CN103616465A

CN103616465A - 血液相关脂肪酸谱的建立方法

Info

Publication number: CN103616465A
Application number: CN201310515767.3A
Authority: CN
Inventors: 李铎; 杨静; 黄涛
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2013-10-28
Filing date: 2013-10-28
Publication date: 2014-03-05

Abstract

本发明公开了一种血液相关脂肪酸谱的建立方法，包括以下步骤：1）选择研究对象，并将已脱离研究对象身体的血浆、血清或血小板中的总脂肪酸成分进行提取、分离、浓缩，从而得到总脂；2）、将总脂用薄层层析法分离磷脂、甘油三酯；3）、将分离得到的磷脂、甘油三酯进行甲酯化；4）、将甲酯化脂肪酸采用气相色谱分离法测定脂肪酸成分；5）、将脂肪酸进行图谱分析、SPSS数据统计分析；6）、将分析所得的数据进行整理、总结。本发明创立了一种简单有效且实用的脂肪酸谱的建立方法；建立了健康人与目前流行的慢性疾病的脂肪酸谱，对人类健康和脂肪摄入提供了强有力的指导作用。

Description

血液相关脂肪酸谱的建立方法

技术领域

本发明属于医学、流行病学领域，具体的说，涉及采用气相色谱建立一种测定血液相关（血浆，血清，血小板，红细胞等）的总酯、磷脂膜、或甘油三酯的脂肪酸谱，并对与脂代谢相关的慢性疾病（糖尿病、代谢综合症、高脂血症、非酒精性脂肪肝、高血压等）人群的脂肪酸谱进行了分析，从而建立相关的脂肪酸谱。即，本发明涉及健康人群和慢性病患者血液脂肪酸谱的建立方法。

背景技术

随着中国经济的快速发展，人们的日常饮食结构逐渐西方化，上个世纪中叶营养不良型疾病为主的形势已经转变到现在营养过剩型慢性疾病的盛行和快速增长，与膳食相关的疾病已经跃居为居民死亡的主要原因。膳食的要求也从满足温饱过渡到各种营养素合理摄入的健康饮食，通过合理的膳食指导来防治非传染性慢性疾病，显得越来越重要。饮食和生活方式在慢性病的病情演化中起到很重要的作用，营养调节可以改变慢性病的病情发展。

目前还没有中国人饮食中的脂肪酸类型的数据，因为人们在家中并不能准备所有的食物，而且食物中摄入的脂肪数量高度可变，所以还没有一个精确的方法去评价饮食中的各个脂肪酸摄入情况，因此这就需要采用生物标记物来提高评估的准确性。今年来，在长期的脂肪酸摄入量的模式中，组织脂肪酸（血清/血浆、动物脂肪、血小板和红细胞）被用来作为合适的生物标记物。

血浆或血清磷脂脂肪酸水平主要受到饮食因素的影响，尤其是n-3多不饱和脂肪酸（n-3polyunsaturated fatty acids,n-3PUFA）。研究表明，补充n-3PUFA能够增加组织磷脂多不饱和脂肪酸的含量，但是不同人群膳食脂肪酸摄入量不一样，而且膳食脂肪酸需要在体内进行一系列的生理反应才能进入细胞膜。

研究表明，增加n-3PUFA摄取量可阻止心率不齐的发生，降低血栓的发生概率，降低血清甘油三酯水平，舒缓动脉粥样硬化斑的生长，增强血管内皮细胞功能，降低血压，减少炎症的发生。

多不饱和脂肪酸（PUFA）在血多细胞生理功能中起着重要作用，例如PUFA是细胞膜的组成成分，同时也是许多重要的炎症调节因子，如花生四烯酸等的前体。PUFA能够影响细胞膜的流动性和和胆固醇含量以及影响细胞信号分子的生成，大量的研究表明多不饱和脂肪酸与众多复杂的疾病有关。磷脂多不饱和脂肪酸组成与心血管疾病、代谢综合症、2型糖尿病、血型同型半胱氨酸等相关。

因此，建立一种简单易行且有效的脂肪酸谱的方法势在必行，而且通过建立慢性病相关的脂肪酸谱，对膳食脂肪的摄入进行指导，从而减少相关慢性病的发生，为人们的健康生活多一层保障是有着重大意义的。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种血液相关脂肪酸谱的建立方法。本发明的方法简单易行，有效可信；采用本发明的方法建立中国慢性病人群的血液相关脂肪酸谱，以便对人们的膳食脂肪摄入进行指导，从而减少慢性病的发生。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种血液相关脂肪酸谱的建立方法，包括以下步骤：

1）选择研究对象，并将已脱离研究对象身体的血浆、血清或血小板中的总脂肪酸成分进行提取、分离、浓缩，从而得到总脂；

2）、将总脂用薄层层析法分离磷脂、甘油三酯；

3）、将分离得到的磷脂、甘油三酯进行甲酯化；

4）、将甲酯化脂肪酸采用气相色谱分离法测定脂肪酸成分；

5）、将脂肪酸进行图谱分析、SPSS数据统计分析；

6）、将分析所得的数据进行整理、总结。

作为本发明的血液相关脂肪酸谱的建立方法的改进：研究对象为哺乳动物，例如为人。

作为本发明的血液相关脂肪酸谱的建立方法的改进：该脂肪酸谱的建立方法适用于建立器官的脂肪酸谱；该器官包括心、肝、脾、肾、大脑、脂肪。

本发明在采用GC分析血液中脂肪酸的成分，建立相关的脂肪酸谱。

脂肪酸谱的建立方法是：获得血液——血液分离为血浆、血清或血小板——血液储存于-80℃——总脂肪成分的提取——总酯分离——总酯浓缩——（磷脂的分离）（如果测定总酯脂肪酸的话，此步骤可以省略，直接甲酯化）——脂肪酸甲酯化——甲酯物的提取、纯化—色谱纯正己烷，进GC——图谱分析——数据统计——脂肪酸谱完成。

首先声明，虽然本发明中涉及使用血液（新鲜血液）；但针对的只是已脱离人体的新鲜血液，其具体获取过程本身并不属于本发明的内容。本发明对其采集方法的详细描述只是为了更清楚地介绍生物材料的准备过程，但该描述并不意味着相关技术手段也属本发明要求保护的内容。

在本发明中，遵守以下规则：

1）研究得到伦理委员会的批准；

2）严格按照标准选择受试对象；

3）受试对象签署书面同意书；

4）按照建立血液相关脂肪酸谱的方法进行分析；

5）分析相关脂肪酸与慢性病之间的关系；

6）作出结论。

本发明的立的相关慢性病脂肪酸谱的方法，并不局限于本发明中案例中的糖尿病、代谢综合症、高血压、高脂血症、非酒精性脂肪肝等慢性病，也包括目前临床上认定的其他慢性病。

具体如下：

一、血液采集及总酯提取

本发明中，血液采集的方法为常规体检的方法。即：受试对象近期内无急性病、外伤、手术等意外情况，在采血前24h内不饮酒、不做剧烈运动，采血前一晚10点钟开始禁食，于次日早上9点至10点之间在医院有专业医师严格按照临床标准进行血液采集，采取肘正中静脉血。

本发明中，受试者血样取血为全血（静脉全血）5mL于抗凝管中，充分混匀，1000r/min离心5min，分离血浆，-80℃储存待用。

本发明中，血清的分离方法：取5mL静脉全血，静置2h，1000rpm离心10min分离血清，-20℃储存待用。

本发明中，血小板的分离方法：取全血（静脉全血）5mL于3.5%抗凝管(1：9)中，充分混匀，1000rpm离心5分钟，吸取血浆于另一试管中，3000rpm离心15min，弃去上层血浆，加3mL生理盐水，混匀，3000rpm离心15min，弃去上清液，-80℃待用。

本发明中，血液样本的储存温度可以是-80℃、也可以是-20℃、-30℃、-40℃或-70℃；即-20℃～-80℃。

本发明中，血液相关总脂肪成分提取的方法为：将血液样本（血浆、血清或血小板）从-80℃超低温冰箱中取出，放置常温下解冻。解冻后，取血浆、血清或血小板0.5mL至20mL具塞试管中，加入10ml氯仿-甲醇混合液（氯仿:甲醇=1:1v/v）。充分摇匀样品提取液，放入4℃冰箱中静置，充分浸提24小时后，进行总酯分离（如果样本较少的话，可以按照样本：液体=1:20的比例进行稀释）。

本发明中，总酯分离的方法为：将样品提取液过滤至100mL分液漏斗中（放置滤纸），原萃取试管（即，20mL具塞试管）再用5mL氯仿-甲醇混合液（氯仿:甲醇=2:1的体积比）清洗，转入分液漏斗；原萃取试管再用5mL氯仿清洗，转入分液漏斗。除去滤纸后，再加入4mL生理盐水至分液漏斗中。轻摇分液漏斗，并打开塞子放气，重复，直到里外气压平衡。然后剧烈震荡分液漏斗。分液漏斗静置约4小时，两个液面完全分开。然后收集下层有机相（氯仿层）至圆底蒸发瓶中，该下层有机相（氯仿层）中含有总酯。

总酯浓缩的方法为：将圆底蒸发瓶接取分液漏斗的下层有机相，于38℃水浴中抽真空旋转蒸发，用2mL含BHA的氯仿（BHA的浓度为50mg/mL，BHA为丁基羟基茴香醚）洗涤三次后旋干至得数滴清亮透明油状提取物，即为总酯。最后用5mL含BHA的氯仿（BHA的浓度为50mg/mL）溶解油状提取物，并转移至具塞试管（薄层层析）或总酯（直接甲酯化）特福伦试管中（按实验目的而定），涡旋振荡器混匀待用（如不能及时测定，可以充氮后保存在-20℃环境中待测，二周内测完）。N₂吹干具塞试管中的有机试剂，即得总酯浓缩物。

备注说明：

因为分液漏斗的特殊性，人工剧烈震荡，以每分钟120次的频率，震荡20s。（视液体融合的程度而决定力度大小，以将分液漏斗中的液体最大速度到达分液漏斗顶端和底端为准）。

轻轻震荡是指将分液漏斗中的液体慢摇，分别缓慢到达分液漏斗的顶端和底端，每分钟20～30次为宜。

本发明中，血液相关总脂肪成分提取的方法中，血液的解冻方法可以是常温下解冻，也可以是流水解冻，也可以是冰浴下摇床震荡解冻。

本发明中，血液相关总脂肪成分提取的试管可以是20mL，也可以是10mL或者是其他规格。

本发明中，原萃取试管清洗时，氯仿-甲醇混合液、氯仿以及生理盐水的体积比例为5:5:4。也可以是其他比例，但以该比例总酯浸提效果最好。

二、将总脂采用薄层层析法分离磷脂或甘油三酯：

将总酯浓缩物溶于100uL氯仿中，充分混匀，用毛细管点样于20cm*20cm的硅胶板中。点样点据底部边缘2cm处作为基线，进行点样。点样完毕后，将硅胶板置于含展开液（石油醚：乙醚：乙酸=85:15:2，v/v/v）的层析缸中，以展开液扩展至距离层析板顶端2cm出结束，于通风橱中晾干。然后将晾干后的层析板置于三外分析仪中观察，具体条带位置如示意图1所示。刮板。按照试验要求，刮取甘油三酯或磷脂条带硅胶，置于10mL特福伦试管中。

本发明中，硅胶板的制备方法：将7g硅胶快速溶于17～20g蒸馏水中，快速搅拌均匀，均匀涂抹于规格为20cm*20cm的玻璃板上（玻璃板要清洗干净，蒸馏水润洗，烘干，做板时不能有水渍存在。）水平放置（否则会导致玻璃板上硅胶厚度不一，影响分离效果），室温下凝结。待硅胶干后，样品点样前，将其放入100℃烘箱中活化90min，冷却至常温，待用。

本发明中，硅胶板可以自制，也可以购置。

本发明中，如需测定血液磷脂脂肪酸，则刮取磷脂带硅胶，其位置为点样处上下1cm。

本发明中，如果仅需测定总酯脂肪酸的含量，则不需要采用薄层层析，直接进入下一步——甲酯化。

三、将分离得到的磷脂或甘油三酯进行甲酯化：

在本发明中，包括甲酯化、甲酯物的提取、纯化：

具体如下：

1）甲酯化：在含有刮板硅胶或总酯的10mL特福伦试管中加入1mL甲苯和3mL的硫酸—甲醇溶液（硫酸浓度为0.9mol/L），拧紧盖子，震荡摇匀，在70℃水浴条件下，甲酯化2个小时，每隔30min进行震荡摇匀，加速甲酯化。

2）甲酯物的提取：甲酯化完后，加入2mL正己烷，再加入生理盐水至管口处，拧紧盖子，剧烈震荡1min（采用振动器），2000rpm离心10min。将上层正己烷相用玻璃吸管小心吸出至一事先放有2mL蒸馏水的圆底试管中，振荡混匀，静置分层再将上层有机相转移至事先装有少量（约100～200mg）无水Na₂SO₄的尖头离心管中。将上层有机相移入后，轻轻振荡，若发现其中的无水Na₂SO₄可以跳动，证明没有水分吸过来。再将上层石油醚相转移至一具塞试管中。

备注说明：如果无水Na₂SO₄不能跳动，且溶解，说明有水分吸过来，这需要重新静置分层，吸取上层有机相，直至无水Na₂SO₄可以跳动。

上述为：用特福伦试管（是10mL的试管）进行甲酯化。

3）甲酯物的纯化：用正己烷～2mL快速过（2～5s过完）SPE固相萃取小柱，再将样品快速过柱（2～5s过完）。用正己烷清洗具塞试管两次（每次的用量分别为2mL，1mL）后，快速过柱。然后，用3mL5%乙醚-正己烷溶液缓慢清洗聚酰胺柱（即，SPE固相萃取小柱），液体成滴收集到具塞试管。先用3mL氯仿：甲醇为2:1（V:V）的溶液，再用3mL正己烷慢速清洗柱子，冲洗速度为成滴滴下。然后在38℃水浴下N₂吹干；得到相应的脂肪酸甲酯。

本发明中，脂肪酸的甲酯化可以使不同比例的甲苯：硫酸甲醇的组合，本发明中的硫酸可以是硫酸，也可以是盐酸。甲酯物的纯化中的正己烷可以是石油醚。

四、将甲酯化脂肪酸采用气相色谱分离法测定脂肪酸成分：

在本发明中，脂肪酸的测定方法为：用100μL正己烷重新融解氮吹干的脂肪酸甲酯至样品瓶中，进样2μL由岛津气相色谱仪（GC－2010型）测定样品的脂肪酸成分。

本发明中，采用的仪器可以是岛津的气相色谱仪，也可以是其他品牌或型号的气相色谱仪。

本发明中，GC－2010型气相色谱的分析条件为：调节空气到50，调节氢气到75。调节Col（柱温）到160℃，调节Det（监测器温度）到260℃，调节Aux（进样口温度）到270℃。柱温升温程序:160℃(0min)；20℃/min、180℃(10min)；20℃/min、220℃(5min)；20℃/min、230℃(16.5min)。

本发明中，气相色谱的分析条件可以根据仪器不同而选择不同的气相分析条件，或者在原有条件的基础上进行修改。原则为能够将31种脂肪酸甲酯混合标样（sigma）的图谱清晰与完整的表现。本发明中，所用的脂肪酸混合标样为31种脂肪酸甲酯标准品（sigma），但该标准品也可以是37种脂肪酸甲酯混合标样（sigma），也可以是其他品牌或种类的脂肪酸混合标样。

备注说明：上述脂肪酸甲酯混合标样为直接进样，是为鉴定与分析样品中的峰的位置时用到的。

37种脂肪酸甲酯混合标样（sigma）为新推出的为含37种脂肪酸甲酯的混合标准品，是非等体积混合的标准品，含有反式脂肪酸的成分。

五、将脂肪酸进行图谱分析、SPSS数据统计分析；

本发明中，脂肪酸的成分分析方法为：采用GC－2010型气相色谱仪测定脂肪酸，用杭州英谱科技开发有限公司HS色谱数据工作站V4.0采集谱图，并处理分析所采集的谱图数据。色谱峰采用混合的脂肪酸甲酯标样(Sigma)来进行鉴定。定量方式采用面积法，定量方法为归一法。

本发明中，谱图采集处理采用采用与标准品保留时间对照的方法定性，即根据相对保留值定性；采用面积法定量，即运用面积归一法求各色谱峰面积，并计算血浆中脂肪酸含量。

本发明中，数据统计分析采用SPSS进行分析，数据采用独立样本t检验，结果表示为Mean±SD值。P<0.05确认为有显著性差异。

在本发明中，数据统计分析的方法可以是SPSS，也可以是SAS、DPS，STATA，Excel等具有分析统计作用的软件。

六、将分析所得的数据进行整理，总结。

为了建立中国慢性病人群的血液相关脂肪酸谱，首先在每个研究进行前需经过伦理委员会的批准。

本发明中，受试者均来自浙江地区，但是受试人群可以是全国范围内。

为了建立中国人群慢性病人群的血液相关脂肪酸谱，该研究所有的受试者在实验前均给予书面同意。

为了建立中国人群慢性病人群的血液相关脂肪酸谱，每一种慢性病人群及健康对照均按照标准严格筛选。

为了建立中国人群慢性病人群的血液相关脂肪酸谱，需要对样本的生理参数进行检测。

本发明中，总样本数为3764例，其中病例1444例，健康对照2320例。涉及慢性病包括2型糖尿病（病例781例，健康对照322例），代谢综合症（病例262例，健康对照868例），高脂血症（病例86例，健康对照82例），高血压（病例214例，健康对照940例），非酒精性脂肪肝（病例101例，健康对照108例）

本发明具有如下技术优点：

1、本发明建立了一种系统、有效、可信的血液相关脂肪酸谱的建立方法；

2、本发明建立了人类血液相关脂肪酸谱与慢性病之间的关系的分析思路。

综上所述，本发明创立了一种系统研究不同脂肪酸的摄入与健康人及慢性疾病之间的相关性的方法；创立了一种简单有效且实用的脂肪酸谱的建立方法；建立了健康人与目前流行的慢性疾病的脂肪酸谱，对人类健康和脂肪摄入提供了强有力的指导作用。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是血液脂质提取物薄层层析示意图谱。

图2是31种脂肪酸混合标样图。

图3是糖尿病人血浆磷脂脂肪酸GC图。

图4是正常人血浆磷脂脂肪酸GC图。

具体实施方式

实施例1、2型糖尿病人群的血浆磷脂脂肪酸谱的建立方法

研究背景：

2型糖尿病（Type2Diabetes Mellitus,T2DM）是一种严重影响个人和社会的慢性疾病，其在全球急剧上升的发病率，使得人们对糖尿病的关注越来越多。据估计，到2030年全球将有近3.6亿糖尿病患者，糖尿病引起的健康问题会对生活质量带来巨大变化。体重增加，并伴随MS相关症状是2型糖尿病最明显最常见的临床症状。研究表明，膳食因素在T2DM的发生和发展中起了重要作用。增加饮食中n-3多不饱和脂肪酸（n-3PUFA）的摄入，可以改善体内脂质构成，改善胰岛素抵抗的状况对男性医疗专业人员12年的跟踪研究观察到脂肪种类和患2型糖尿病的风险由明显的联系。饮食中n-6和n-3多不饱和脂肪酸的不平衡是胰岛素抵抗、代谢综合症中血脂异常的一个重要因素。动物实验报道喂养n-3多不饱和脂肪酸可以提高胰岛素的敏感性，然而人类实验表明使用n-6多不饱和脂肪酸降低胰岛素的敏感性。2型糖尿病的前瞻性研究中报道总脂肪酸、或者特殊类型的脂肪酸和2型糖尿病发病风险没有关系。动物学研究表明n-3PUFA可以降低或阻止胰岛素抵抗，但是临床研究结果不一致。动物学研究表明n-3PUFA可以减低或阻止胰岛素抵抗，但是临床结果却不一致。因此，研究膳食成分中脂肪酸的摄入与T2DM之间的关系变得十分重要，，由于中国人饮食的复杂性和烹饪过程的随意性，使得通过分析膳食成分来研究脂肪酸摄入与T2DM之间的关系十分困难。因为饮食会影响血浆脂肪酸成分的种类和数量，因此我们选择血浆脂肪酸作为膳食脂肪酸摄入的生物标记物，以建立T2DM的脂肪酸谱，从而研究膳食脂肪酸与T2DM之间的关系，以便进一步从饮食上控制与预防T2DM的流行。

研究方法与结果分析

1.研究经过浙江大学生物系统工程与食品科学学院伦理委员会的审核确认后，选择受试对象，所有受试对象给予书面同意书。

2.选择受试人群

研究对象：2型糖尿病病人：经严格筛选，选择浙江省内，血糖水平稳定在7.0～10.0mmol的不同年龄段（0-100yr）、不同性别（男、女）的2型糖尿病病人被纳入研究对象。I型糖尿病人、具有心血管疾病史或动脉粥样硬化史、脑血管疾病史，严重肝脏疾病和/或肾脏疾病以及血液疾病的人都被排除在外。所有的受试者均服用降糖药。

健康对照：通过健康检查、年龄和性别均匹配的健康对照受试者被纳入此研究。通过对高血压病、肾脏疾病、高脂蛋白血症、血液症、糖尿病、遗传性心血管疾病过量饮酒和吸毒的严格筛查，322例健康人被纳入研究对象。

3.样本量：总样本数为1103例，2型糖尿病患者为781例(其中男性为418例，女性为363例)，健康对照为322例(其中男性为161例，女性为161例)。

表1样本人群构成

4血浆磷脂脂肪酸谱的建立方法如下：

1.血液采集与分离

1.1血液采集

确保受试对象近期内无急性病、外伤、手术等意外情况，在采血前24h内不饮酒、不做剧烈运动，采血前一晚10点钟开始禁食，于次日早上9点至10点之间在医院有专业医师严格按照临床标准进行血液采集，采取肘正中静脉血。

1.2血液分离

受试者血样取血为全血5mL于抗凝管中，充分混匀，1000r/min离心5min，分离血浆，-80℃储存待用。

2.总酯提取、分离与浓缩

2.1总酯提取：

将血液样本（血浆、血清或血小板）从-80℃超低温冰箱中取出，放置常温下解冻。解冻后，取血浆0.5ml至20ml具塞试管中，加入10ml氯仿-甲醇混合液（氯仿:甲醇=1:1v/v）。充分摇匀样品提取液，放入4℃冰箱中静置，充分浸提24小时后，进行总酯分离。

2.2总酯分离

将样品提取液过滤至100ml分液漏斗中（漏斗中放置滤纸）。原萃取试管（即，20ml具塞试管）先用5ml氯仿-甲醇混合液（氯仿:甲醇=2:1的体积比）清洗，清洗液转入分液漏斗；原萃取试管再用5ml氯仿清洗，清洗液转入分液漏斗。除去滤纸后，再加入4ml生理盐水至分液漏斗中。轻摇分液漏斗，并打开塞子放气，重复，直到里外气压平衡。然后剧烈震荡分液漏斗。分液漏斗静置约4小时，两个液面完全分开。然后收集下层有机相（氯仿层）至圆底蒸发瓶中，该下层有机相（氯仿层）中含有总酯。

2.3总酯浓缩

将圆底蒸发瓶接取分液漏斗的下层有机相，于38℃水浴中抽真空旋转蒸发，用2ml氯仿（含50mg/mL BHA）洗涤三次后旋干至得数滴清亮透明油状提取物，即为总酯。最后用5mL氯仿（含50mg/Ml BHA）溶解油状提取物，并转移至具塞试管（薄层层析）或总酯（直接甲酯化）特福伦试管中（按实验目的而定），涡旋振荡器混匀待用（如不能及时测定，可以充氮后保存在-20℃环境中待测，二周内测完）。N₂吹干具塞试管中的有机试剂，即得总酯浓缩物。

2.4薄层层析法分离血浆磷脂

2.4.1硅胶板制备

将7g硅胶快速溶于17～20g蒸馏水中，快速搅拌均匀，均匀涂抹于规格为20cm*20cm的玻璃板上（玻璃板要清洗干净，蒸馏水润洗，烘干，做板时不能有水渍存在。）水平放置（否则会导致玻璃板上硅胶厚度不一，影响分离效果），室温下凝结。待硅胶干后，样品点样前，将其放入100℃烘箱中活化90min，冷却至常温，待用。

2.4.2磷脂提取

将总酯浓缩物溶于100uL氯仿中，充分混匀，用毛细管点样于20cm*20cm的硅胶板中。点样点据底部边缘2cm处作为基线，进行点样。点样完毕后，将硅胶板置于含展开液（石油醚：乙醚：乙酸=85:15:2，v/v/v）的层析缸中，以展开液扩展至距离层析板顶端2cm出结束，于通风橱中晾干。然后将晾干后的层析板置于三外分析仪（开紫外光254nm）中观察，按照绿色荧光显示的位置，用铅笔轻轻标出。刮板，按照试验要求，刮取磷脂条带硅胶粉，置于10mL特福伦试管中。

2.5血浆磷脂甲酯化

2.5.1甲酯化

在含有刮板硅胶的10mL特福伦试管中加入1mL甲苯和3mL0.9mol/L硫酸—甲醇溶液，拧紧盖子，震荡摇匀，在70℃水浴条件下，甲酯化时间为2个小时，每隔30min进行震荡摇匀，加速甲酯化。

2.5.2甲酯物的提取

甲酯化完后，冷却至室温后，加入2mL正己烷，再加入生理盐水至管口处，拧紧盖子，剧烈震荡1min（采用振动器），2000rpm离心10min。将上层正己烷相用玻璃吸管小心吸出至一事先放有2mL蒸馏水的圆底试管中，振荡混匀，静置分层再将上层有机相转移至事先装有少量（约100～200mg）无水Na₂SO₄的尖头离心管中。将上层有机相移入后，轻轻振荡，若发现其中的无水Na₂SO₄可以跳动，证明没有水分吸过来。再将上层石油醚相转移至一具塞试管中。

2.5.3甲酯物的纯化

用正己烷～2mL快速过（2～5s过完）SPE固相萃取小柱，再将样品快速过柱（2～5s过完）。用正己烷清洗具塞试管两次（每次的用量分别为2mL，1mL）后，快速过柱。然后，用3mL5%乙醚-正己烷溶液缓慢清洗聚酰胺柱（即，SPE固相萃取小柱），液体成滴收集到具塞试管。先用氯仿:甲醇为2:1（V:V）的溶液3mL，再用3mL正己烷慢速清洗柱子，冲洗速度为成滴滴下。然后在38℃水浴下N₂吹干；得到相应的脂肪酸甲酯。

2.6血浆磷脂脂肪酸甲酯的测定与分析

2.6.1脂肪酸甲酯的测定

GC－2010型气相色谱的分析条件为：调节空气到50，调节氢气到75。调节Col（柱温）到160℃，调节Det（监测器温度）到260℃，调节Aux（进样口温度）到270℃。柱温升温程序:160℃(0min)；20℃/min、180℃(10min)；20℃/min、220℃(5min)；20℃/min、230℃(16.5min)。

31种脂肪酸甲酯混合标准品（Sigma）：进样2μL，测定。

样品：用100μL正己烷重新融解氮吹干的脂肪酸甲酯至气相样品瓶中，进样2μL由岛津气相色谱仪（GC－2010型）测定样品的脂肪酸成分。

2.6.2脂肪酸甲酯的图谱分析

按照31中脂肪酸甲酯混合标准品（Sigma）中不同脂肪酸甲酯的保留时间（Fig.2）对样品中的脂肪酸成分进行定性，按照峰面积对样品中的脂肪酸甲酯进行定量。

2.6.3脂肪酸成分整理

对样品中的脂肪酸甲酯的成分和量整理。

2.7采用SPSS数据统计软件对健康人与糖尿病人的血浆磷脂脂肪酸成分进行分析。数据采用独立样本t检验，结果表示为Mean±SD值。P<0.05确认为有显著性差异。

3结果分析

3.12型糖尿病人群与健康人群的血浆脂肪酸谱：如表1.2所示。

与健康正常人群相比，2型糖尿病人群的血浆磷脂的总多不饱和脂肪酸(PUFA)，n-3PUFA，n-6PUFA，C22:6n-3，C22:5n-3，C18:2n-6均显著低于健康人群，而单不饱和脂肪酸(MUFA)，C22:5n-6，C16:0，C18:1n-9，C18:1n-7均显著高于健康人群。

表22型糖尿病和健康人群的血浆磷脂脂肪酸图谱

SFA:饱和脂肪酸，saturated fatty acids；

MUFA:单不饱和脂肪酸，monounsaturated fatty acids,

PUFA:多不饱和脂肪酸，polyunsaturated fatty acids,

n-3/n-6:n-3多不饱和脂肪酸与n-6多不饱和脂肪酸脂肪酸的比值，n-3PUFA/n-6PUFAP<0.05表示有显著性差异。

Mean:平均值；SD：标准差；P-value:p值P值一种概率，一种在原假设为真的前提下出现观察样本以及更极端情况的概率。上述数据采用统计分析软件得到的。

3.2血浆磷脂脂肪酸与糖尿病发病风险之间的关系，如表3所示。

对血浆磷脂脂肪酸变量进行Bionary Logistic逻辑回归分析，结果如表3所示。C14:0，C14:1，C16:0，C18:1n-9，C18:1n-7，C22:5n-6，n-3/n-6均与糖尿病发生呈显著负相关（Exp(B)即OR值＜1，P＜0.05；C18:0，C18:2n-6，C22:5n-3，C22:6n-3，Total PUFA，n-3PUFA，n-6PUFA均与糖尿病发生呈显著正相关（Exp(B)即OR值>1，p<0.05）。

表32型糖尿病和健康人群血浆磷脂脂肪酸单因素Logistic回归分析

注:B为偏回归系数，SE为偏回归系数的标准误差，Exp(B)即OR为优势比，95.0%C.I为95%置信区间。

2.2型糖尿病人群不同性别的血浆脂肪酸谱（表4）。

本案例中，糖尿病人群为781例，其中男性418例，女性363例。通过单因素logistic回归分析得出，糖尿病与性别无显著相关性，但是通过对男性和女性的发病风险分析得出男性患糖尿病的风险为OR1.07,女性的发病风险为OR：0.93。因此对糖尿病人群进行性别分组，分析其脂肪酸图谱（如表4）。男性糖尿病人群的血浆磷脂脂肪酸中的C20:1n-9,C20:5n-3,C22:5n-3,n-3PUFA的百分比均显著低于女性糖尿病人群。

表4II型糖尿病患者不同性别的血浆磷脂脂肪酸谱

备注说明：

表2是2型糖尿病和健康人群的血浆磷脂脂肪酸图谱

表4是分性别，对糖尿病人的血浆磷脂脂肪酸图谱，细分了2型糖尿病的脂肪酸图谱。

3.2型糖尿病人群不同年龄的脂肪酸谱（表5）

由于本人群中年龄差异较大，因此就糖尿病人群按照年龄分组，分为29岁以下，30～39岁，40～49岁，50～59岁，60～69岁，70～79岁，80～89岁。分析其脂肪酸组成，并建立相应的脂肪酸图谱(如表1.5)。由表1.5可以看出，不同年龄段的糖尿病人群的血浆磷脂脂肪酸中的C18:3n-3(p=0.022)，C20:1n-9(p=0.028)，C20:3n-6(p=0.011)，C22:5n-3(p=0.016)有显著性差异。

表5II型糖尿病患者不同年龄的血浆磷脂脂肪酸图谱

实施例2、代谢综合症人群血清磷脂脂肪酸谱的建立

研究背景

代谢综合征（metabolic syndrome,MS）是多种代谢成分异常聚集的病理状态，是一组复杂的代谢紊乱症候群，是导致糖尿病(DM)心脑血管疾病(CVD)的危险因素，其集簇发生可能与胰岛素抵抗(IR)有关，目前已成为心内科和糖尿病(DM)医师共同关注的热点，国内外至今对它的认识争议颇多。代谢综合症通常包括三种或更多的不同因素，包括腹部肥胖、高血压、血脂紊乱。在过去的二十年间，全世界患有MS的人数显著增加，但是不同种族的发病情况不同。在中国进行的一项横断面表明，代谢综合症在男性的发病率是9.8%，女性的发病率为17.8%。在中国这种大面积的MS已经成为一个重要的公众健康问题，因此需要采取紧急措施去预防MS在全球流行。MS的增加与全球肥胖和糖尿病的流行，以及血清尿酸浓度的增加有关。

其临床表现为：1、腹部肥胖或超重；2、致动脉粥样硬化血脂异常[高甘油三酯（TG）血症及高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）低下；3、高血压；4、胰岛素抗性及/或葡萄糖耐量异常；5、有些标准中还包括微量白蛋白尿、高尿酸血症及促炎症状态（C-反应蛋白CRP）增高及促血栓状态（纤维蛋白原增高和纤溶酶原抑制物—1，PAI-1）增高。

饮食和生活方式在MS的病情演化中起到很重要的作用，营养调节可以改变MS的病情发展。因为MS患者的脂肪酸成分中通常含有较高水平的SFA和较低水平的PUFA。先前的已经证明饮食中的脂肪成分在MS发展中的作用。高饱和脂肪酸和反式脂肪酸饮食对MS的各个因素具有不利的影响。因此，研究建立代谢综合症相关的血液脂肪酸谱是非常重要的，在此我们选择血清脂肪酸作为膳食脂肪酸摄入的生物标记物，以建立MS的脂肪酸谱，从而研究膳食脂肪酸与MS之间的关系，以便进一步从饮食上控制与预防MS的流行。

研究方法与结果分析

2.选择受试人群：杭州两家疗养院体检中心的体检人群。

3.受试对象确定诊断标准：根据中华医学会糖尿病分会诊断标准（中华医学会糖尿病学分会代谢综合征研究协作组2004），以下4项中具备3项以上为代谢综合症（MS）：1.有DM史或空腹血糖≥6.1mmol/L，餐后血糖≥7.8mmol/L；2.超重或肥胖，身体质量指数（BMI）≥25；3.有高血压病史或血压≥140/90mmHg；4.有高血脂史或甘油三酯≥1.7mmol/L，高密度脂蛋白胆固醇降低（男性<0.9mmol/L，女性<1.0mmol/L）。超重/肥胖采用中国肥胖问题工作制定的方案（中国肥胖问题工作组数据汇总分析协作组2002），BMI在18.5～23.9范围为正常，24.0～27.9为超重，≥28.0为肥胖。

4.样本总样品数1652例，均为男性。其中未患有MS的组分为858例，设为健康对照组；符合代谢综合症标准的为262例，设为代谢综合症组。其余不符合MS的标准。

5.样本的生理参数：

如表2.1所示，代谢综合症人群的体重，BMI，收缩压，舒张压，GLU，TC，TG，LDL-C均显著高于健康对照人群。

表2.1MS组和对照组生理参数

6.血清磷脂脂肪酸谱的建立步骤如下：

6.1血液采集与分离

6.1.1血液采集同实施例1。

6.1.2血清分离

取5mL静脉全血，静置2h，1000rpm离心10min，分离血清，-20oC储存待用。

6.2血清总酯提取、分离与浓缩

血样样本为血清，其他同实施例1。

6.3血清磷脂甲酯化同实施例1。

6.4血清磷脂脂肪酸甲酯的测定与分析同实施例1。

6.5数据统计同实施例1。

7.MS人群的血清磷脂脂肪酸谱如下：

表2.2MS人群与健康对照人群的血清磷脂脂肪酸谱(mg/100mL)

MS人群血清磷脂脂肪酸中C16:0、C18:0、C20:1、C18:2n-6、TFA、Total SFA、的浓度显著高于健康对照组，而C20:4n-6、C22:1、C22:4n-6、C22:5n-3、C22:6n-3、Total PUFA、Totaln-6、Total n-3的浓度显著低于健康对照组。

8.血清磷脂脂肪酸与MS的发病风险的分析，如表2.3所示。

表2.3MS人群与健康人群的血清磷脂脂肪酸成份的单因素逻辑回归分析

由表2.3可知，C18:0，C20:4n-6，C22:1，C22:5n-3，C22:6n-3，total SFA,total PUFA(n-3PUFA,和n-6PUFA)显著相关。其中，摄入C22:5n-3，C22:6n-3,total n-3PUFA可以降低代谢综合症的风险。

9.代谢综合症组分与脂肪酸的相关性分析

由表2.4可知，BMI与TFA，MUFA，n-6/n-3显著正相关，PUFA，n-6PUFA，n-3PUFA显著负相关；收缩压与TFA显著正相关，与PUFA显著负相关；舒张压与SFA显著正相关，与PUFA显著负相关；TG与TFA显著正相关，GLU与TFA，MUFA显著正相关。

表2.4代谢综合症指标与脂肪酸的相关性分析

10.结论

总结，通过对男性代谢综合症人群和健康对照人群的血清磷脂脂肪酸谱的分析，得知代谢综合症人群的total TFA，total SFA,n-6/n-3均显著高于健康对照人群，代谢综合症的相关指标BMI，SBP，TG，HDL-C，Glu与TFA呈显著正相关，SFA摄入越多，MS的风险越高；相反，摄入C22:5n-3，C22:6n-3,total n-3PUFA越高，患MS的风险越低。

实施例3高血压人群的血浆磷脂脂肪酸谱的建立

研究背景：

高血压是最常见的慢性病，也是心脑血管病最主要的危险因素，脑卒中、心肌梗死、心力衰竭及慢性肾脏病是其主要并发症。国内外的实践证明，高血压是可以预防和控制的疾病，降低高血压患者的血压水平，可明显减少脑卒中及心脏病事件，显著改善患者的生存质量，有效降低疾病负担。高血压的危害性与患者的血压水平相关外，还取决于同时存在的其他心血管病危险因素、靶器官损伤以及合并的其他疾病的情况。

长期的膳食补充高纯度n-3多不饱和脂肪酸（PUFA）使有正常血压和轻度高血压的高甘油三酯血症患者的血压显著降低。一项在28100名39岁以上（含39岁）的不含心血管疾病和癌症的美国妇女中进行的前瞻性对列研究发现，摄取饱和脂肪酸（SFA）、单不饱和脂肪酸（MUFA）和反式脂肪酸和高血压的患病风险显著正相关，同时，n-6PUFA和n-3PUFA的摄取和高血压的患病风险不显著相关。

因此，研究膳食脂肪酸与高血压的关系具有非常重要的意义。在此，我们选择血浆磷脂脂肪酸作为脂肪酸膳食摄入的生物标记，来建立并比较高血压人群的血浆磷脂脂肪酸谱。研究高血压与膳食脂肪酸之间的相关性，从而使通过饮食干扰降低和减少高血压的发生成为可能。

研究内容

1.研究经过浙江大学生物系统工程与食品科学学院伦理委员会的审核确认。

2.选择受试人群：浙江医院2006年3月至2010年6月的体检项目。

3.按照高血压的定义（收缩压维持在140mm汞柱或者更高；舒张压维持在90mm汞柱或者更高（两者具有之一者即为高血压患者）），选择受试对象，所有受试对象给予书面同意书。

4.研究对象样本总量为1154例，其中高血压人群为214例（其中女性54例，男性160例），正常对照人群为940例（其中男性276例，女性664例）。

5.血样收集及样本处理同上上述实施例1。

6.样本的生理生化参数如下：

如表3.1所示，高血压人群的收缩压和舒张压，均显著高于正常对照组。

表3.1高血压人群和健康对照人群相关生理生化指标

7.血浆磷脂脂肪酸谱如表3.2所示：

对高血压人群与健康对照人群的血浆磷脂的脂肪酸分析后得知，高血压人群的C20:4n-6显著低于正常对照人群，其Total PUFA,n-3PUFA和n-6PUFA均显著低于正常对照人群。

表3.2高血压人群与健康对照人群的血浆磷脂脂肪酸谱

8.血浆磷脂脂肪酸与高血压的患病风险，如表3.3所示：

由表3.3可知，total SFA含量高可显著提高高血压的发病风险，而n-3PUFA以及n-3/n-6可降低高血压的发病风险。

表3.3逻辑回归分析血浆磷脂脂肪酸与高血压的患病风险

9.血浆磷脂脂肪酸与高血压的相关性分析，如表3.4所示。

如表3.4所示，血浆磷脂n-3PUFA和total PUFA与舒张压显著负相关，Total SFA与收缩压显著正相关，而total MUFA与舒张压显著正相关。

表3.4血浆磷脂脂肪酸与高血压人群的相关性分析

10.结论：

本研究建立了高血压人群的血浆磷脂主要的脂肪酸的图谱，并分析了血浆磷脂脂肪酸与高血压的患病风险，并对血浆磷脂脂肪酸与高血压两个因素的相关性进行了分析。结果表明，高血压人群的血浆磷脂PUFA,n-3PUFA,n-6PUFA均显著低于健康人群。血浆磷脂n-3PUFA和total PUFA与舒张压显著负相关，Total SFA与收缩压显著正相关，而totalMUFA与舒张压显著正相关。因此，膳食摄入高SFA可以增加高血压的发病风险，而增加摄入n-3PUFA，提高膳食中或体内n-3/n-6的水平则可以显著降低高血压的发病风险。

实施例4、高脂血症人群血小板磷脂脂肪酸谱的建立

研究背景

高脂血症是一种全身性疾病，指血中总胆固醇（TC）和/或甘油三酯（TG）过高或高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）过低，现代医学成为血脂异常。脂质不溶或微溶于水，必须与蛋白质结合以脂蛋白的形式存在，因此，高脂血症也称为高脂蛋白血症。高脂血症的主要危害是导致动脉粥样硬化，进而导致众多的相关疾病，其中最常见的一种致命性疾病就是冠心病，严重乳糜微粒血症可导致急性胰腺炎，是另一致命性疾病。高脂血症也是促进高血压、糖耐量异常、糖尿病的一个重要危险因素。高脂血症还可导致脂肪肝、肝硬化、胆石症、胰腺炎、眼底出血、失明、周围血管疾病、跛行、高尿酸血症。有些原发性和家族性高脂血症患者还可出现腱状、结节状、掌平面及眼眶周围黄色瘤、青年角膜弓等。

增加n-3多不饱和脂肪酸摄入能够预防一些代谢性疾病的发生，如糖尿病、动脉粥样硬化，其中，动脉粥样硬化是影响糖尿病人死亡率的最主要因素。N-3多不饱和脂肪酸对心血管疾病的相关因子具有保护作用，n-3多不饱和脂肪酸对动脉血栓形成和血小板功能有明显影响，

在高脂血症的发病原因中，饮食饮食，特别是膳食中的脂肪酸种类及含量占有十分重要的地位，但目前我们仍无法准确测量饮食中脂质的成分，血小板磷脂膜脂肪酸成分反映了长期饮食中脂类的特性，因此，我们选择其作为膳食脂肪酸摄入的生物标记，来建立高脂血症的血小板磷脂脂肪酸谱，研究高脂血症与膳食脂肪酸之间的相关性，从而使通过饮食干扰降低和减少高脂血症的发生成为可能。

研究方法与结果

2.按照高脂血症和健康人群的标准，分别选择受试对象，所有受试对象给予书面同意书。根据血清总胆固醇、甘油三酯和高密度脂蛋白-胆固醇的测定结果，高脂血症分为以下四种类型：

1）高胆固醇血症：血清总胆固醇含量增高，超过5.2毫摩尔/升，而甘油三酯含量正常，即甘油三酯<1.70毫摩尔/升。

2）高甘油三酯血症：血清甘油三酯含量增高，超过1.70毫摩尔/升，而总胆固醇含量正常，即总胆固醇<5.2毫摩尔/升。

3）混合型高脂血症：血清总胆固醇和甘油三酯含量均增高，即总胆固醇超过5.2毫摩尔/升，甘油三酯超过1.70毫摩尔/升。

4）低高密度脂蛋白血症：血清高密度脂蛋白-胆固醇（HDL-C）含量降低，<0.91毫摩尔/升。

3.样本量：高脂血症人群：n=86例（其中男性53例，女性33例），年龄在30～78岁；健康对照组：n=82例（其中男性55例，女性27例），年龄为24～74岁。健康对照组无体格检查无糖尿病、肝病、肾病，及其他与血栓形成相关疾病。调查并记录对象的身高、体重、血压、饮食习惯、吸烟史、降脂药史、以及其他家族史。

4.血液采集及血小板磷脂脂肪酸处理方法基本如前所述。具体如下：

血液样本为血小板，血小板的分离方法：取全血5ml于3.5%(1：9)抗凝管中，充分混匀，1000rpm离心5分钟，吸取血浆于另一试管中，3000rpm离心15min，弃去上层血浆，加3mL生理盐水，混匀，3000rpm离心15min，弃去上清液，-80℃待用。

其他同实施例1。

5.高脂血症人群与健康对照组的生理参数如表4.1所示。

高脂血症人群与健康对照人群的生理参数没有显著性差异。

表4.1高脂血症人群与健康对照人群的生理参数

6.高脂血症人群与正常对照人群的血小板磷脂脂肪酸谱，如表4.2所示：

由表4.2所示，高脂血症人群与健康对照人群血小板磷脂脂肪酸的组成没有显著性差异，说明高脂血症患者和健康人饮食中的脂肪酸成分相似。

表4.2高脂血症人群与健康对照人群的血小板磷脂脂肪酸谱

7.高脂血症人群不同性别的血小板磷脂脂肪酸谱，如表4.3所示。

如表4.3所示，高脂血症人群中，除C24:0外，不同性别的患者的血小板磷脂脂肪酸成分没有显著性差异。

表4.3不同性别的高脂血症病人的血小板磷脂脂肪酸谱之间的差异

*表示有显著性差异

7.结论

通过对高脂血症人群和健康对照人群的血小板磷脂脂肪酸谱的分析，两者之间的血小板磷脂脂肪酸没有显著性差异，说明高脂血症人群与健康对照人群的摄入的脂肪成分相似。

实施例5、非酒精性脂肪肝的血小板磷脂脂肪酸谱的建立

研究背景

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）是指除外酒精和其他明确的损肝因素所致的肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征，与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关的获得性代谢应激性肝损伤。包括单纯性脂肪肝（simple fatty liver,SFL）、非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis,NASH）及其相关肝硬化。

NAFLD分原发性和继发性两大类，前者与胰岛素抵抗和遗传易感性有关，而后者则由某些特殊原因所致。营养过剩所致体重增长过快和体重过重，肥胖、糖尿并高脂血症等代谢综合征相关脂肪肝，以及隐源性脂肪肝均属于原发性NAFLD范畴；而营养不良、全胃肠外营养、减肥手术后体重急剧下降、药物/环境和工业毒物中毒等所致脂肪肝则属于继发性NAFLD范畴。非酒精性脂肪肝的发病率在逐年增长，NAFLD现在已经成为我国常见的慢性肝病之一，严重危害人民健康。其主要的危险因素与代谢综合征相似，与血脂、胰岛素抵抗等密切相关，膳食因素尤其是膳食脂肪酸结构失调是脂肪代谢相关疾病的重要原因，但目前无法准确测量膳食中脂肪酸的成分。本研究旨在建立NAFLD患者的血浆和血小板磷脂脂肪酸谱，分析相关脂肪酸与NAFLD之间的关系，，从而使通过饮食干扰降低和减少NAFLD的发生成为可能。

研究内容：

2.按照高脂血症和健康人群的标准，分别选择受试对象，所有受试对象给予书面同意书。

3.样本量：如表5.1所示。

表5.1样本人群构成

4.血样采集及血小板磷脂脂肪酸谱的建立如实施例4。

5.NAFLD人群与健康对照人群的生理参数，如表5.2所示。

由表5.2可知，NAFLD人群的BMI，SBP，DBP均显著高于健康对照组。

表5.2非酒精性脂肪肝人群与健康对照人群的生理参数

6.NAFLD人群与健康对照人群的血浆磷脂脂肪酸谱如表5.3所示：

如表5.3所示，NAFLD人群的C14:1，C16:1n-7，C22:3n-6，Total SFA均显著高于健康对照人群；而C14:1，C18:1n-7，C20:4n-6，C22:2n-6，total PUFA均显著低于健康人群。

表5.3NAFLD人群与健康对照人群的血浆磷脂脂肪酸谱

7.NAFLD人群与健康对照人群的血小板磷脂膜的脂肪酸谱

由表5.4可知，对NAFLD人群和健康对照人群的血小板磷脂膜脂肪酸谱的分析显示，健康对照人群的饱和脂肪酸（C14:0，C15:0，C17:0，C18:0，Total SFA）显著高于NAFLD人群；而单不饱和脂肪酸（C14:1，C15:1，Total MUFA）显著低于NAFLD人群。然而，NAFLD人群的n-3PUFA，n-3/n-6PUFA显著低于健康对照人群，且NAFLD人群的n-6PUFA显著高于健康对照人群。

表5.4NAFLD人群与健康对照人群的血小板磷脂膜的脂肪酸谱

8.结论

对NAFLD人群和健康对照人群的血浆和血小板的磷脂脂肪酸进行了分析，得出以下结论：1）血浆和血小板的磷脂脂肪酸谱是有差异的，而血小板磷脂膜脂肪酸成分反映了长期饮食中脂类的特性，因此在选择膳食脂肪酸的生物标记时，应根据实验条件和实验目的进行删选；2）NAFLD人群的血小板磷脂n-3PUFA，n-3/n-6PUFA显著低于健康对照人群，且NAFLD人群的n-6PUFA显著高于健康对照人群。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.血液相关脂肪酸谱的建立方法，其特征是包括以下步骤：

2）、将总脂用薄层层析法分离磷脂、甘油三酯；

3）、将分离得到的磷脂、甘油三酯进行甲酯化；

4）、将甲酯化脂肪酸采用气相色谱分离法测定脂肪酸成分；

5）、将脂肪酸进行图谱分析、SPSS数据统计分析；

6）、将分析所得的数据进行整理、总结。

2.根据权利要求1所述的血液相关脂肪酸谱的建立方法，其特征在于：研究对象为哺乳动物。

3.根据权利要求2所述的血液相关脂肪酸谱的建立方法，其特征在于：哺乳动物为人。

4.根据权利要求3所述的血液相关脂肪酸谱的建立方法，其特征在于：该脂肪酸谱的建立方法适用于建立器官的脂肪酸谱；该器官包括心、肝、脾、肾、大脑、脂肪。