CN103656659B

CN103656659B - 一种靶向载体、抗肿瘤药物及其应用

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Publication number: CN103656659B
Application number: CN201210364794.0A
Authority: CN
Inventors: 包骏; 陈海铭
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2012-09-26
Filing date: 2012-09-26
Publication date: 2016-01-06
Anticipated expiration: 2032-09-26
Also published as: CN103656659A

Abstract

本发明涉及抗肿瘤药物领域，具体公开了一种靶向载体、抗肿瘤药物及其应用。本发明的可携带药物的靶向载体，为连接有果糖的白蛋白；抗肿瘤药物由靶向载体和载有的化疗药物组成。本发明的靶向载体能够靶向作用于肿瘤细胞；本发明的抗肿瘤药物包括化疗药物、作为药物载体的白蛋白，以及与白蛋白连接的具有导向作用的果糖，与单独使用的抗肿瘤化疗药物相比，具有更佳的癌细胞特异性、更强的细胞毒性，以及更优的使用安全性，在肿瘤治疗领域具有广阔的应用前景。

Description

一种靶向载体、抗肿瘤药物及其应用

技术领域

本发明涉及抗肿瘤药物领域，具体公开了一种靶向载体、抗肿瘤药物及其应用。

背景技术

据报道，肿瘤细胞可通过允许除葡萄糖以外的其它基质进入其代谢途径来转换或补充其养分库，以便适应低氧/低血糖条件。白蛋白是最丰富的血浆蛋白质（35-50g/L人血清），其分子量为66.5kDa。白蛋白在临床环境中作为药物载体的作用日益增加，并且存在白蛋白递送系统可用于评估若干种不同的药物（KratzF.Albuminasadrugcarrier:designofprodrugs,drugconjugatesandnanoparticles.JControlRelease(2008);32:171-83）。然而，一些炎症疾病（例如类风湿性关节炎）会增加人血清白蛋白的摄取，因为炎症关节炎通常发展成主要由发炎部位的高白蛋白消耗所造成的低白蛋白血症。多烯紫杉醇（DTX）是微管解聚的抑制剂并且针对多种实体肿瘤具有广泛的抗肿瘤活性。其被用于治疗乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌以及非小细胞肺癌。多烯紫杉醇被认为与作为细胞毒性剂的太平洋紫杉醇（paclitaxel）、阿霉素（doxorubicin）和氟二氧嘧啶（fluorouracil）同样有效或更有效（Lyseng-WilliamsonA.K.andFentonC.Docetaxel:AReviewofitsUseinMetastaticBreastCancerDrugs(2005);65(17):2513-2531）。在20世纪中期，文献中首次出现了表明肿瘤能够截留血浆蛋白质并且利用其降解产物进行增殖的报道（A.L.Babson,T.WinnickProteintransferintumor-bearingratsCancerRes.,(1954),14pp.606–611；MatsumuraY,MaedaH.Anewconceptformacromoleculartherapeuticsincancerchemotherapy:mechanismoftumoritropicaccumulationofproteinsandtheantitumoragentsmancs.CancerRes1986;46:6387-92.）。

纳米技术在医学且更确切地说在药物递送中的使用开始迅速地扩展。目前正在针对许多物质进行关于药物递送且更确切地关于癌症疗法的研究。有趣的是，药物科学正使用纳米粒子来降低毒性、减轻副作用以及增加功效。中国的一项关于纳米白蛋白结合性的太平洋紫杉醇（nab-paclitaxel）的临床试验显示，相比溶剂型紫杉醇（175mg/m²IV，经3小时，每3周），210名服用纳米白蛋白结合型太平洋紫杉醇（260mg/m²IV，经30分钟，每3周）的转移性乳腺癌中国患者提供了更高反应率和更长的肿瘤进展时间，而无增加的毒性（Z.Guan,F.Feng,Q.L.Li,Z.Jiang,Z.Shen,S.Yu,J.Feng,J.Huang,Z.Yao,M.J.Hawkins,Randomizedstudycomparingnab-paclitaxelwithsolvent-basedpaclitaxelinChinesepatients(pts)withmetastaticbreastcancer(MBC),J.Clin.Oncol.(2007)25;1038.）。

已知肿瘤内环境因恶性细胞的高糖酵解活性、血管供应不足以及血液循环缓慢而呈酸性，pH值低至5.6（GriffithsJJArecancercellsacidic?(1991)BrJCancer64:425-427）。因为不同的代谢途径直接受酸度影响，所以酸性的肿瘤内环境将显著影响肿瘤细胞的存活率和增殖。现有研究显示，肿瘤中低氧在某种程度上通过诱导低氧诱导因子(HIF)-1来促进致命的癌症表型，所述低氧诱导因子(HIF)-1可控制有助于肿瘤进展的血管生成相关性基因的表达（EvaluationofHIF-1inhibitorsasanticanceragents.DrugDiscovToday2007;12:853–9）。

人体白蛋白在血液循环中作为药物载体在酸性的肿瘤环境中更容易分解，从而释放出捷带的药物。（EricSanchez,MingjieLi,CathyWang,etal.Anti-MyelomaEffectsoftheNovelAnthracyclineDerivativeClinCancerRes(2012）;10.1158/1078-0432）。在癌症化疗领域，白蛋白作为药物载体，其作用于癌细胞的靶向性存在缺陷，使药物不仅作用于癌细胞，还可能作用于健康细胞，使患者健康细胞受到损伤。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种靶向载体及抗肿瘤药物。本发明的靶向载体以白蛋白为药物载体，以果糖为导向，采用该靶向载体运载的抗肿瘤药物能够将化疗药物靶向作用于肿瘤细胞，减少化疗对正常体细胞的伤害。

本发明第一方面公开了一种可携带药物的靶向载体，为连接有果糖的白蛋白。

较优的，所述药物为化疗药物。

较优的，所述靶向载体针对的靶细胞为肿瘤细胞。本发明的靶向载体携带药物并靶向作用于肿瘤细胞。

更优的，所述肿瘤细胞为实体肿瘤或转移性肿瘤。

较优的，所述果糖和白蛋白之间的摩尔比为10～100：1。

本发明其次公开了前述靶向载体，在制备肿瘤治疗药物中的应用。

较优的，所述肿瘤为实体肿瘤或转移性肿瘤。

本发明还公开了连接有果糖的白蛋白，作为化疗药物靶向载体的应用。

本发明所述化疗药物可以为现有的任意种类的抑制肿瘤细胞生长、增殖、分化、转移的药物，包括但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒。

本发明白蛋白与果糖的连接可采用常规的蛋白与单糖的连接方式，例如共价结合或非共价结合。较优的，白蛋白与果糖通过交联剂进行偶联。

更优的，所述交联剂为N-β-马来酰亚胺基丙酸酰肼-TFA（BMPH）。

由于肿瘤细胞高表达吸收果糖的葡萄糖转运蛋白-5，因此果糖可以被癌细胞大量摄取从而具有癌细胞导向性；但由于果糖分子量小，在血液循环中很容易被其他蛋白吸收或者进入到正常细胞内，因此将果糖与大分子白蛋白连接共同作为载体后，既可以保证靶向载体自身的稳定，又可以保持果糖的导向作用和白蛋白对肿瘤细胞的亲和力，将药物分子靶向的作用于癌细胞，增强药物分子的抑癌作用。

本发明第二方面公开了一种抗肿瘤药物，包括载有化疗药物的白蛋白，所述白蛋白上还连接有果糖。

较优的，所述果糖、化疗药物和白蛋白之间的摩尔比为10～100:5～50：1。

较优的，所述化疗药物选自紫杉醇（Paclitaxel）、氟尿嘧啶（Fluorouracil）、多柔比星（Doxorubicin），氨甲喋呤（Methotrexate）、顺铂（Cisplatin）、卡铂（Carboplatin）之任一种或多种的组合。

更优的，所述化疗药物为紫杉醇。

最优的，所述化疗药物为多烯紫杉醇。

较优的，所述抗肿瘤药物粒径为80～150nm。

更优的，所述抗肿瘤药物粒径为100～120nm。

当化疗药物为多烯紫杉醇时，本发明的抗肿瘤药物的组成为：多烯紫杉醇-果糖-白蛋白纳米微球（DFAN）。

最优的，所述果糖、多烯紫杉醇和白蛋白之间的摩尔比为10～100:5～50：1。

较优的，所述肿瘤为实体肿瘤或转移性肿瘤。

更优的，所述肿瘤为肝癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌或胶质瘤。

本发明还公开了前述抗肿瘤药物在单一用药化疗或联合化疗中的应用。

本发明的抗肿瘤药物在应用于联合化疗时，是将本发明的抗肿瘤药物与其他化疗药物、中药等，结合放射、外科手术等方法施用于癌症患者。

本发明第三方面公开了前述抗肿瘤药物的制备方法，步骤如下：

1）果糖-白蛋白结合物溶液的制备：将果糖与白蛋白按照10～100:1的摩尔比例混合均匀后，加入BMPH作为交联剂，4℃反应3～6小时获得果糖-白蛋白纳米微球混合溶液；温育后反应产物透析过夜，获得果糖-白蛋白结合物溶液；

2）将化疗药物与EDC溶解在DMSO中，30～50℃水浴，水浴保温结束后将溶液冷却到室温，获得药物溶液；

3）果糖-白蛋白-化疗药物微球溶液的制备：将步骤2）的药物溶液在恒定搅拌速度（400-800rpm）下以0.5-1.5ml/min的速率滴加到步骤1）的果糖-白蛋白结合物溶液中，控制加入的化疗药物与白蛋白的摩尔比为5～50：1，获得混合溶液；滴加结束后继续以恒定的速率搅拌混合溶液，并向混合溶液中加入EDC，持续搅拌4-8小时，透析，冷冻干燥，获得载有化疗药物的果糖-白蛋白结合物作为抗肿瘤药物。

较优的，步骤3）冷冻干燥的温度为零下40～80℃。

较优的，步骤3）冷冻干燥后，将冻干后的粉末于冻干温度下保持48～72h。

本发明制备的果糖-白蛋白-化疗药物微球通过电子显微镜确定纳米粒子的大小介于90～150nm之间。在生理条件（PBSpH7.4，37℃）下果糖-白蛋白-化疗药物微球在人类血清中稳定。

本发明第四方面公开了一种治疗肿瘤的方法，为将前述抗肿瘤药物施用于肿瘤细胞或者将前述抗肿瘤药物与其他抗肿瘤药物一起通过联合化疗的方法施用于肿瘤细胞。

所述其他抗肿瘤药物包括化疗药物、中药等。

本发明最后还公开了一种使化疗药物靶向作用于肿瘤细胞的方法，为以连接有果糖的白蛋白作为化疗药物的载体，将化疗药物靶向性的施用于肿瘤细胞。

较优的，所述白蛋白为人体血清白蛋白。

本发明制备的抗肿瘤药物包括化疗药物、作为药物载体的白蛋白，以及与白蛋白连接具有导向作用的果糖；其中，葡萄糖转运蛋白5过度表达导致癌细胞对果糖的摄取增加；实体肿瘤中白蛋白的摄取量大大增强，被称为大分子的渗透性和保持性增强；因此相比于正常细胞，化疗药物-果糖-白蛋白微球能特异性的被肿瘤细胞大量吸附，使本发明的抗肿瘤药物具有癌细胞靶向性，减少化疗对健康细胞的伤害。本发明使用多烯紫杉醇-果糖-白蛋白纳米粒子（DFAN）中存在的相同当量浓度的多烯紫杉醇在卵巢癌细胞株和肝癌细胞株中得到的体外结果显示，DFAN的抗癌作用在酸性环境中更明显，而多烯紫杉醇单独作用的抗癌作用较小。此外，本发明的纳米级抗肿瘤药物的粒径范围为80-150nm，而肿瘤微血管孔径（直径）在100到1200nm之间，因此本发明的纳米级抗肿瘤药物还能增加其对肿瘤血管的渗透。

本发明的有益效果在于，本发明的抗肿瘤药物由化疗药物-果糖-白蛋白三者结合而成，能够靶向作用于肿瘤细胞，减少了化疗药物对正常细胞的伤害；并且本发明的抗肿瘤药物的抗癌效果在酸性环境下更明显，相较于化疗药物的单独使用，本发明的药物更适宜于癌细胞pH更低的体液环境；更进一步的，纳米级的药物粒径使得本发明的抗肿瘤药物在肿瘤血管中的渗透性更好；可见，本发明的抗肿瘤药物具有更佳的癌细胞特异性、更强的细胞毒性，以及更优的使用安全性，在肿瘤治疗领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1：肝癌细胞株（HepG2）在暴露于游离多烯紫杉醇之后存活率的pH依赖性和浓度依赖性抑制。

图2：肝癌细胞株（HepG2）在暴露于DFAN之后存活率的pH依赖性和浓度依赖性抑制。

图3：卵巢癌细胞株（OV5）在暴露于游离多烯紫杉醇之后存活率的pH依赖性和浓度依赖性抑制。

图4：卵巢癌细胞（OV5）株在暴露于DFAN之后存活率的pH依赖性和浓度依赖性抑制。

图5：正常人外周血单个核细胞(PBMC)暴露于游离多烯紫杉醇和DFANMTS细胞增殖检测分析图

图6：DFAN的电镜图片

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件。

实施例1纳米级抗肿瘤药物的制备

1.实验材料

白蛋白（美国Sigma-Aldrich公司），果糖(美国Sigma-Aldrich公司)，多烯紫杉醇(美国Sigma-Aldrich），BMPH(N-β-马来酰亚胺基丙酸酰肼-TFA，购自美国ThermoScientificPierce公司）

2.实验方法

2.1果糖-白蛋白结合物溶液

采用pH7.4的PBS缓冲溶液制备果糖、白蛋白混合溶液2mL（含有果糖500mg，并且果糖：白蛋白摩尔比为=10:1），向制备好的果糖、白蛋白混合溶液中加入BMPH交联剂溶液，BMPH的反应浓度为10mM（3.0mg/mL），将混合物在4℃下温育5小时，温育后反应产物于透析袋中对pH7.4的PBS缓冲溶透析过夜，其间换两次缓冲溶，以除去过量的试剂，获得果糖-白蛋白结合物溶液。

2.2多烯紫杉醇-果糖-白蛋白纳米粒子（DFAN）

将多烯紫杉醇（121.19mg）与EDC（60mg）溶解在DMSO（6ml）中，50℃水浴保温15分钟，保温结束后将溶液冷却到室温，获得多烯紫杉醇溶液（0.15mmol/L）。将多烯紫杉醇溶液在恒定搅拌速度（600rpm）下以1ml/min的速率滴加到到果糖-白蛋白结合物溶液中（控加入的多烯紫杉醇与制白蛋白摩尔比为50:1），获得混合溶液。滴加结束后继续以恒定的速率搅拌混合溶液，并向混合溶液中加入5mgEDC，持续搅拌4小时使所形成的DFAN结合物交联，以产生DFAN纳米粒子。

对PBS进行渗析（纤维素膜，截止12000kDa）以去除未结合的多烯紫杉醇、EDC和DMSO。反应时间后，通过使用亚米康（Amicon）的Ultra-4离心过滤装置（美国密理博公司，MilliporeUSA）去除未反应的多烯紫杉醇、EDC。最后将DFAN在-60℃下冻干，保持48小时，通过电子显微镜确定多烯紫杉醇-果糖-白蛋白纳米粒子（DFAN）的粒径范围为90-150nm（实验结果见图6），并且DFAN在生理条件下（PBSpH7.4，37℃），以及在人类血清中稳定存在。

实施例2癌细胞增殖抑制实验

1.实验对象

肝癌细胞（HepG2）、卵巢癌细胞（OV5）

实施例1制备的多烯紫杉醇-果糖-白蛋白纳米粒子（DFAN）

2.实验方法

1）癌细胞的培养：在处理前将肝癌细胞（HepG2）或卵巢癌细胞（OV5）于含FBS（胎牛血清）的RPMI-1640培养基中以1×10⁵个细胞/100微升/孔的密度接种在96孔板中，培养24小时。

2）药物溶液的制备：

一、对照组：将多烯紫杉醇溶于不含小牛血清的RPMI1640培养液中，获得对照组药物溶液，通过调整RPMI1640培养液的酸碱度以及多烯紫杉醇的加入量，获得：pH值为5.0，多烯紫杉醇浓度分别为0μM,0.50μM、1.0μM、1.5μM的药液；pH值为6.0，多烯紫杉醇浓度分别为0μM,0.50μM、1.0μM、1.5μM的药液；pH值为7.0，多烯紫杉醇浓度分别为0μM,0.50μM、1.0μM、1.5μM的药液。

二、实验组：将实施例1制备的DFAN溶于不含小牛血清的RPMI1640培养液中，获得实验组药物溶液，通过调整DFAN的加入量，使实验组药物溶液中存在于DFAN中的多烯紫杉醇与对照组药物溶液单独使用的多烯紫杉醇具有相同的多烯紫杉醇当量浓度梯度，并通过调整RPMI1640培养液的酸碱度，获得：pH值为5.0，DFAN浓度分别为0μM（control）,0.52μM、1.04μM、1.56μM的药液；pH值为6.0，DFAN浓度分别为0μM（control）,0.52μM、1.04μM、1.56μM的药液；pH值为7.0，DFAN浓度分别为0μM（control）,0.52μM、1.04μM、1.56μM的药液（DFAN浓度分别为0.52μM、1.04μM、1.56μM的药液含有的有效多烯紫杉醇浓度分别为0.50μM、1.0μM、1.5μM）。

3）将不同浓度、不同pH值的实验组药物溶液施用于步骤1）培养的肝癌细胞（HepG2）或卵巢癌细胞（OV5）中，作为实验组；将不同浓度、不同pH值的对照组药物溶液施用于步骤1）培养的肝癌细胞（HepG2）或卵巢癌细胞（OV5）中，作为对照组。

将癌细胞在未外源添加物质、含多烯紫杉醇或含DFAN的RPMI-1640培养基中继续培养细胞48小时。培养结束后，使用CellTiter96AQueous非放射性细胞增殖分析法（普洛麦格公司（Promega）进行定量细胞存活检测。各孔用MTS处理1到4小时，此后使用96孔板读取器记录在490nm下的吸光度。所测量的甲臜（formazan）产物的量与活细胞数目成正比。所标绘的数据是平均值±SEM（每个数据点使用3次重复实验）。

使用相同当量浓度的存在于DFAN中的多烯紫杉醇以及单独使用的多烯紫杉醇在肝细胞株中得到的体外实验结果分别见图2和图1，使用相同当量浓度的存在于DFAN中的多烯紫杉醇以及单独使用的多烯紫杉醇在卵巢癌细胞株中得到的体外实验结果分别见图4和图3。

实验结果显示，DFAN以及单独使用的多烯紫杉醇对肝癌细胞及卵巢癌细胞的抑制均存在剂量效应；DFAN的抗癌作用在酸性环境中更明显，而多烯紫杉醇的抗癌作用减小。在酸性环境（pH5）中，DFAN实际上比游离多烯紫杉醇活性更强。

实施例3人外周血单个核细胞的细胞毒性作用实验

1.实验对象

人外周血单个核细胞（PBMC）

2.实验方法

2.1果糖-白蛋白结合物溶液

采用pH7.4的PBS缓冲溶液制备果糖、白蛋白混合溶液2mL（果糖：白蛋白摩尔比为=100:1），向制备好的果糖、白蛋白混合溶液中加入BMPH交联剂溶液，BMPH的反应浓度为10mM（3.0mg/mL），将混合物在4℃下温育5小时，温育后反应产物于透析袋中对pH7.4的PBS缓冲溶透析过夜，其间换两次缓冲溶，以除去过量的试剂，获得果糖-白蛋白结合物溶液。

2.2多烯紫杉醇-果糖-白蛋白纳米粒子（DFAN）

将多烯紫杉醇（121.19mg）与EDC（60mg）溶解在DMSO（6ml）中，50℃水浴保温15分钟，保温结束后将溶液冷却到室温，获得多烯紫杉醇溶液（0.15mmol/L）。将多烯紫杉醇溶液在恒定搅拌速度（600rpm）下以1ml/min的速率滴加到到果糖-白蛋白结合物溶液中（控制加入的多烯紫杉醇与白蛋白摩尔比为5:1），获得混合溶液。滴加结束后继续以恒定的速率搅拌混合溶液，并向混合溶液中加入5mgEDC，持续搅拌4小时使所形成的DFAN结合物交联，以产生DFAN纳米粒子。

对PBS进行渗析（纤维素膜，截止12000kDa）以去除未结合的多烯紫杉醇、EDC和DMSO。反应时间后，通过使用亚米康（Amicon）的Ultra-4离心过滤装置（美国密理博公司，MilliporeUSA）去除未反应的多烯紫杉醇、EDC。最后将DFAN在-60℃下冻干，保持48小时，通过电子显微镜确定多烯紫杉醇-果糖-白蛋白纳米粒子（DFAN）的粒径范围为90-120nm，并且DFAN在生理条件下（PBSpH7.4，37℃），以及在人类血清中稳定存在。

2.2细胞实验

1）细胞的培养：在处理前将人外周血单个核细胞（PBMC）于含FBS（胎牛血清）的RPMI-1640培养基中以1×10⁵个细胞/100微升/孔的密度接种在96孔板中，培养24小时。

2）药物溶液的制备：

一、对照组：将多烯紫杉醇溶于不含小牛血清的RPMI1640培养液中，获得对照组药物溶液，通过调整RPMI1640培养液的酸碱度以及多烯紫杉醇的加入量，获得pH值为5.0，多烯紫杉醇浓度为1.5μM的药液。

二、实验组：将本实施例制备的DFAN溶于不含小牛血清的RPMI1640培养液中，获得实验组药物溶液，通过调整DFAN粉末的加入量，使实验组药物溶液中存在于DFAN中的多烯紫杉醇与对照组药物溶液单独使用的多烯紫杉醇具有相同的多烯紫杉醇当量浓度梯度，并通过调整RPMI1640培养液的酸碱度，获得pH值为5.0，DFAN浓度为1.56μM的药液（DFAN浓度为1.56μM的药液含有的有效多烯紫杉醇浓度为1.5μM）。

将实验组药物溶液、对照组药物溶液施用于步骤1）培养的人外周血单个核细胞（PBMC）中，分别获得实验组和对照组。

三、空白对照组：将不含任何化疗药物、pH值为5.0的RPMI-1640培养液施用于步骤1）培养的细胞中，作为空白对照组。

3）将人外周血单个核细胞癌细胞在未外源添加物质、含多烯紫杉醇或含DFAN的RPMI-1640培养基中继续培养细胞48小时。培养结束后，使用CellTiter96AQueous非放射性细胞增殖分析法（普洛麦格公司（Promega）进行定量细胞存活检测。各孔用MTS处理1到4小时，此后使用96孔板读取器记录在490nm下的吸光度。所测量的甲臜（formazan）产物的量与活细胞数目成正比。所标绘的数据是平均值±SEM（每个数据点使用3次重复实验）。

实验结果见图5，由图5可知，DFAN对正常人外周血单个核细胞（PBMC）的细胞毒性作用比游离多烯紫杉醇低得多，可见本发明的以白蛋白、果糖为载体的化疗药物能够靶向作用于癌细胞，减少对正常体细胞的损伤。

Claims

1.一种抗肿瘤药物，包括载有化疗药物的白蛋白，其特征在于，所述白蛋白上还连接有果糖；白蛋白与果糖之间通过交联剂BMPH连接；所述果糖、化疗药物和白蛋白之间的摩尔比为10～100:5～50：1；所述化疗药物选自多烯紫杉醇、氟尿嘧啶、多柔比星，氨甲喋呤、顺铂、卡铂中任一种或多种的组合。

2.如权利要求1所述的抗肿瘤药物，其特征在于，所述抗肿瘤药物粒径为80～150nm。

3.如权利要求1所述的抗肿瘤药物，其特征在于，所述肿瘤为实体肿瘤或转移性肿瘤。

4.如权利要求1所述的抗肿瘤药物，其特征在于，所述肿瘤为肝癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌或胶质瘤。