CN103619413B - 调节皮肤黑素细胞中色素沉着过程的方法 - Google Patents

Abstract

本发明描述了调节黑素细胞中的黑素体成熟过程的方法。另外，描述了可逆地改变人表皮皮肤中的色素沉着过程的方法。所述方法以黑素体成熟和黑素体向角质形成细胞转移为目标，这是色素沉着中涉及的关键过程，因为其潜在用于可预测地和受控地调节人皮肤中的色素沉着。

Description

调节皮肤黑素细胞中色素沉着过程的方法

技术领域

本发明涉及调节可见的皮肤色素沉着(pigmentation)。本发明涉及IFN-γ在使阶段I和II的黑素体(melanosome)的成熟停止而导致色素减退(hypopigmentation)并在除去IFN-γ后恢复该过程中的作用。整个色素沉着过程由在早期阶段I和II中黑素体形成、黑素合成、黑素体成熟以及随后黑素体向角质形成细胞(keratinocyte)转移组成。通过控制IFN-γ的浓度，能够以可预测的方式调节黑素体成熟的过程。本发明涉及IFN-γ及其激动剂和拮抗剂调节人的色素沉着用于临床或药物化妆品(cosmaceutical)目的的用途。

背景技术

色素沉着是涉及来自人表皮的两种细胞黑素细胞和角质形成细胞的独特过程。黑素细胞通过一系列清楚界定的程序化协调步骤在细胞器黑素体中产生黑素聚合物，然后具有色素的黑素体转移到角质形成细胞中(Hu等，2007)。皮肤中观察到的色素是由于角质形成细胞中黑素体的存在。色素沉着的完整过程可以大致分成四个不同的生物过程：1)黑素体形成的开始，2)涉及数种蛋白质转运的黑素体成熟阶段I、II、III和IV，3)在黑素体成熟的阶段III和IV中的黑素生物合成，4)阶段III和IV黑素体向角质形成细胞转移。破坏这些步骤中的任何步骤都可以导致皮肤色素沉着水平的改变。细胞器的成熟是人体中细胞程序的非常重要的组成部分。在本发明中，我们表明，干扰素-γ(IFN-γ)直接调节黑素体成熟和从黑素细胞转移的过程，从而影响皮肤色素沉着的完整过程。色素减退和色素沉着过度(hyperpigmentation)是多种病理性病症的临床表现，并且还具有化妆品价值。色素沉着的诱导被认为是黑素细胞受调节的分化程序。过去的研究已经鉴别了数种参与该过程的基因。许多这些观察来源于小鼠基因，并且目前已知接近120个基因座参与调节色素沉着(Bennett和Lamoreux，2003)。在这些中，酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶相关蛋白-1(TYRP1／TRP-1)和多巴色素异构酶(dopachrome tautomerase，DCT／TYRP2)是催化黑素合成的酶。已知关键的转录因子MITF通过这三种核心酶协调黑素生成期间的事件。引起细胞开始和维持黑素合成的一些诱因也是众所周知的。促黑素因子(melanotropic factor)如HGF、SCF、ET由邻近的角质形成细胞和纤维母细胞分泌(Yamaguchi等，2007；Yamaguchi and Hearing，2009)。这些因子调节细胞增殖和黑素生成。基于从基因到动物模型研究的多条证据线，α-MSH信号传导似乎是核心。最近，逐渐为人所知的是，p53介导角质形成细胞分泌α-MSH，因此以旁分泌的方式控制色素沉着(Cui等，2007)。正向调节黑素生成的信号传导通路之间的相互联系很复杂并且刚刚开始被理解。深入研究的色素沉着过度病症是皮肤暴露于UV射线，其引起一系列短期和长期的作用，导致色素沉着增加(Choi等，2010)。该响应包括促黑素因子的分泌和在预期的黑素体转移中黑素细胞树突形成(melanocyte dendricity)的增加(Scott等，2006)。令人惊奇的是已知许多的途径和效应器增加色素沉着，但是已知关于主动逆转该过程的极少。

多条证据线表明，在生理和病理生理条件下，存在色素减少的黑素细胞。在发育上，黑素细胞开始于作为无色素的前体细胞的神经嵴(neural crest)。这些细胞迁移到皮肤并成为具有色素的黑素细胞。观察到了无黑素病灶形式的恶性黑素瘤的稀有现象，并且通常与预后不良相关。当在限定的条件下体外培养黑素细胞时，类似地检测到具有较少量黑素的细胞，并且这些细胞被称为成黑素细胞(melanoblast)。另外，已知皮肤中临时失去黑素的临床病症，例如炎症后的色素减退。在这些病症中积极抑制色素沉着的途径尚待研究。也不清楚黑素合成是否是调节色素沉着的唯一步骤，数个研究表明，可以在以下水平对色素沉着进行调节：1)黑素体成熟，2)黑素体在细胞中分散(Richardson等，2008)，3)黑素体从黑素细胞向角质形成细胞转移(Seiberg等，2000)，4)从细胞中降解／除去黑素。

从药物化妆品的角度来说，黑素含量的降低很重要。尽管如此，可以抑制或逆转着色状态的药剂是有限的。不清楚单独通过MITF关闭黑素生成是否足以逆转缺陷的着色状态。或者，可能存在不依赖MITF的积极抑制黑素生成程序的途径。使用合适的模型系统并利用由色素细胞的生物学可得的大量信息，目前能够重现细胞变化并使用整体方法理解这些变化。已知存在许多干扰色素沉着过程的化合物。在它们之中，主要的一类分子属于黑素生成抑制剂类别。这些化合物可逆地抑制TYR酶并导致黑素含量降低。分子(如曲酸(kojicacid))属于这一类。其他种类的化合物可以分类为自杀底物(suicide substrate)，抑制剂实际上是TYR的底物但是不进一步参与黑素合成，或者是不可逆的抑制剂。代表这一类抑制剂的分子(如氢醌及其衍生物)被广泛地使用，但是它们具有不期望的副作用，因为它们还干扰其他细胞过程。另一类化合物通过靶向TYR蛋白水平而起作用。这些化合物造成蛋白质错误折叠，从而降低其活性。已知许多其他的小分子抑制剂降低黑素生成，并且它们的一些功能已经被很好地表征。抑制黑素生成的一个主要的副作用是泄露导致细胞毒性的中间物，这可能触发自身免疫。因此，化妆品工业在努力寻找控制黑素合成的更生物学的方式。

已知的能够使产生黑素之细胞的色素沉着水平降低的途径非常少。在本发明中，我们公开了如何通过使用干扰素途径使细胞保持色素减退状态。微阵列表明许多参与色素沉着的基因(例如TYRP1、TYRP2／DCT、cappuccino(CNO)、HPS4、G蛋白偶联受体143(GPR143)、OCA2、SLC7A11和粘脂蛋白3(mucolipin3，MCOLN3))被IFN-γ下调，并诱导了IFN-γ的下游效应子，例如IFNGR1、IFNGR2、STAT-1、JAK1、JAK2、IRF-1、IRF-3、IRF-7、IRF-9、PSMB8和PSMB9。细胞生物学研究表明色素减退细胞具有较少的成熟黑素体。黑素体蛋白质的分析表明TYR和DCT／TYRP2水平降低。IFN-γ还改变成熟黑素体从黑素细胞向角质形成细胞的转移。因此，靶向IFN-γ中介物，药理上使用小分子抑制剂或者细胞因子本身将导致受控的色素沉着响应。该方法的主要优点是使用介导色素减退的现有生物途径而不改变MITF水平。IFN-γ的功能如变阻器一样校正皮肤色素沉着。因此系统将被调节以适应该改变。我们已经通过使黑素体成熟的过程停止使所有的下游功能受到影响而导致色素减退来证明了这一途径。因此，靶向这一途径将导致黑素体受协调而降低并以更自然的方式实现色素减退。

已知造成色素减退的其他途径包括TGF-β途径(Martinez-Esparza等，2001)。证明通过使用TGF-β，使培养的B16细胞有效地色素减退。这与细胞中成熟黑素体含量的减少相关。最近利用小鼠实验跟进了该研究(Nishimura等，2010)。但是，这些研究证实这种降低是由于关键的转录因子MITF水平降低并导致干细胞的维持。在掌跖(palmoplantor)皮肤中观察了位点特异的色素减退的机理，其中真皮来源的DKK1抑制WNT信号传导，改变MITF水平和黑素细胞生长(Yamaguchi等，2009)。另一方面，我们的研究表明IFN-γ改变色素沉着而不改变MITF水平，表明IFN-γ介导色素减退的机理与TGF-β和DKK1不同。因此使用干扰素途径将会以远远更加可预测和高效的方式实现对色素沉着的改变。

支持我们的主张的早期报告包括产生以下小鼠的转基因系，其中所述小鼠在表皮中过表达IFN-γ。除具有其他可辨别的表型之外，这些小鼠在毛发中明显地色素减退(Carroll等，1997)。作者在该研究中没有调查这一机理，并且因为小鼠不具有表皮色素沉着，所以在之前不知道这一途径在皮肤表皮黑素细胞中的作用。大部分关于IFN-γ之作用的早期研究在转化的黑素瘤细胞上进行，所述黑素瘤细胞已被证明具有与正常的人表皮黑素细胞不同的性质(Nihal等，2005)。提出IFN-γ在改变黑素瘤相关的抗原呈递中的作用为改变炎症应答和妨碍黑素瘤细胞的有效识别(Le Poole等，2002)。关于人恶性黑素瘤细胞的早期研究从统计学上表明在这些转化细胞中IFN-γ对黑素合成的减少没有显著影响(Garbe等，1990)。虽然黑素合成是参与色素沉着的一个过程，但是可见的皮肤颜色是涉及不同生物事件级联的复杂现象。我们的研究表明IFN-γ在通过使培养的人黑素细胞中的关键黑素细胞细胞器黑素体的成熟停止来调节色素沉着中的重要作用。在一个完全不同的系统中，IFN-γ是培养的人生长期毛囊中退化期样变化(catagen-like change)的强力诱导物(Ito等，2005)。最近，使用斑马鱼模型系统，toll样受体途径被认为导致黑素细胞的色素减退(Jin和Kang，2010)。虽然观察有限，但是确实突出了信号传导途径对色素沉着的调节。已知干扰素本身通过诱导转录因子家族的干扰素调节因子(IRF)来发挥其作用。在最近的研究中，发现在欧洲群体中IRF-4与色素沉着相关(Sturm，2009)。这些观察进一步巩固了我们的主张：干扰素途径组分的参与对降低皮肤色素沉着有作用。因此，我们提出专利：通过靶向属于IFNG、IFNGR1、IFNGR2、STAT-1、JAK1、JAK2、IRF-1、IRF-3、IRF-7、IRF-9、PSMB8和PSMB9的组分来实现对皮肤及衍生之黑素细胞的色素沉着进行改变的方法。在本发明中，我们开发了通过IFN-γ肽及其下游蛋白质或通过使用IFN-γ途径的多种激动剂或拮抗剂来实现受控之色素沉着的方法。

发明目的

本发明的主要目的是开发调节可见的皮肤色素沉着的可逆方法。

本发明的另一目的是开发调节黑素细胞中的黑素体成熟的可逆方法。

本发明的另一目的是开发调节黑素体向角质形成细胞之转移的方法。

本发明的另一目的是开发通过识别影响黑素体成熟之试剂的下游靶标来调节表皮皮肤黑素细胞中黑素体成熟的方法。

发明内容

因此，本发明涉及调节可见的皮肤色素沉着的可逆方法。证明以下内容的研究导致了本发明：肽IFN-γ能够抑制黑素体成熟以及从黑素细胞中的转移，从而降低色素沉着水平。作为重组肽供应的IFN-γ的较高水平降低了TYR、TYRP1和TYRP2／DCT以及数种其他黑素体蛋白(CNO、HPS4、GPR143、OCA2、SLC7A11和MCOLN3)的水平，从而改变了黑素体成熟的过程。在体外向正常黑素细胞应用IFN-γ，导致在这些细胞中黑素体成熟的显著降低和导致的色素减退。因此，本发明涉及改变导致色素沉着改变之黑素体成熟过程的方法。本方法可用于由于例如阳光暴露、炎症或伤疤或者由于具有先天性或获得性黑素细胞增殖之疾病的色素沉着过度的临床状况。在某些情况下，IFN-γ在表皮中产生，因此其可以表面地应用于表皮以及全身施用。具有升高或异常的皮肤色素沉着的问题常见且广泛。即使位于小面积的皮肤，尤其是当异常色素沉着涉及脸和/或手时，这样的改变也仍可能造成巨大的痛苦。本文中，我们公开了通过使用肽IFN-γ及其下游靶蛋白(如IFNGR1、IFNGR2、STAT-1、JAK1、JAK2、IRF-1、IRF-3、IRF-7、IRF-9、PSMB8和PSMB9等)来引起色素减退的方法。另外，我们公开了该因素足以重复抑制这些细胞中的色素沉着响应。显微评价表明，当用IFN-γ处理细胞时，存在未成熟的黑素体。因此，通过对参与色素沉着之关键靶标的协调作用，IFN-γ通过积极抑制黑素体成熟来诱导色素减退状态。

附图简述

图1说明

使用透射电子显微镜观察的用100U／ml IFN-γ处理原代正常人黑素细胞的电子显微图。(a)对照(未处理的)黑素细胞，(b)用100U／ml IFN-γ处理的。将黑素细胞固定、透化并使用HMB45抗体探测黑素体的黑素体基质(绿色)和黑素(红色)(c)对照(d)100U／mlIFN-γ处理的黑素细胞。(e)HMB45和(f)黑素染色的黑素细胞之荧光强度的归一化量化图。

图2说明

(a)用100U／ml IFN-γ处理原代人黑素细胞，接着对表示为热图(heat-map)的调节基因进行微阵列分析。一些显著下调的基因包括DCT、Mlan A和Trp1。明显地，许多参与免疫功能的基因被该处理上调。(b)在两种不同IFN-γ浓度(100U／ml和200U／ml)下调节基因的实时PCR分析。(c)来自对照、MSH(6nM)或IFN-γ(100U／ml)处理之黑素细胞的DCT、磷酸化的STAT-1、磷酸化的GSK-3β的western印迹分析。

发明详述

IFN-γ通过改变参与黑素体形成和成熟之关键蛋白(如TYR、TYRP1和DCT／TYRP2、CNO、HPS4、GPR143、OCA2、SLC7A11和MCOLN3)的水平来使黑素体的成熟停止，从而减少正常人黑素细胞中的色素沉着。IFN-γ对色素沉着蛋白水平的调节可用于获得色素减退状态。

皮肤色素沉着的另一决定因素是成熟(阶段III和IV)黑素体从黑素细胞向角质形成细胞的转移。我们使用黑素细胞-角质形成细胞共培养模型的体外研究表明，IFN-γ降低了该转移过程，改变了角质形成细胞中黑素体的数目，导致降低外观上的色素沉着。

如在随后的实施例5中详细描述的，这种IFN-γ介导色素减退的机理在皮肤的数种色素减退型病症中可以是明显的，所述色素减退型病症例如结核样型麻风(tuberculoidleprosy)，其中IFN-γ的表面浓度可以抑制病灶皮肤的黑素细胞中黑素体的成熟和转移。因此，靶向这一途径对于治疗色素减退病症将具有治疗重要性。或者，模拟该途径将通过靶向黑素细胞中黑素体的成熟和黑素体向角质形成细胞的转移来促进受控的皮肤色素沉着。

可以使用多种生理上可接受的载体、赋形剂或稀释剂来将IFN-γ配制成组合物。所述组合物可以是例如用于表面使用的霜剂(cream)、凝胶剂(gel)或洗剂，或者可以作为液体存在。所述组合物还可以以需要时通过皮下输注的剂量单位形式存在。

由于之前已经表明TGF-β抑制B16黑素瘤细胞和人原代黑素细胞中的黑素合成(Martinez-Esparza等，2001；Nishimura等；Nishimura等，2010)，因此，重要的是确定IFN-γ是否通过涉及TGF-β的机理起作用。报道TGF-β通过降低MITF转录因子的水平导致色素沉着降低。但是，IFN-γ及其下游效应子蛋白质实现色素减退而不改变MITF的水平。这些发现表明IFN-γ介导色素减退的过程与TGF-β引起的不同。

通过其对正常人黑素细胞中涉及的整个色素沉着过程的抑制作用，证明了IFN-γ色素减退功能的普遍性。IFN-γ在数种病症中在表皮中表面产生(Sarra等，2011)。其他人在之前已经证明，角质形成细胞衍生因子(其也是表面产生)影响黑素细胞行为，例如黑素细胞增殖、树突形成和黑素产生量(Gordon等，1989)。因此一并考虑，本文提供的数据表明IFN-γ的表面施用可用于可预测地改变人表皮细胞中的色素沉着。

本公开内容提供了IFN-γ如何可用于可逆地调节表皮黑素细胞中阶段I和II发生的黑素体成熟的细节。通过本公开内容明显的是，IFN-γ的衍生物、模拟物或拮抗剂也可用于可逆地调节表皮黑素细胞中阶段I和II发生的黑素体成熟。因此，本说明书不使本发明的范围局限于IFN-γ，而是旨在将范围延伸至IFN-γ的衍生物、模拟物和拮抗剂。

因此，本发明涉及通过以受控方式使IFN-γ及其衍生物、其模拟物、拮抗剂与黑素细胞接触或撤回IFN-γ及其衍生物、其模拟物、拮抗剂来可逆地改变对象表皮黑素细胞中阶段I和II发生之黑素体成熟的方法，并且其中IFN-γ及其衍生物、模拟物、拮抗剂调节IFN-γ途径组分的表达，所述IFN-γ途径组分选自包含IFNGR1、JAK1和STAT1的组。

在本发明的另一个方面，IFN-γ或其衍生物、或其模拟物、或拮抗剂、或IFN-γ途径的组分以100-500U／ml的范围与黑素细胞接触1至10天。

在本发明的另一个方面，IFN-γ或其衍生物、或者IFN-γ的模拟物或拮抗剂可逆地改变TYR和TYRP2／DCT、CNO、HPS4、GPR143、OCA2、SLC7A11和MCOLN3的水平。

在本发明的另一个方面，通过靶向IFN-γ途径组分来改变黑素体向角质形成细胞的转移，所述IFN-γ途径组分选自包含IFNG、IFNGR1、JAK1和STAT1的组。

在本发明的另一个方面，IFN-γ及其组分、其激动剂和拮抗剂调节人的色素沉着用于临床或药物化妆品目的的用途。

在本发明的另一个方面，通过向对象施用IFN-γ或其衍生物或者IFN-γ的模拟物或拮抗剂来治疗皮肤色素沉着的方法。

在本发明的另一个方面，通过表面递送(topical delivery)或皮下递送向对象施用IFN-γ或其衍生物或者IFN-γ的模拟物或拮抗剂。

在本发明的另一个方面，以选自包含以下之组的剂型进行表面递送或皮下递送：散剂(powder)、溶液剂(solution)、乳剂(emulsion)、流体乳剂(fluid emulsion)、混悬剂(suspension)、流体混悬剂(fluid suspension)、半固体剂(semi-solid)、软膏剂(ointment)、糊剂(paste)、霜剂(cream)、凝胶剂、胶冻剂(jelly)、泡沫剂(foam)、植入剂(implant)、注射剂(injection)、贴剂(patch)和喷雾剂(spray)。

在本发明的另一个方面，可用于治疗选自包含以下之组的皮肤疾病：色素沉着过度(hyperpigmentation)、色素减退、色素沉着不均(uneven pigmentation)、炎症后色素沉着、皮肤晒伤(sun-damaged skin)、色素胎记(pigmented birthmark)、黑棘皮症(acanthosis nigricans)和日光斑(solar lentiges)、年龄相关的色素沉着变化、未定型麻风(indeterminate leprosy)、结核样型麻风、界线型麻风(borderline leprosy)、结节型麻风(leprematous leprosy)。

在本发明的另一个方面，提供了IFN-γ及其衍生物、模拟物、其拮抗剂，其用于可逆地改变对象表皮黑素细胞阶段I和II发生的黑素体成熟，其中所述IFN-γ及其衍生物、模拟物、拮抗剂调节IFN-γ途径组分的表达，所述IFN-γ途径组分选自包含IFNGR1、JAK1和STAT1的组。

在本发明的另一个方面，提供了IFN-γ及其衍生物、模拟物、其拮抗剂，其用于可逆地改变对象表皮黑素细胞阶段I和II发生的黑素体成熟，其中IFN-γ、或其衍生物、或其模拟物、或拮抗剂、或IFN-γ途径的组分以100-500U／ml的范围与黑素细胞接触1至10天。

在本发明的另一个方面，提供了IFN-γ及其衍生物、模拟物、其拮抗剂，其用于可逆地改变对象表皮黑素细胞阶段I和II发生的黑素体成熟，其中IFN-γ或其衍生物、或者IFN-γ的模拟物或拮抗剂可逆地改变TYR和TYRP2／DCT、CNO、HPS4、GPR143、OCA2、SLC7A11和MCOLN3的水平。

在本发明的另一个方面，提供了IFN-γ及其衍生物、模拟物、其拮抗剂，其用于可逆地改变对象表皮黑素细胞阶段I和II发生的黑素体成熟，其中通过靶向IFN-γ途径组分来改变黑素体向角质形成细胞的转移，所述IFN-γ途径组分选自包含IFNG、IFNGR1、JAK1和STAT1的组。

在本发明的另一个方面，提供了IFN-γ及其衍生物、模拟物、其拮抗剂，其用于通过向对象施用IFN-γ或其衍生物、或者IFN-γ的模拟物或拮抗剂来治疗皮肤色素沉着。

在本发明的另一个方面，提供了根据权利要求14所述应用的IFN-γ及其衍生物、模拟物、其拮抗剂，其中通过表面递送或皮下递送向所述对象施用IFN-γ或其衍生物或者IFN-γ的模拟物或拮抗剂。

在本发明的另一个方面，提供了根据权利要求15所述应用的IFN-γ及其衍生物、模拟物、其拮抗剂，其中以选自包含以下之组的剂型进行所述表面递送或皮下递送：散剂、溶液剂、乳剂、流体乳剂、混悬剂、流体混悬剂、半固体剂、软膏剂、糊剂、霜剂、凝胶剂、胶冻剂、泡沫剂、植入剂、注射剂、贴剂和喷雾剂。

在本发明的另一个方面，提供了根据权利要求14所述应用的IFN-γ及其衍生物、模拟物、其拮抗剂，其用于治疗选自包含以下之组的皮肤疾病：色素沉着过度、色素减退、色素沉着不均、炎症后色素沉着、皮肤晒伤、色素胎记、黑棘皮症和日光斑、年龄相关的色素沉着变化、未定型麻风、结核样型麻风、界线型麻风、结节型麻风。

通过举例说明本发明给出了以下实施例，并且因此不应当解释为限制本发明的范围。

实施例1

在37℃、5％CO₂下，将正常人表皮黑素细胞(normal human epidermalmelanocyte，NHEM)(由Lonza生产，或者由表皮建立)的培养物保存在含无PMA增补物的M254培养基(Invitrogen)中。为了研究IFN-γ对黑素细胞的作用，在存在或不存在100U／ml剂量的重组人IFN-γ(Peprotech)下培养黑素细胞的早期培养物，并且在处理后观察细胞8天。在用IFN-γ处理的细胞沉淀中可以观察到色素沉着减少，证明存在诱导色素减退的机理(图1)。为了理解黑素细胞中人IFN-γ(以下简称IFN-γ)的分子靶标和细胞色素减退的机理，进行进一步的研究。

细胞中黑素体成熟的状态与可见的色素沉着紧密联系。在黑素体成熟的后期阶段黑素合成的过程消失，并且需要合适的多蛋白靶标以启动黑素体的早期阶段。因此，黑素体对于合成黑素的接受性状态和每一黑素体中黑素的含量可以认为是色素沉着程序的细胞终点。由于黑素是高电子密度物质，经典地使用电子显微镜使黑素体可视化。该技术允许基于细胞器结构和黑素含量来鉴别黑素体I至IV的不同阶段。使用HMB45和黑素抗体对IFN-γ处理细胞(如上所述)进行电子显微镜观察和共聚焦成像。关于对照和IFN-γ处理细胞进行电子显微镜评估。显微照片的分析表明在IFN-γ处理细胞中较少检测到阶段III和IV的黑素体，而在对照细胞中能够明显地识别出数个。对于黑素体状态的更精细的和定量的分析，采用免疫细胞化学方法。将对照和IFN-γ处理的原代黑素细胞用获自(Dako Cytomation)的Human melanoma Black45(HMB45)和抗黑素抗体(针对合成黑素培养的兔多克隆，在实验室中培养)染色。细胞核用DAPI(4′,6-二脒基-2-苯基吲哚)(Invitrogen)对比染色，在共聚焦显微镜下观察细胞。反复观察表明，从IFN-γ处理的细胞中观察到较少荧光信号。为了定量比较，将对照和IFN-γ处理细胞在相同的条件下进行处理和成像。用于成像的设置(如背景校正、信噪比等)是任意的并保持恒定。从来自每一细胞的HMB45或黑素信号中减去DAPI平均荧光强度以归一化。如通过HMB45抗体检测的，归一化强度的比较表明IFN-γ处理的细胞具有显著较少的黑素和黑素体基质。

实施例2

为了理解IFN-γ在黑素细胞上诱导的分子变化，对两个独立的原代黑素细胞培养物进行基于微阵列的研究。将细胞用100U／mlIFN-γ处理8天(如实施例1所述)，分离全部RNA并进行微阵列。使用Illumina全基因组芯片Human WG-6进行微阵列。使用Illuminatotal prep RNA标记试剂盒(Ambion)进行RNA标记。随后按照制造商的说明进行杂交和清洗步骤。将数据平均归一化，减去背景并使用Bead-studio软件(Illumina)进行分析。典型的免疫细胞因子IFN-γ引起提示黑素细胞中免疫应答的基因表达谱。但是，基因表达的图案还包括抑制某些色素沉着基因(图2)。这确认IFN-γ的色素减退作用是由于通过影响黑素体成熟来抑制色素沉着基因。通过实时PCR来确认所选基因的调节。在原代人黑素细胞中观察到了多个IFN-γ下游基因的调节并且在表1中列出。

表1.基于微阵列在原代人黑素细胞中被IFN-γ调节在原代黑素细胞中被显著调节之基因的列表

DCT，TSPAN10，TSPAN9，SERPINF1，KIF1B，SOX10，MYO18A，MLANA，CREB1，MC1R，DCTNI，CNO，TYRP1，HPS4，GPR143，ID2，JARID2，OCA2CHMP2A，JARID1B，SLC7A11，MCOLN3，IFT2，IFTM1，IRF1，IRF3，IRF4，IRF7，IRF9，OAS1，PSMB8，PSMB9，STAT1，STAT6，TNFRSF19，TNFSF12，IFNGR1，IFNGR2，MAPKAP1，LOC402221，PDK4，C19ORF28，FARSA，TSPAN4，TYSND1，DEAF1，PKN1，WHSC1L1，ACP1，RASSF1，FAM76B，XL，PGAM4，WDR26，PIK3CD，FEN1，HS.31532，NR1H2，DNAJB12，FEZ1，PWWP2B，TNFAIP1，SH3BGRL3，TCIRG1，PCMTD2，LOC643357，MYO1B，HS.374257，LOC648249，BIN1，HS.12876，PRMT1，JAK1，JAK2，HS.231861，BRD8，LOC347544，BANF1，GYPC，AGXT2L2，MORF4L1，MRRF，ACTB，OAS3，H1FX，UBE2G1，FAM10A4，C22ORF29，HLA，DRB4，TMEM69，C8ORF33，RCE1，HLAH，ARL6IP6，LOC402251，CYBA，HLAB，AHSA1，ERP29，ADAT3，PPT2，SCAND1，TNC，RPL32，IFIT3，GRN，CTTN，LOC648210，ARPC4，TBCC，CTH，HLAF，RIPK5，TAP2，GMPR，APRT，ACLY，TMED10，TUBA1A，AGPAT1，LOC407835，KIAA0460，PDIA6，PHF20L1，MRPL12，VAMP5，UBB，ARMCX1，BEX4，LOC441775，FAM152B，NAT5，OBFC2B，RAB4A，LOC440589，PHF5A，LRP11，TNPO1，STEAP1，LOC649150，CXORF40B，PTTG1IP，LOC284821，HP1BP3，CAPNS1，RNH1，HCG4，HS.406790，EEF1A1，HLA.DPA1，POLRMT，LOC388654，CPEB2，IFI27，GAA，ARFGEF1，RAB7L1

实施例3

为了验证介导IFN-γ之色素减退效果的途径并阐明途径的组分，我们采用基于siRNA的蛋白质功能测试。如上所述(实施例1中)将原代人黑素细胞培养在无血清培养基中，使用基于脂质的转染试剂(获自Invitrogen的Cellfectin II)用靶向目标组分mRNA的100nM siRNA(获自Dharmacon的4种靶向siRNA的混合物)进行转染。转染之后，将细胞用胰蛋白酶处理并平板接种在孔中，用IFN-γ处理或者放置不经处理而作为对照。处理48小时之后，使细胞溶解并由细胞制备全部RNA，通过实时PCR来测量靶向基因转录物和DCT的水平。靶向JAK-1、STAT-1和IFNGR-1的SiRNA大幅降低了同源基因的mRNA水平，并同时消除了IFN-γ介导的DCT转录的抑制。这一系列实验进一步证实，所述途径的组分是用于实现改变色素沉着的潜在极好靶标。

实施例4

已知IFN-γ以物种特异的方式起作用。为了验证在黑素细胞中观察到的色素减退是否是由IFN-γ特异性引起的，将黑素细胞用小鼠IFN-γ(100U／ml)和人IFN-γ(100U／ml)处理8天。小鼠IFN-γ没有使人黑素细胞色素减退，证实效果是特异的并且不是肽添加的一般效果。当人IFN-γ处理的色素减退型黑素细胞在无IFN-γ的情况下仅在M254中培养时，发现细胞在5天后恢复了其色素沉着水平，表明了IFN-γ介导的黑素细胞中的色素减退的可逆性。这支持了IFN-γ是介导生理可逆的色素沉着变化的重要组分。

实施例5

为了探寻在皮肤色素减退症状中IFN-γ之作用的原因，从患有结节型麻风之对象的色素减退病灶表皮和非病灶表皮分离RNA。合成cDNA并进行实时PCR分析以比较色素沉着(TYR、TYRP1、TYRP2、MITF)基因和已知不被IFN-γ上调的基因(PSMB8、PSMB9、HLA-DRB1、HLA-A、HLA-B、HLA-C、IFNGR1、IRF1)之间基因表达的变化。发现在麻风病对象的病灶皮肤中含DCT的色素沉着基因(除MITF外)的表达水平较低，与可见的色素减退相符合。还观察到了IFN-γ基因特征信号(signature)的相应提高。相对于病灶皮肤的非病灶皮肤的电镜分析也表明，与非病灶皮肤相比病灶皮肤中成熟(阶段III和IV)黑素体的数目减少。这些结果与我们对IFN-γ使黑素体停止在成熟的早期阶段从而导致可见的色素减退的体外观察一致。该研究证明，在患病状态该途径对于导致人皮肤色素沉着的可见变化可能是可行的。

实施例6

为了理解IFN-γ对于黑素体从黑素细胞向角质形成细胞转移的作用，以1：2的比率建立了黑素细胞和正常人表皮角质形成细胞(获自Lonza或由包皮来源的表皮建立)的共培养物。将培养物在1：2M254和KSFM(Invitrogen)中并且分别在存在或不存在IFN-γ(100U／ml)下维持8天。在8天结束时，通过差别胰酶消化(differential trypsinization)方法使角质形成细胞和黑素细胞分离，并进行电镜分析。获得具有黑素体之角质形成细胞的多个显微照片，并分析每张显微照片中黑素体的数目。通过图像分析软件计算角质形成细胞的细胞质面积。观察到在IFN-γ存在下培养的角质形成细胞中黑素体数目／角质形成细胞面积减小，表明IFN-γ除了影响黑素体成熟外，还抑制黑素体向角质形成细胞转移的过程。

表2.涉及本申请权利要求的现有技术

本发明的优点

1)本发明因其实现对皮肤色素减退控制的能力而应用潜力巨大，这是因为其靶向黑素体成熟的整个过程。

2)基于小分子抑制剂或抗体而对该途径的中和可用于治疗色素沉着疾病，例如黄褐斑(melasma)、炎症后色素沉着过度、晒伤、UV诱导的色素沉着过度、痣、黑棘皮症等。

3)该途径的非临床的化妆品应用也可用于调节个体的肤色。

4)由于干扰素功能不影响MITF色素沉着的水平，所以该策略可用于通过MITF使色素沉着增加的病症。

5)可以将IFN-γ或其衍生物配制成组合物，例如在霜剂、凝胶剂或洗剂中用于表面使用或可作为液体存在。所述组合物必要时还可以以可通过皮下输注施用的剂量单位形式存在。

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Claims (13)

1.可逆地改变对象表皮黑素细胞中阶段I和II发生的黑素体成熟的非治疗方法，其通过以受控方式使IFN-γ及其拮抗剂与所述黑素细胞接触或撤回IFN-γ及其拮抗剂，

并且其中所述IFN-γ及其拮抗剂调节IFN-γ途径组分的表达，所述IFN-γ途径组分选自包含IFNGR1、JAK1和STAT1的组。

2.根据权利要求1所述的方法，其中IFN-γ、或拮抗剂以100至500U/ml的范围与黑素细胞接触1至10天。

3.根据权利要求1所述的方法，其中IFN-γ、或者IFN-γ的拮抗剂可逆地改变TYR和TYRP2/DCT、CNO、HPS4、GPR143、OCA2、SLC7A11和MCOLN3的水平。

4.根据权利要求1所述的方法，其中通过靶向IFN-γ途径组分来改变黑素体向角质形成细胞的转移，所述IFN-γ途径组分选自包含IFNG、IFNGR1、JAK1和STAT1的组。

5.IFN-γ及其组分、其激动剂和拮抗剂在制备用于调节人的色素沉着的药物中的用途，其中所述调节人的色素沉着是以用于临床或药物化妆品为目的的。

6.IFN-γ或者IFN-γ的拮抗剂在制备用于通过向对象施用IFN-γ或者IFN-γ的拮抗剂来治疗皮肤色素沉着的药物中的用途。

7.根据权利要求6所述的用途，其中将IFN-γ或者IFN-γ的拮抗剂配制成用于通过表面递送或皮下递送施用于所述对象。

8.根据权利要求7所述的用途，其中以选自包含以下之组的剂型进行所述表面递送或皮下递送：散剂、溶液剂、乳剂、流体乳剂、混悬剂、流体混悬剂、半固体剂、软膏剂、糊剂、霜剂、凝胶剂、胶冻剂、泡沫剂、植入剂、注射剂、贴剂和喷雾剂。

9.根据权利要求6所述的用途，其中所述药物可用于治疗选自包含以下之组的皮肤疾病：色素沉着过度、色素减退、色素沉着不均、炎症后色素沉着、皮肤晒伤、色素胎记、黑棘皮症和日光斑、年龄相关的色素沉着变化、未定型麻风、结核样型麻风、界线型麻风、结节型麻风。

10.IFN-γ及其拮抗剂在制备用于可逆地改变对象表皮黑素细胞中阶段I和II发生之黑素体成熟的药物中的用途，

其中所述IFN-γ及其拮抗剂调节IFN-γ途径组分的表达，所述IFN-γ途径组分选自包含IFNGR1、JAK1和STAT1的组。

11.根据权利要求10所述的用途，其中IFN-γ、或拮抗剂以100至500U/ml的范围与黑素细胞接触1至10天。

12.根据权利要求10所述的用途，其中IFN-γ、或者IFN-γ的拮抗剂可逆地改变TYR和TYRP2/DCT、CNO、HPS4、GPR143、OCA2、SLC7A11和MCOLN3的水平。

13.根据权利要求10所述的用途，其中通过靶向IFN-γ途径组分来改变黑素体向角质形成细胞的转移，所述IFN-γ途径组分选自包含IFNG、IFNGR1、JAK1和STAT1的组。