CN103667250B - 小麦条锈病抗性相关蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小麦条锈病抗性相关蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的与小麦条锈病抗性相关的蛋白，1）由序列表中序列4、5或6所示的氨基酸残基序列组成的蛋白质；2）将1）中的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有与序列4,5,6所示小麦条锈病抗性相关的蛋白相同活性的蛋白质。将小麦中的上述编码基因突变，破坏，敲除或者基因沉默等抑制上述编码基因在植物中的表达，可以降低小麦对条锈病的抗性，对于研究小麦条锈病，提供敏感型株系，为小麦抗病基因的研究作出贡献。
Description
技术领域
本发明涉及一种小麦条锈病抗性相关蛋白及其编码基因与应用。
背景技术
在漫长的进化过程中，植物产生了复杂的机制来识别病原菌的侵染并触发自身有效的免疫反应。植物先天免疫体系包括两大分支，一个是PAMP（pathogen-associatedmolecularpattern）触发的免疫系统（PAMP-triggeredimmunity，PTI），它是通过跨膜的受体蛋白PRRs（patternrecognitionreceptors）与PAMP相互应答而产生的早期对病原菌的抗性反应；另一个是效应子触发的免疫系统（effector-triggeredimmunity，ETI），它是通过植物抗性基因（R基因）编码的R蛋白对由病原菌无毒基因（Avr基因）编码的效应子进行直接或间接的识别而产生的免疫反应（ChisholmST,CoakerG，DayB,StaskawiczBJ.(2006).Host-microbeinteractions:shapingtheevolutionoftheplantimmuneresponse.Cell124:803-814;NimchukZ,EulgemT,HoltIIIBF,DanglJL.(2003).Recognitionandresponseintheplantimmunesystem.Annu.Rev.Genet.37:579-609）。植物的免疫反应是受抗性蛋白调控的，抗性蛋白通过识别特定的病原菌分子—Avr蛋白来起作用。植物受到病原菌侵染后，在抗性蛋白的作用下产生一些抗性反应，包括离子流动加快，活性氧的产生等。这些反应常常诱发超敏反应(HR)，从而引起侵染点的程序性细胞死亡（PCD）等。TaSGT1在植物受到病原菌侵染的情况下，通过与热激蛋白90及RAR1基因组成复合体，或是直接与植物抗性基因NBS-LRR类蛋白的LRR域互作(LiuY，Burch-SmithT,SchiffM,FengS,Dinesh-KumarSP.(2004).MolecularchaperoneHsp90associateswithresistanceproteinNanditssignalingproteinsSGT1andRar1tomodulateaninnateimmuneresponseinplants.JBiolChem279:2101-2108；BieriS,MauchS,ShenQH,PeartJ,DevotoA,CasaisC,CeronF,SchulzeS,SteinbissHH,ShirasuK,Schulze-LefertP.(2004).RAR1positivelycontrolssteadystatelevelsofbarleyMLAresistanceproteinsandenablessufficientMLA6accumulationforeffectiveresistance.PlantCell16:3480-3495;LeisterRT,DahlbeckD,DayB,LiY，ChesnokovaO,StaskawiczBJ.(2005).MoleculargeneticevidencefortheroleofSGT1intheintramolecularcomplementationofBs2proteinactivityinNicotianabenthamiana.PlantCell17:1268-1278）参与病原菌的抗性反应，而提高植物的抗病性。
大麦条纹花叶病毒（BarleyStripeMosaicVirus,BSMV）为α、β、γ3条链组成3链RNA病毒（结构如图1所示，外源基因片段（如TaPDS）反向插入γ链γb基因突变的终止子处）。利用BSMV-based介导的基因沉默系统被成功用于大麦和小麦功能基因的研究上(HeinI,Barciszewska-PacakM,HrubikovaK,WilliamsonS,DinesenM,SoenderbyIE,SundarS,JarmolowskiA,ShirasuK,LacommeC.(2005).Virus-InducedGeneSilencing-BasedFunctionalCharacterizationofGenesAssociatedwithPowderyMildewResistanceinBarley.PlantPhysiology138:2155-2164；ZhouHB,LiSF,DengZY，WangXP，ChenT,ZhangJS,ChenSY，LingHQ,ZhangAM,WangDW，ZhangXQ.(2007).Molecularanalysisofthreenewreceptor-likekinasegenesfromhexaploidwheatandevidencefortheirparticipationinthewheathypersensitiveresponsetostriperustfungusinfection.ThePlantJournal52,420–434.；WangG，WeiX,FanR,ZhouH,WangX.YuC,DongL,WangX,KangZ,LingH,ShenQ,WangD,ZhangX.(2011)Molecularanalysisofcommonwheatgenesencodingthreetypesofcytosolicheatshockprotein90(hsp90):functionalinvolvmentofctosolichsp90sinthecontrolofwheatseedlinggrowthanddiseaseresistance.NewPhytol.,191:418-431)。本研究所用的BSMV病毒载体是由AndyJackson教授（UniversityofCalifornia,Berkeley）馈赠。当BSMV侵染植物时，植物通过DCL4和DCL2产生相应的siRNA对病毒RNA进行剪接，由此抵御病毒的伤害。但病毒RNA中携带有外源基因片段时，其siRNA也会导致植物内源基因的沉默，由此产生植物基因沉默的表型(DekerisA.,Gallego-BartolomeJ.,BaoJ.,KasschauK.,CarringtonJ.,VoinnetO.(2006).HierarchicalActionandInhibitionofPlantDicer-LikeProteinsinAntiviralDefense.Science.313(5783),68-71)。分子病毒学研究表明，在γb基因后插入外源片段时不影响其对植物的侵染活性。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种小麦条锈病抗性相关基因及其编码蛋白。
本发明所提供的小麦条锈病抗性相关的一类蛋白，名称为TaSGT1，来源于小麦(TriticumaestivumL.)，分别编号为TaSGT1-3A,TaSGT1-3B和TaSGT1-3D，是如下1）-6）中任意一项所述的蛋白质：
1）由序列表中序列4所示的氨基酸残基序列组成的蛋白质；
2）将序列表中序列4的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有与序列4所示植物与条锈病抗性相关的相同活性的蛋白质分子伴侣蛋白；
3）由序列表中序列5所示的氨基酸残基序列组成的蛋白质；
4）将序列表中序列5的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有与序列5所示小麦条锈病抗性相关的蛋白相同活性的蛋白质；
5）由序列表中序列6所示的氨基酸残基序列组成的蛋白质；
6）将序列表中序列6的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有与序列6所示小麦条锈病抗性相关的蛋白相同活性的蛋白质。
序列表中序列4由378个氨基酸残基组成；序列表中序列5由377个氨基酸残基组成；
序列表中序列7由377个氨基酸残基组成。他们之间具有非常高的同源性，只有四个氨基酸残基的差异，并且功能相同。
为了使1）、3）或5）中的TaSGT1便于纯化，可在由序列表中序列4-6所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1.标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6（通常为5个） | RRRRR |
| Poly-His | 2-10(通常为6个） | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
上述2）、4）或6）中的TaSGT1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述2）、4）或6）中的TaSGT1的编码基因可通过将序列表中序列1、序列2或序列3所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
上述小麦条锈病抗性相关蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。其中，
所述序列表中序列4所述蛋白的编码基因的序列是下列脱氧核苷酸序列之一：
1）序列表中序列1的DNA序列；
2）序列表中序列1的自5′末端第1--1134位脱氧核糖核苷酸；
3）编码序列表中序列4所示蛋白质序列的多核苷酸；
4）在严格条件下与1）或2）或3）的基因杂交且编码序列表中序列4所示蛋白的基因；
5）与1）或2）或3）的基因具有90％以上的同源性且编码序列表中序列4所述蛋白的基因。
所述序列表中序列5所述蛋白的编码基因的序列是下列脱氧核苷酸序列之一：
1）序列表中序列2的DNA序列；
2）序列表中序列2的自5′末端第1-1131位脱氧核糖核苷酸；
3）编码序列表中序列5所示蛋白质序列的多核苷酸；
4）在严格条件下与1）或2）或3）的基因杂交且编码序列表中序列4所示蛋白的基因；
5）与1）或2）或3）的基因具有90％以上的同源性且编码序列表中序列4所示蛋白的基因；
所述序列表中序列6所述蛋白的编码基因的序列是下列脱氧核苷酸序列之一：
1）序列表中序列3的DNA序列；
2）序列表中序列3的自5′末端第1-1131位脱氧核糖核苷酸；
3）编码序列表中序列6所示蛋白质序列的多核苷酸；
4）在严格条件下与1）或2）或3）的基因杂交且编码序列表中序列4所示蛋白的基因；
5）与1）或2）或3）的基因具有90％以上的同源性且编码序列表中序列4所示蛋白的基因。
序列表中的序列1由1337个碱基组成，其开放阅读框架（ORF）为自5′末端第1-1334位碱基，编码具有序列表中序列4的氨基酸序列的蛋白。序列表中的序列2由1334个碱基组成，其开放阅读框架（ORF）为自5′末端第1-1131位碱基，编码具有序列表中序列5的氨基酸序列的蛋白。序列表中的序列3由1334个碱基组成，其开放阅读框架（ORF）为自5′末端第1-1131位碱基，编码具有序列表中序列6的氨基酸序列的蛋白。
含有上述基因的重组表达载体、转基因细胞系或重组工程菌。以及权利要求7所述的蛋白或其编码基因在培育条锈病抗性提高或降低的小麦中的应用。
本发明所提供的培育条锈病抗性降低的小麦的方法，是抑制小麦中基因组中序列表中序列1所示基因、序列2所示基因和序列3所示基因中的一种或者两种以上基因的表达，筛选得到条锈病抗性降低的小麦植株。
其中，所述抑制小麦中基因组中序列表中序列1所示基因、序列2所示基因和序列3所示基因中的一种或者两种以上基因的表达的方法包括突变或敲除小麦中的所述基因的全部或者部分序列，或者使用干扰RNA干扰所述基因的表达，或者使用BSMV-basedVIGS介导的基因沉默系统使所述基因沉默。
所述使用BSMV-basedVIGS介导的基因沉默系统使所述基因沉默的方法，是将序列表中序列1所示基因、序列2所示基因或序列3所示基因中的一段DNA片段插入到BSMV-basedVIGS的RNAγ链γb基因后与BSMV病毒载体α、β混合后获得重组病毒，将该重组病毒侵染小麦，筛选得到序列表中序列1所示基因、序列2所示基因和序列3所示基因中的一种或者两种以上基因沉默的转基因小麦。
所述序列表中序列1所示基因、序列2所示基因或序列3所示基因中的一段DNA片段为序列优选为自序列表中序列1的5’端第534-968位核苷酸序列的DNA片段；所述DNA片段插入到BSMV-basedVIGS的γ质粒的NheI位点。
本发明还提供一种用于培育条锈病抗性降低的小麦的重组病毒，是将序列表中序列1所示基因、序列2所示基因或序列3所示基因中的一段DNA片段插入到BSMV-basedVIGS的RNAγ链γb基因与BSMV病毒载体α、β混合后获得的重组病毒。
本发明人从普通小麦(TriticumaestivumL.)品种小偃54中克隆到一类SGT1基因，命名为TaSGT1。构建了用于沉默小麦中TaSGT1基因的病毒诱导性载体，侵染普通小麦品种水原11，降低TaSGT1基因的表达，接种条锈病CYR17，小麦叶片上出现许多条锈菌孢子堆，小麦植株显现明显的条锈病抗性丧失表型。将小麦中的上述编码基因突变，破坏，敲除或者基因沉默等抑制上述编码基因在植物中的表达，可以降低小麦对条锈病的抗性，反之推测，提高小麦中该类基因的表达可能能够提高小麦对于条锈病的抗性，对于研究小麦条锈病，提供敏感型株系，为小麦抗病基因的研究作出贡献。
附图说明
图1为BSMV-basedVIGS系统载体结构示意图，以TaPDS基因为例作为外源基因片段反向插入γ链γb基因突变的终止子处。
图2为基因沉默后TaSGT1的表达情况。
图3为病毒诱导TaSGT1基因沉默后水原11对条锈菌小种CYR17的抗性变化。
具体实施方式
下面通过实施例详细描述本发明。本领域的普通技术人员应当理解，下述实施例不是用于限制的目的，本发明的实质性的保护范围由后附的权利要求所界定。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量
实施例中所用试剂如下：
高保真PyrobestTaq、PremixExTaq、RNA酶抑制剂、各种限制性内切酶、反转录试剂盒、pMD18-TVector购自大连宝生物（TaKaRa）公司；DNA纯化回收试剂盒购自天根生物技术公司；转录相关试剂盒购自普洛麦格（北京）生物技术有限公司。
实施例1、条锈病抗性降低的小麦的获得方法及其效果验证
一、小麦条锈病抗性相关基因的获得
取生长7天的普通小麦品种小偃54（该品种是2000年8月通过陕西省农作物品种审定委员会审定，吴会杰，魏学宁，周新力，曹双河，李宏伟，王献平，童一平，井金学，张相岐。小偃54和小偃81高温抗条锈性及其与几丁质酶基因表达的关系。麦类作物学报，2007,27（6）:1117-1122公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得）幼苗叶片为材料，洗净后放入经DEPC处理、灭菌后研钵中研磨粉碎，加入TRIzol（Invitrogen）研磨、匀浆，室温放置5分钟，加入氯仿抽提2次，取上清，用异丙醇沉淀总RNA，空气干燥后，溶于适量DEPC水。以带polyT的引物（TaKaRa）进行反转录获得cDNA。
RTPCR反应条件如下：
DEPC水2μL，总RNA1μg，OligodT-引物1μL（初浓度10mM），整个体系总体积6μL。70度保温10分钟，立刻置于冰上2分钟，再在上述体系中加入dNTP0.5μL（dATP，dGTP，dTTP，dCTP分别10mM），RNase抑制剂0.25μL(1个单位)，10倍反转录缓冲液1μL，M-MLV反转录酶0.25μL(1个单位)，DEPC水2μL，整个体系总体积10μL。42度保温60分钟，70度保温15分钟，反应完成后置于4度。
取上述反转录产物以以下引物进行扩增。
正向引物：SGT1-F：5′-CCGTCGATCTCTATTCACCTCTC-3′
反向引物：SGT1-R：5′-ACAACATGGATGATCTGGATTC-3′；
PCR条件：94℃1min，然后94℃15s，58℃15s，72℃2min30个循环，最后72℃5min。
PCR产物为大小约1.1kb的片段，将PCR产物连接到pMD18-T载体（TaKaRaBiotech）上用于测序，采用本领域公知公用的DNAman软件进行序列拼接后，在万维网上NCBI数据库中进行比对分析，确证通过上述PCR反应克隆到的是SGT1类得基因片段。利用这对引物组合，从普通小麦品种小偃54中克隆到了3条不同的cDNA序列，即3个SGT1基因.统称为TaSGT1，分别编号为TaSGT1-3A,TaSGT1-3B和TaSGT1-3D，其中，TaSGT1-3A具有序列表中序列1的核苷酸序列，其编码的氨基酸长度378个氨基酸残基，序列为序列表中序列4所示的氨基酸残疾序列，TaSGT1-3B具有序列表中序列2的核苷酸序列，其编码的氨基酸长度377个氨基酸残基，序列为序列表中序列5所示的氨基酸残疾序列，TaSGT1-3D具有序列表中序列3的核苷酸序列，，其编码的氨基酸长度377个氨基酸残基，序列为序列表中序列6所示的氨基酸残疾序列。三个基因间的序列相似性非常高，核苷酸和氨基酸序列相似性都在98%以上。将TaSGT1-3A连接到pMD18-T载体得到的重组载体命名为pMD18-TaSGT1-3A，将TaSGT1-3B连接到pMD18-T载体得到的重组载体命名为pMD18-TaSGT1-3B，将TaSGT1-3D连接到pMD18-T载体得到的重组载体命名为pMD18-TaSGT1-3D。
二、基因沉默建立条锈病抗性降低的小麦株系
1、病毒载体BSMV-basedVIGS系统的构建
小麦品种水原11（ZhouHB,LiSF,DengZY，WangXP，ChenT,ZhangJS,ChenSY，LingHQ,ZhangAM,WangDW，ZhangXQ.(2007).Molecularanalysisofthreenewreceptor-likekinasegenesfromhexaploidwheatandevidencefortheirparticipationinthewheathypersensitiveresponsetostriperustfungusinfection.ThePlantJournal52,420-434.由韩国引进的品种，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得）：抗旱的普通小麦(TriticumaestivumL.)品种，基因组为AABBDD（六倍体），以步骤1中获得的质粒pMD18-TaSGT1-3D作为模板，选取三个SGT1基因保守区段，利用引物组合SGT1-VF1:5’-ATTGCTAGCTACAGGCATGACTACTACAA-3’；SGT1-VR1:5’-TAAGCTAGCTCACTGTAAATTTCACGGA-3’，扩增得到452bp的片段（自序列1的5′端第534-986位核苷酸）。按照常规分子生物学手段进行载体构建（参见“精编分子生物学实验指南”2001，科学出版社，颜子颖，王海林译）。将该扩增片段经NheI酶切后，回收，将片段克隆到BSMV-basedVIGS系统载体（HolzbergS.，BrosioP.，GrossC.，PogueG.（2002）Barleystripemosaicvirus-inducedgenesilencinginamonocotplant.PlantJ.,30:315-327，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得）γ质粒的NheI位点（RNAγ链γb基因后）得到重组载体，将该重组载体用SGT1-VR1和引物γ-strain-p5′-CAACTGCCAATCGTGAGTAGG-3′PCR扩增鉴定筛选反向插入的载体，扩增获得520bp片段的载体即为反向插入上述SGT1-VF1和SGT1-VR1扩增的片段的载体，并对插入片段进行测序验证，将该鉴定正确的载体命名为sgt1，又称，sgt1与α和β质粒共同构成了可沉默TaSGT1基因的BSMV:SGT1病毒系统（图1，以TaPDS为例说明外源基因片段插入位置及方向）。
2、条锈病抗性降低的小麦株系即病毒载体诱导的基因沉默系统的建立
BSMV病毒载体α、β和GFP（BSMV:GFP）质粒（HolzbergS.，BrosioP.，GrossC.，PogueG.（2002）Barleystripemosaicvirus-inducedgenesilencinginamonocotplant.PlantJ.,30:315-327）组成BSMV:GFP病毒载体，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
利用引物VPDS-P1：5′-AGGGCTAGCCTGATCGAGTCAACGACGA-3′和VPDS-P25′-CAGGCTAGCGATGACACCCAAAGACTGAATGTGG-3′扩增小偃54cDNA，扩增得到的片段为TaPDS，将该扩增片段经NheI酶切后，回收，将片段克隆到BSMV-basedVIGS系统载体γ质粒的NheI位点，将该鉴定正确的载体命名为PDS，PDS与α和β质粒共同构成了可沉默TaPDS基因的病毒系统BSMV:PDS病毒载体。
待水原11生长至二叶期时，将BSMV病毒涂抹接种于植株平展的第二叶上，BSMV:GFP病毒表达γb-GFP融合蛋白后能使植株叶片上呈现可视的病毒斑。为了进一步确认病毒的侵染，利用特异引物对BSMV外壳蛋白基因的转录产物进行了检测。具体方法如下所述：
按照GenEluteTMPlasmidMiniprepKit(Sigma)说明书分别抽提BSMV病毒载体α、β和GFP质粒，PDS质粒以及sgt1质粒，其中α、GFP、PDS和sgt1用MluI，β用SpeI分别进行线性化酶切。体外转录反应按照AmpliCap-MaxTMT7HighYieldMessageMakerKit(Epicentre)说明书进行操作：
RNase-freewaterXμL，线性化质粒1.5μg，10×TranscriptionBuffer2μL，Cap/NTPPreMix8μL，100mMDTT2μL，Amplicap-MaxTMT7EnzymeSolution2μL，反应总体积20μL，42℃反应2.5h，转录产物置-70℃保存备用。
BSMV:GFP病毒系统α和β以及GFP或BSMV:SGT1病毒系统的α和β以及
sgt1或者BSMV:PDS病毒系统α和β以及PDS的三链转录物均用灭菌超纯水稀释3倍后等体积混合，加入等体积的2×GKPBuffer（GKPBuffer含有50mM甘氨酸（glycine）,30mMK2HPO4,pH9.2,1%（质量百分比）膨润土（bentonite）,1%（质量百分比）硅藻土（celite）），取8-20μl分别接种二叶期水原11幼苗第二叶，10分钟后用灭菌超纯水喷施叶面，覆保鲜膜保湿24小时，之后转为正常条件培养。以1×GKP接种（buffer模拟接种）为对照。分别获得了MOCK(对照)、转BSMV:GFP株系、转BSMV:PDS、转BSMV:SGT1株系。转BSMV:SGT1株系即为本发明条锈病抗性降低的小麦株系。
3、病毒诱导SGT1基因沉默的RT-PCR验证步骤2中PCR扩增的保守片段在普通小麦(TriticumaestivumL.)品种水原11中三个SGT1基因（SEQIDNO:1-3）及其保守，步骤2中的BSMV-basedVIGS系统可使3个基因同时被沉默。监测BSMV-basedVIGS系统是否有效地使SGT1基因沉默。具体方法如下所述：
按照步骤2中病毒接种后获得的MOCK(对照)、转BSMV:GFP株系、转BSMV:PDS株系、转BSMV:SGT1株系，取第四叶按照实施例1中的方法，提取总RNA，反转录后半定量RT-PCR检测小麦SGT1基因的表达。设置感染BSMV:PDS(利用引物VPDS-P1：5′-AGGGCTAGCCTGATCGAGTCAACGACGA-3′和VPDS-P25′-CAGGCTAGCGATGACACCCAAAGACTGAATGTGG-3′扩增小麦cDNA，将该鉴定正确的载体命名为PDS，PDS与α和β质粒共同构成了可沉默TaPDS基因的病毒系统BSMV:PDS)，BSMV:GFP病毒的植株和1×GKPBuffer模拟接种的植株为对照。同时检测大麦花叶病毒外壳蛋白基因CP（CP-F：5′-TGACTGCTAAGGGTGGAGGA-3′和CP-R：5′-CGGTTGAACATCACGAAGAGT-3′），检测TaPDS（TaPDS-F：5′-CAGTCTTTGGGTGGTGAGGT-3′和TaPDS-R：5′-GGGACGGTCTTGTAAACGGA-3′）基因的转录水平，设置Tubulin（PTu1:5′-TGAGGACTGGTGCTTACCGC-3′和PTu2:5′-GCACCATCAAACCTCAGGGA-3′）为内参。检测TaSGT1所用的引物为：SGT1-BF1:5′-ACTGCAAAGGCTGCTCTTGAA-3′和SGT1-BR1:5′-GACGAGGCTGA(G)AAATGGTATG-3′。
结果表明，对病毒BSMV:SGT1,BSMV：PDS或BSMV:GFP成功侵染的植株，都可以检测到病毒外壳基因CP的表达，而模拟接种的Mock则没有CP的表达。模拟接种MOCK,BSMV:PDS（转BSMV:PDS株系）或BSMV:GFP（转BSMV:GFP株系）的植株中TaSGT1三个SGT1基因的表达没有明显变化，而接种病毒BSMV:SGT1的植株（转BSMV:SGT1株系）TaSGT1的三个SGT1基因的表达得到了明显的抑制，达到基因沉默的效果（图2）。
4、条锈病菌CYR17接种侵染验证转BSMV:SGT1株系的条锈病抗性
条锈菌接种实验在中国农业科学院植物保护研究所进行，条锈菌小种CYR17（ZhouHB,LiSF,DengZY，WangXP，ChenT,ZhangJS,ChenSY，LingHQ,ZhangAM,WangDW，ZhangXQ.(2007).Molecularanalysisofthreenewreceptor-likekinasegenesfromhexaploidwheatandevidencefortheirparticipationinthewheathypersensitiveresponsetostriperustfungusinfection.ThePlantJournal52,420–434.该菌种可由中国农业科学院植物保护研究所购得）由普通小麦品种水原11对条锈菌小种CYR17表现高抗，因而用它作为条锈菌功能鉴定的品种。当水原11幼苗按照步骤2的方法接种BSMV病毒约20天后（即将步骤2获得的MOCK(对照)、转BSMV:GFP株系、转BSMV:PDS、转BSMV:SGT1株系培养20天后）开始接种条锈菌小种CYR17。将待接种的小麦苗放到接种桶内，用0.1%（体积百分含量）的Toween20溶液将小麦苗及接种桶周围均匀喷湿，然后进行CYR17小种的扫抹接种，之后再用0.1%的Toween20均匀喷湿，用塑料纸将桶口封严保湿。接种后，幼苗进行低温（10℃）黑暗处理24h，以保证条锈菌的成功侵染。第二天再移至人工气候室生长，白天温度为15-18℃，晚上11-14℃，湿度为80%左右，光照强度为6000Lux，光照时间为16h/d。实验同时接种小麦品种铭贤169（曹张军，王献平，王美南，曹双河，井金学，商鸿生，李振岐，张相岐。小麦背景中来自华山新麦草的抗条锈病基因的遗传学分析和分子标记。植物遗传学，2005.32（7）738-743。铭贤169是在我国的一个古老品种，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得）作为感病对照。15天后观察表型，发现当将小麦品种水原11中的TaSGT1沉默后，接种条锈菌CYR17，小麦叶片上出现许多条锈菌孢子堆，而模拟接种对照和接种GFP的植株上则出现了许多坏死斑，表明产生了超敏反应(HR)（图3）。结果说明，TaSGT1参与了小麦对条锈病原菌CYR17的抗性过程。
Claims (2)
1.一种培育条锈病抗性降低的小麦的方法，是抑制小麦中基因组中序列表中序列1所示基因、序列2所示基因和序列3所示基因的表达，筛选得到条锈病抗性降低的小麦植株；
所述抑制小麦中基因组中序列表中序列1所示基因、序列2所示基因和序列3所示基因的表达的方法包括突变或敲除小麦中的所述基因的全部或者部分序列，或者使用干扰RNA干扰所述基因的表达，或者使用BSMV-basedVIGS介导的基因沉默系统使所述基因沉默；
所述使用BSMV-basedVIGS介导的基因沉默系统使所述基因沉默的方法，是将序列表中序列1所示基因、序列2所示基因或序列3所示基因中的一段DNA片段插入到BSMV-basedVIGS的RNAγ链γb基因后获得重组病毒，将该重组病毒侵染小麦，筛选得到序列表中序列1所示基因、序列2所示基因和序列3所示基因沉默的转基因小麦；
所述序列表中序列1所示基因、序列2所示基因或序列3所示基因中的一段DNA片段为序列为自序列表中序列1的5'端第534-986位核苷酸序列的DNA片段；所述DNA片段插入到BSMV-basedVIGS的γ质粒的NheI位点。
2.一种用于培育条锈病抗性降低的小麦的重组病毒，是将序列表中序列1所示基因、序列2所示基因或序列3所示基因中的一段DNA片段插入到BSMV-basedVIGS的RNAγ链γb基因后获得的重组病毒；
所述序列表中序列1所示基因、序列2所示基因或序列3所示基因中的一段DNA片段的核苷酸序列为自序列表中序列1的5'端第534-986位核苷酸序列；所述DNA片段插入到BSMV-basedVIGS的γ质粒的NheI位点。
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|---|---|---|---|
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-
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|---|
| Development of a Virus-Induced Gene-Silencing System for Hexaploid Wheat and Its Use in Functional Analysis of the Lr21-Mediated Leaf Rust Resistance Pathway;Steven et al;《Plant Physiology》;20050831;第2166页右栏第2段-第2170页左栏第2段，第2171页右栏最后一段-2178页右栏第1段，图4 * |
| EF197821.2;Tai et al;《Genbank》;20080806 * |
| Interactome of signaling networks in wheat: the protein–protein interaction between TaRAR1 and TaSGT1;Tai et al;《Mol Biol Rep》;20081231;337–343 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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