性、低成本等特点，可用于各种水环境样品中痕量铜离子的快速可视化检测。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

采用室温快速搅拌法将罗丹明B螺环内酰胺衍生物修饰到Fe₃O₄磁性纳米粒子上，制备罗丹明B螺环内酰胺衍生物功能化的磁性纳米粒子检测液。所制备的罗丹明B螺环内酰胺衍生物功能化的磁性纳米粒子检测液呈淡黄色，在特定pH的HAc-NaNc缓冲溶液下，磁性纳米粒子表面的罗丹明B螺环内酰胺衍生物可与Cu²⁺鳌合，诱导使得罗丹明B螺环内酰胺开环，溶液从淡黄色变到粉紫色（随着Cu²⁺浓度的增大，溶液颜色也逐渐加深），达到对Cu²⁺的高灵敏可视化快速检测。

罗丹明B螺环内酰胺衍生物修饰的Fe₃O₄磁性纳米粒子检测液的制备方法具体如下：

（1）采用热分解法合成Fe₃O₄磁性纳米粒子。在10mL卞醚和10mL油胺的混合液中加入乙酰丙酮合铁(Ⅲ)(0.706g,2mmol)，使其溶解。接着，将混合物在110℃氮气流的环境中脱水1小时。然后，在300℃下，将混合物在充满氮气的环境中反应2小时。反应过后，将黑棕色的混合物冷却至室温，加入40mL的乙醇，离心收集（8000rpm），用乙醇洗涤3次。最后，将产物分散在正己烷中。

（2）回流法制备罗丹明B螺环内酰胺衍生物。

（a）首先，在100mL圆底烧瓶中（1~2粒磁石）加入罗丹明B1.20克（2.5mmol），30mL无水乙醇，室温快速搅拌下，逐滴加入过量的水合肼（3.0mL,85%）。油浴（75~78℃）回流2小时。溶液由深紫色变为浅橙色，逐渐澄清。2小时后，旋蒸样品，将多余溶剂除去。将1MHCl（约80mL）倒入圆底烧瓶里，溶解固体，形成澄清的红色液体。然后，在搅拌下，缓慢加入1MNaOH（约85mL），直到溶液pH达到9~10。沉淀物（罗丹明B酰肼）过滤收集（用15mL二次水反复清洗沉淀3次），干燥。

（b）取上述制备的罗丹明B酰肼产物0.5g（1.1mmol）溶于13mL的无水乙醇中，加入过量的乙二醛（2.0mL,40%），室温下快速搅拌8小时（避光）进行反应。然后将反应混合物倒入约30mL的饱和NaCl溶液中，随即产生浅红色絮状沉淀。将溶液转移到冰柜中静置，有利于沉淀析出，过滤沉淀并用二次水反复洗涤，干燥备用（b产物）。在100mL圆底烧瓶中（1~2粒磁石），加入b产物0.511克（1mmol），3,4-二羟基苯甲酰肼0.20克（1.2mmol）及30mL无水乙醇，氮气环境中油浴（75~78℃）回流，反应5小时后，将反应混合物倒入约60mL的饱和NaCl溶液中，随即产生浅红色絮状沉淀。将溶液转移到冰柜中静置，有利于沉淀析出，过滤沉淀并用二次水反复洗涤，干燥，得罗丹明B螺环内酰胺衍生物。

（3）采用室温快速搅拌法制备罗丹明B螺环内酰胺衍生物功能化的Fe₃O₄磁性纳米粒子检测液。取步骤（2）所制备的罗丹明B螺环内酰胺衍生物（约10mg）溶于1mLCH₂Cl₂与200μLDMSO的混合液中，加入2mg步骤（1）所制备的Fe₃O₄磁性纳米粒子溶液，室温下快速搅拌过夜（避光）。然后，向合成好的溶液中加入足量的正己烷，沉淀Fe₃O₄磁性纳米粒子，离心（10000rpm）收集磁性纳米粒子即得到罗丹明B螺环内酰胺衍生物功能化的Fe₃O₄磁性纳米粒子。接着用CH₂Cl₂/正己烷（1﹕5，v/v）洗涤所收集的罗丹明B螺环内酰胺衍生物功能化的Fe₃O₄磁性纳米粒子3次，最后将收集的罗丹明B螺环内酰胺衍生物功能化的Fe₃O₄磁性纳米粒子分散在DMSO中制备成罗丹明B螺环内酰胺衍生物功能化的Fe₃O₄磁性纳米粒子检测液。

测试时，根据Cu²⁺浓度的高低，取不同体积水样，在水样中加入100μL本发明制备的罗丹明B螺环内酰胺衍生物功能化的磁性纳米粒子检测液，混匀，80℃恒温下放置15分钟，用磁铁将罗丹明B螺环内酰胺衍生物功能化的磁性纳米粒子吸住，倒去上清液，将罗丹明B螺环内酰胺衍生物功能化的磁性纳米粒子放入600μL的缓冲溶液-甲醇混合液（缓冲溶液为50mM，pH=6.00的HAc-NaAc溶液；缓冲溶液/甲醇溶液=1/1，v/v），通过裸眼观测混合溶液颜色变化对Cu²⁺进行定量及半定量快速检测。

本发明的显著优点在于：

（1）本发明涉及的检测方法响应快，一次检测仅需15分钟时间。

（2）本发明涉及的检测方法具有高灵敏度，可检测低至5nM的铜离子浓度。最低检出限低于地表水和饮用水中铜离子含量国家标准（GB3838-2002），可用于水环境和饮用水中Cu²⁺的现场快速检测。

（3）本发明制备的罗丹明B螺环内酰胺衍生物功能化磁性纳米粒子检测液性质稳定，4℃冰箱保存3个月后仍可用于铜离子检测。

（4）本发明涉及的检测方法具有良好的特异性，该探针只对铜离子有显色反应，考察了12种常见离子（如Al³⁺、Ba²⁺、Ca²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Cr³⁺、Pb²⁺、Zn²⁺、Na⁺、K⁺），都不引起干扰。

（5）本发明涉及的检测方法操作简单，用裸眼即可观察实验现象，无需昂贵特殊仪器，避免了传统方法需要借助大型仪器操作过程，适合铜离子的现场快速检测。

（6）本发明涉及的检测方法由于采用磁性粒子分离技术，具有良好抗基体干扰能力，可用于成分复杂的实际水样中痕量铜离子的检测。检测水样无需复杂的前处理，只需要将水样过滤去除沙土及悬浮物，便可立即检测。

（7）成本低廉，一次检测成本仅约人民币0.1元。

附图说明

图1A为所制备的Fe₃O₄磁性纳米粒子的扫描电镜图；B为罗丹明B螺环内酰胺衍生物功能化Fe₃O₄磁性纳米粒子的扫描电镜图。

图2A为所制备的罗丹明B螺环内酰胺衍生物的化学结构图和质谱表征图；B为制备的罗丹明B螺环内酰胺衍生物的核磁共振表征图。

图3为利用所制备的罗丹明B螺环内酰胺衍生物功能化磁性纳米粒子检测液检测不同浓度Cu²⁺时溶液颜色的变化图及磁铁吸住罗丹明B螺环内酰胺衍生物功能化磁性纳米粒子时溶液的变化情况。

图4利用所制备的罗丹明B螺环内酰胺衍生物功能化磁性纳米粒子检测液检测Cu²⁺时的特异性验证。相比于12种常见离子，只有铜离子存在时罗丹明B螺环内酰胺衍生物功能化磁性纳米粒子检测液的颜色才发生变化。

具体实施方式

罗丹明B螺环内酰胺衍生物修饰的Fe₃O₄磁性纳米粒子检测液的制备方法具体如下：

（1）采用热分解法合成Fe₃O₄磁性纳米粒子。在10mL卞醚和10mL油胺的混合液中加入乙酰丙酮合铁(Ⅲ)(0.706g,2mmol)，使其溶解。接着，将混合物在110℃氮气流的环境中脱水1小时。然后，在300℃下，将混合物在充满氮气的环境中反应2小时。反应过后，将黑棕色的混合物冷却至室温，加入40mL的乙醇，离心收集（8000rpm），用乙醇洗涤3次。最后，将产物分散在正己烷中（如图1-A）。

（2）回流法制备罗丹明B螺环内酰胺衍生物。

（a）首先，在100mL圆底烧瓶中（1~2粒磁石）加入罗丹明B1.20克（2.5mmol），30mL无水乙醇，室温快速搅拌下，逐滴加入过量的水合肼（3.0mL,85%）。油浴（75~78℃）回流2小时。溶液由深紫色变为浅橙色，逐渐澄清。2小时后，旋蒸样品，将多余溶剂除去。将1MHCl（约80mL）倒入圆底烧瓶里，溶解固体，形成澄清的红色液体。然后，在搅拌下，缓慢加入1MNaOH（约85mL），直到溶液pH达到9~10。沉淀物（罗丹明B酰肼）过滤收集（用15mL二次水反复清洗沉淀3次），干燥。

（b）取上述制备的罗丹明B酰肼产物0.5g（1.1mmol）溶于13mL的无水乙醇中，加入过量的乙二醛（2.0mL,40%），室温下快速搅拌8小时（避光）进行反应。然后将反应混合物倒入约30mL的饱和NaCl溶液中，随即产生浅红色絮状沉淀。将溶液转移到冰柜中静置，有利于沉淀析出，过滤沉淀并用二次水反复洗涤，干燥备用（b产物）。在100mL圆底烧瓶中（1~2粒磁石），加入b产物0.511克（1mmol），3,4-二羟基苯甲酰肼0.20克（1.2mmol）及30mL无水乙醇，氮气环境中油浴（75~78℃）回流，反应5小时后，将反应混合物倒入约60mL的饱和NaCl溶液中，随即产生浅红色絮状沉淀。将溶液转移到冰柜中静置，有利于沉淀析出，过滤沉淀并用二次水反复洗涤，干燥，得罗丹明B螺环内酰胺衍生物。所制备的罗丹明B螺环内酰胺衍生物的化学结构图，质谱和核磁共振表征图如图2所示。

（3）采用室温快速搅拌法制备罗丹明B螺环内酰胺衍生物功能化的Fe₃O₄磁性纳米粒子检测液。取步骤（2）所制备的罗丹明B螺环内酰胺衍生物（约10mg）溶于1mLCH₂Cl₂与200μLDMSO的混合液中，加入2mg步骤（1）所制备的Fe₃O₄磁性纳米粒子溶液，室温下快速搅拌过夜（避光）。然后，向合成好的溶液中加入足量的正己烷，沉淀Fe₃O₄磁性纳米粒子，离心（10000rpm）收集磁性纳米粒子即得到罗丹明B螺环内酰胺衍生物功能化的Fe₃O₄磁性纳米粒子。接着用CH₂Cl₂/正己烷（1﹕5，v/v）洗涤所收集的罗丹明B螺环内酰胺衍生物功能化的Fe₃O₄磁性纳米粒子3次，最后将收集的罗丹明B螺环内酰胺衍生物功能化的Fe₃O₄磁性纳米粒子分散在DMSO中制备成罗丹明B螺环内酰胺衍生物功能化的Fe₃O₄磁性纳米粒子检测液（如图1-B）。

测试方法：

（1）在浓度5nM至5μM间取3至4个不同浓度，分别取铜标准溶液100mL，加入100μL本发明制备的罗丹明B螺环内酰胺衍生物功能化的磁性纳米粒子检测液，混匀，80℃恒温下放置15分钟，用磁铁将罗丹明B螺环内酰胺衍生物功能化的磁性纳米粒子吸住，倒去上清液，将罗丹明B螺环内酰胺衍生物功能化的磁性纳米粒子放入600μL的缓冲溶液-甲醇混合液（缓冲溶液为50mM，pH=6.00的HAc-NaAc溶液；缓冲溶液：甲醇溶液=1﹕1，v/v），观测颜色变化，用作比对标准。

（2）取100mL水样品，加入100μL本发明制备的罗丹明B螺环内酰胺衍生物功能化的磁性纳米粒子检测液，混匀，80℃恒温下放置15分钟，用磁铁将罗丹明B螺环内酰胺衍生物功能化的磁性纳米粒子吸住，倒去上清液，将罗丹明B螺环内酰胺衍生物功能化的磁性纳米粒子放入600μL的缓冲溶液-甲醇混合液（缓冲溶液为50mM，pH=6.00的HAc-NaAc溶液；缓冲溶液：甲醇溶液=1﹕1，v/v），观测颜色变化，对比步骤（1）所得的标准铜离子溶液的颜色，对样品中的铜离子进行半定量或定量检测。如图3所示。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (1)

1.一种痕量铜离子可视化快速检测方法，其特征在于：以罗丹明B螺环内酰胺衍生物为Cu²⁺识别探针，结合Fe₃O₄磁性纳米粒子实现对Cu²⁺的高灵敏可视化快速检测；

罗丹明B螺环内酰胺衍生物功能化的磁性纳米粒子检测液呈淡黄色，在特定pH的HAc-NaNc缓冲溶液下，磁性纳米粒子表面的罗丹明B螺环内酰胺衍生物与Cu²⁺鳌合，诱导罗丹明B螺环内酰胺开环，随着Cu²⁺浓度的增大，溶液颜色逐渐加深，达到对Cu²⁺的高灵敏可视化快速检测；

所述的罗丹明B螺环内酰胺衍生物修饰的Fe₃O₄磁性纳米粒子检测液的制备方法包括以下步骤：

（1）采用热分解法合成Fe₃O₄磁性纳米粒子

在10mL卞醚和10mL油胺的混合液中加入2mmol乙酰丙酮合铁(Ⅲ)，使其溶解，将混合物在110℃氮气流的环境中脱水1小时，在300℃下，将混合物在充满氮气的环境中反应2小时，将黑棕色的混合物冷却至室温，加入40mL的乙醇，离心，用乙醇洗涤3次，将产物分散在正己烷中；

（2）采用回流法制备罗丹明B螺环内酰胺衍生物

（a）在100mL圆底烧瓶中加入罗丹明B1.20克，30mL无水乙醇，室温快速搅拌下，逐滴加入过量的水合肼，75~78℃油浴回流2小时，溶液由深紫色变为浅橙色，逐渐澄清，2小时后，旋蒸除去多余溶剂，加入80mL1MHCl溶液，固体溶解形成澄清的红色液体，在搅拌下，缓慢加入1MNaOH溶液，至溶液pH达到9~10，沉淀物过滤，用二次水反复清洗3次，干燥；

（b）取步骤（a）制备的产物0.5g溶于13mL的无水乙醇中，加入过量的乙二醛，室温下快速搅拌8小时，避光反应，将反应混合物倒入饱和NaCl溶液中，随即产生浅红色絮状沉淀，将溶液转移到冰柜中静置，沉淀析出，用二次水反复洗涤，干燥；

（c）在100mL圆底烧瓶中加入步骤（b）的产物0.511克、3,4-二羟基苯甲酰肼0.20克及30mL无水乙醇，氮气环境中75~78℃油浴回流5小时，将反应混合物倒入60mL的饱和NaCl溶液中，随即产生浅红色絮状沉淀，将溶液转移到冰柜中静置，沉淀析出，过滤，用二次水反复洗涤，干燥，得罗丹明B螺环内酰胺衍生物；

（3）采用室温快速搅拌法制备罗丹明B螺环内酰胺衍生物功能化的Fe₃O₄磁性纳米粒子检测液

取步骤（2）所制备的罗丹明B螺环内酰胺衍生物10mg溶于1mLCH₂Cl₂与200μLDMSO的混合液中，加入2mg步骤（1）所制备的Fe₃O₄磁性纳米粒子溶液，室温下快速搅拌过夜，向合成好的溶液中加入足量的正己烷，沉淀Fe₃O₄磁性纳米粒子，离心，用体积比为1﹕5的CH₂Cl₂和正己烷混合溶液洗涤3次，分散在DMSO中制备成罗丹明B螺环内酰胺衍生物功能化的Fe₃O₄磁性纳米粒子检测液。