CN103642718A

CN103642718A - 一种烟沫固体有机废弃物腐熟菌剂及其制备方法

Info

Publication number: CN103642718A
Application number: CN201310594153.9A
Authority: CN
Inventors: 李想; 刘艳霞; 石俊雄
Original assignee: Guizhou Institute of Tobacco Science
Current assignee: Guizhou Institute of Tobacco Science
Priority date: 2013-11-22
Filing date: 2013-11-22
Publication date: 2014-03-19
Anticipated expiration: 2033-11-22
Also published as: CN103642718B

Abstract

本发明公开了一株具有耐烟碱能力的菌株N1,菌株N1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC8143，保藏日期为2013年9月9日；及其在降解烟沫固体有机废弃物上的应用。一株具有耐烟碱能力的菌株N2，菌株N2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC8144，保藏日期为2013年9月9日；及其在降解烟沫固体有机废弃物上的应用。进一步公开了一种烟沫固体有机废弃物腐熟菌剂，包含菌株N1和菌株N2。并公开了一种烟沫固体有机废弃物腐熟菌剂的制备方法，步骤为：发酵菌株N1和N2将菌株N1和菌株N2发酵液复合得到所述腐熟菌剂。

Description

一种烟沫固体有机废弃物腐熟菌剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及微生物领域，尤其涉及一种烟沫固体有机废弃物腐熟菌剂。

背景技术

我国烟草的种植面积和产量均居世界首位，目前国内外烟草主要用作卷烟。作为烟草生产大国，我国烟草种植面积约130万hm²，年产量450～500万t。在卷烟加工生产中会产生大量的烟叶、烟沫等下脚料废弃物，我国烟草废弃物的年总量约在90～100万t，约占总产量的25%，其中大部分被废弃，不仅造成了资源的浪费，而且严重污染环境。

烟沫废弃物指的是除去具有烘烤价值叶片以外的烟草茎株部分，包括烟茎、烟根、土脚叶、“优化结构”政策优化掉的叶片、烟花、烟种、腋芽。烟草体内己经检测出的化学物超过1000多类，主要包括各种烃、芳香烃、醛、酮、甾醇、醇、醌、酯、生物碱、色素、类异戊二烯衍生物、氨基酸和蛋白类等十几大类物质。进一步细分，鉴定出包括植物碱、有机酸、蛋白质、淀粉、甘油三脂、糖类、单宁、果胶、纤维素等3000多种化合物，其中多数化合物是光合作用的产物，具有很高的使用价值。

对废弃烟叶的综合利用，一直受到国内外研究者的重视。有很多的研究报道：如从废弃烟叶中提取烟碱，生产烟碱农药；提取茄尼醇用于生产辅酶Q10等药物；从未成熟的鲜烟叶中提取泪水大豆蛋白质的烟草蛋白质，作为优质饲料的添加剂等,但尚有大量的烟草废弃物未得到很好的利用。由于烟草废弃物中有很强的植物毒性的烟碱存在，虽然含有丰富的有机质，不能作为有机肥直接施于土壤，单独堆肥腐熟耗时较长，烟碱降解效果差，且不仅会造成环境污染和浪费资源，还可能导致滋生病虫害的传播。目前国内常通过添加大量的植物秸秆和烟草废弃物堆放一块，以稀释降解不彻底的烟碱对农作物带来的负面影响，可使烟草废弃物成为很好的有机肥源。

高附加值的农业废弃物的肥料化利用，特别是高附加值的生物有机肥及有机无机复合肥的开发制，不但能解决环境污染问题，而且可以为农业生产提供大量的有机肥料，是减少农业面源污染、节约资源发展可持续农业和循环经济的重要途径。在农业废弃物高附加值肥料化利用过程中，加快升温速度缩短堆腐时间是有机肥生产经济效益的关键，而接种菌剂是加快堆肥升温、促进发酵腐熟过程的措施。本发明主要是筛选出能够使烟沫废弃物高效腐熟的微生物菌种，使烟沫废弃物能够资源化利用，不仅能够解决烤烟区的环境问题，而且能为烟农带来更多的收入。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种烟沫固体有机废弃物腐熟菌剂，来有效降解烟沫固体有机废弃物。

为实现上述目的，本发明提供了一株具有耐烟碱能力的菌株N1，菌株N1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC8143，保藏日期为2013年9月9日。

进一步地，本发明提供了另一株具有耐烟碱能力的菌株N2，菌株N2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC8144，保藏日期为2013年9月9日。

保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，邮编：100101，电话：86-10-64807355。

进一步地，本发明提供了菌株N1在降解烟沫固体有机废弃物上的应用。

进一步地，本发明提供了菌株N2在降解烟沫固体有机废弃物上的应用。

进一步地，本发明提供了一种烟沫固体有机废弃物腐熟菌剂，包含菌株N1和菌株N2，其中，N1为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），N2为母牛分枝杆菌（Mycobacterium vaccae）。

优选地，所述菌剂中菌株N1与菌株N2的菌体数量比为1:3-3:1

进一步地，本发明提供了一种烟沫固体有机废弃物腐熟菌剂的制备方法，包括如下步骤：

1）、发酵菌株N1

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，pH7.0，170rpm，30℃摇床培养24h；

2）、发酵菌株N2

3）、菌株复配

将菌株N1和菌株N2发酵液复合得到所述腐熟菌剂。

优选地，步骤3）中，菌株N1和菌株N2发酵液体积比为1:3。

菌株N1和菌株N2具有显著的降解纤维素的能力，且具有良好的烟碱耐性。

附图说明

图1是N1+N2菌株对烟碱的降解情况

具体实施方式

实施例1菌株筛选

纤维素降解菌筛选培养基：CMC-Na5g，KH₂PO₄1g，尿素0.5g，（NH₄）₂SO₄0.5g，MgSO₄·7H₂O0.5g，FeSO₄·7H₂O7.5mg，MnSO₄·H₂O2.5mg，ZnSO₄·7H₂O3.6mg，CoCl₂·6H₂O3.7mg，CaCl₂0.5g，0.02%刚果红，16g琼脂，去离子水定容至1L。

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，固体加琼脂16g，用于细菌的分离、培养。

PDA培养基：马铃薯（去皮）200g，蔗糖（或葡萄糖）20g，固体加琼脂16g，用于真菌的分离、培养。

刚果红琼脂培养基是较好的分离筛选培养基，纤维素降解菌能够在红色平板上形成透明圈，且透明圈/菌落直径比值大小大致反映其降解纤维素能力的高低。筛选得到的两株具有降解纤维素能力的菌株命名为N1和N2。从表1可以看出，将菌株按降解纤维素能力为N2>N1。

表1菌株降解纤维素能力

实施例2菌株鉴定

用形态观察、染色、生理生化反应、16srRNA基因序列分析等方法对N1和N2菌株进行鉴定。

N1菌株为革兰氏阳性，直短杆状，周生鞭毛，能运动，大小为0.7μm～0.8μm×2.0μm～3.0μm。在营养琼脂固体培养基平板上培养24h后，菌落形态为圆形或近圆形，表面粗糙不透明，污白色或微黄色，常形成皱醭，菌落大小为2mm～3mm。经16srRNA基因序列分析和同源性比较，得知其与GenBank中HG328254.1菌株有99%的同源性，故鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），命名为解淀粉芽孢杆菌N1。该菌种已经保藏于国家微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC8143，保藏日期为2013年9月9日。保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，邮编：100101，电话：86-10-64807355。

N2菌株为革兰氏阳性，短粗杆状，大小为0.6μm～1.0μm×1.0μm～4.0μm，略变异，两端圆，偶尔粗大，分枝稀少，偶尔可见Y形细胞。在营养琼脂固体培养基平板上培养24h后，菌落形态为圆顶形，表面光滑、潮湿、有光泽、奶油状，边缘整齐，深黄色至橙色，菌落大小为2mm～3mm。经16srRNA基因序列分析和同源性比较，得知其与GenBank中BD218170.1菌株有99%的同源性，故鉴定为母牛分枝杆菌（Mycobacterium vaccae），命名为母牛分枝杆菌N2。该菌种已经保藏于国家微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC8144，保藏日期为2013年9月9日。保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，邮编：100101，电话：86-10-64807355。

实施例3耐烟碱测试

1菌种的耐烟碱程度检验

根据废弃烟沫中的烟碱含量，设置烟碱浓度为0%，0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%，每个梯度设置三个重复，将不同浓度梯度烟碱加入装有30mL牛肉膏蛋白胨培养基的100mL三角瓶中。将待测菌种的种子液以1%的接种量接入培养基中，30℃、170r/min，培养24h后用紫外分光光度计以波长600nm测量OD值。

将N1和N2菌株的种子液等量加入到配置好的烟碱浓度为0%，0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%的培养基中，30℃、170r/min震荡培养24h后，用分光光度计以波长600nm测量吸光度，用以测定的复配菌株对烟碱的耐性浓度。

表2复配菌株N1+N2与单菌株耐烟碱能力比较

从表2中可以看出，N1+N2的烟碱耐性在0.1%至0.5%之间要显著高于N1或者N2纯菌株的烟碱耐性（P<0.05），具有协同增效的作用，取得了意想不到的的效果。烟碱浓度低于0.2%时，N1菌株烟碱耐性明显高于N2菌株（P<0.05）；在烟碱浓度等于高于0.3%时，N2菌株耐烟碱能力显著高于N1（P<0.05）。

2烟碱的降解速率与N1+N2的生长速度的关系：

预先在普通培养基中培养的N1+N2菌株培养液按5%的接入量接种于含烟碱(500mg/L)的基础培养基中，在30℃，120r/min条件下摇床培养，定时取样测定菌体的生长情况和培养基中烟碱的浓度。图1表明，N1+N2菌株细胞的生长和对烟碱的降解是同步的。N1+N2菌株生长和对烟碱的降解都有短暂的延滞期，然后进入对数期，到20小时后基本上达到最大生长量，此时烟碱的降解率达95.2%。

3烟沫废弃物的固体发酵

在室温为30℃左右的条件下，将废弃烟丝进一步剪碎，装入长72cm，宽36cm，高18cm的塑料周转箱内，每周转箱装烟沫25kg并堆积发酵，重复3次，调节含水量为60%，发酵20d，期间每三天翻堆1次。对照处理为清水自然发酵，N1+N2处理为加入N1发酵液8mL+N2发酵液24mL。

表3复配菌株N1+N2对废弃烟沫固体发酵的影响

从表3中可以看出，废弃烟沫加入N1+N2菌种进行堆置发酵后，发酵腐熟度较对照有明显的改善，全碳、全氮以及碳氮比对照处理显著高于N1+N2处理，这主要是由于对照处理没有完全发酵，烟沫中的总氮、总碳较少转化为腐殖质，而pH显著低于N1+N2处理，成酸性，而N1+N2处理的pH接近于中性，便于施入土壤，N1+N2处理的烟沫有机肥电导率、脱氢酶活以及可溶性碳、氮均高于对照处理，表明N1+N2处理发酵后的有机肥是腐熟程度高、肥效好，具有市场开发前景。

腐熟的有机肥含有大量有机质和烟草生长发育所必须的多种营养元素，增加土壤中腐殖质含量，改善土壤理化性质，增强地力，涵养水分，对促进烟株健壮生长、提高烟叶产质量都有积极作用。采用N1与N2复配构建烟沫专用腐熟菌剂，对解决当前有效利用烤烟废弃秸秆、烟叶及肥力转化有一定的实际意义。

本实验筛选出的菌株N1和N2的纤维素降解能力较强。应用微生物处理烤烟废弃物作为一种安全无污染环保形式，可以缩短烤烟废弃物的发酵时间、减少废弃物中有害成分（包括烟碱等），将经过微生物处理的烤烟废弃物置于土壤中有利于土壤的壮苗补肥，随着生物技术的不断发展，微生物将具有更大的应用潜力。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims

1.一株具有耐烟碱能力的菌株N1,菌株N1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC8143，保藏日期为2013年9月9日。

2.如权利要求1所述的菌株N1，在降解烟沫固体有机废弃物上的应用。

3.一株具有耐烟碱能力的菌株N2，菌株N2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC8144，保藏日期为2013年9月9日。

4.如权利要求3所述的菌株N2，在降解烟沫固体有机废弃物上的应用。

5.一种烟沫固体有机废弃物腐熟菌剂，其特征在于，所述菌剂中包含所述菌株N1和所述菌株N2。

6.如权利要求5所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂中菌株N1与菌株N2的菌体数量比为1:3-3:1。

7.一种烟沫固体有机废弃物腐熟菌剂的制备方法，包括如下步骤：

1）、发酵菌株N1

2）、发酵菌株N2

3）、菌株复配

将菌株N1和菌株N2发酵液复合得到所述腐熟菌剂。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤3）中，菌株N1和菌株N2发酵液体积比为1：3-3:1。