CN103602703A - 改良植物构型并提高植物生物量和/或蔗糖产量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于改良植物构型并提高植物生物量和/或蔗糖产量的方法和构建体。
Description
本申请为2009年4月27日进入中国国家阶段、申请号为200780039976.8、申请日为2007年10月26日、发明名称为“改良植物构型并提高植物生物量和/或蔗糖产量的方法”的发明专利申请的分案申请。
相关的申请
本申请要求2006年10月27日提交的美国临时申请第60/863,252号的优先权，通过引用将该申请公开的内容完整合并至本文中。
技术领域
本发明涉及分子生物学领域和通过将外源基因引入植物细胞（优选引入它们的基因组）而使植物性状的表型改变。更具体地，本发明是关于生产转基因植物的方法和组合物，该植物相对于在相似条件下生长的非转基因植物来说具有改良的植物构型（plant architecture）和提高的生物量和/或蔗糖产量。
背景技术
甘蔗是最有光合效率的栽培作物之一。甘蔗在巴西（世界上最大的生产国）的平均年产量为80吨/公顷至120吨/公顷。然而，潜在的每公顷300吨生物量的产率已被提出。Alexander，THE ENERGY CANE ALTERNATIVE(Elsevier，1985)。
生物量的利用近年来已是有浓烈兴趣的课题，特别是有关开发生产代用燃料的方法的努力，代用燃料使用非淀粉、非食物相关的生物量，例如树、草和废弃材料，这将扩大糖的可用资源的基础并将降低成本源。在巴西，甘蔗工厂已开发出用于生产燃料乙醇的大规模蔗糖发酵技术。在2006/2007产量方面，大约生产了180亿升来源于甘蔗的乙醇。除了提供可再生的燃料来源之外，基于甘蔗的燃料还提供了减少CO2排放的手段。
数个世纪以来，甘蔗几乎仅作为蔗糖来源被栽培，蔗糖以高浓度积聚在茎节间中。随后蔗糖在大的压榨工厂被提取和纯化，并被用作食品工业的原料。
虽然甘蔗的光合作用很有效率，但全世界商业甘蔗种植的平均产率受甘蔗基因组的高多倍体性质的限制，该性质使得甘蔗不可按照大多数的被开发用于二倍体物种的育种技术处理。因为传统的育种程序在产生高产植物方面取得了有限的成功，所以栽培的甘蔗品种是来源于热带种（Saccharumofficinarum）与其亲缘之间的种间杂交的克隆，该亲缘最经常是细茎野生种（S.spontaneum），但也可是中国种（S.sinense）或印度种（S.barberi），它们的子代被与热带种回交。另一方面，操作植物基因组的分子遗传学方法的出现给研究人员提供了通过在植物体中引入和表达重组核酸分子而开发具有改良的性质或性状的作物的手段。
发明内容
在一个方面，本发明提供一种转基因植物，其属于禾本科、葫芦科、十字花科、茄科、豆科或夹竹桃科，其中该植物含有内源Ss2-ODD1DNA序列，与野生型对照植物相比该序列的表达被降低。在另一种实施方式中，该植物属于禾本科。在又一种实施方式中，该转基因植物是甘蔗、高粱、玉米和芒属植物（Miscanthus）。在另一种实施方式中，Ss2-ODD1DNA序列的表达通过反义抑制、正义共抑制、RNA干扰或RNA酶被降低。
在另一方面，本发明提供一种生产蔗糖的方法，其包括：（a）提供一种具有被抑制的Ss2-ODD1蛋白质水平的转基因植物；和（b）从所述植物获得蔗糖。在一个实施方式中，所述植物是甘蔗或高粱。
在另一方面，本发明提供一种生产生物量的方法，其包括：（a）提供一种具有被抑制的Ss2-ODD1蛋白质水平的转基因植物；和（b）从所述植物获得生物量。在一个实施方式中，所述植物是甘蔗或高粱。
在另一方面，本发明提供一种在植物中提高蔗糖产量的方法，其包括：抑制所述植物中的Ss2-ODD1蛋白质水平。在一个实施方式中，所述植物是甘蔗或高粱。
在另一方面，本发明提供一种在植物中提高生物量的方法，其包括：在所述植物中抑制Ss2-ODD1蛋白质水平。在一个实施方式中，该植物是甘蔗或高粱。
在另一方面，本发明提供包含Ss2-ODD1序列的核苷酸构建体。在另外的实施方式中，本发明提供包含核酸构建体的转基因植物或细胞，所述构建体包含Ss2-ODD1序列。
附图说明
图1显示在Ss2-ODD1、其来自水稻（Oryza sativa）、高粱（Sorghumbicolor）和玉米（Zea may）的近缘同系物以及植物亚铁依赖性双加氧酶中的功能氨基酸残基（按出现的顺序分别为SEQ ID NOS11-61）的保守性。残基的编号基于来自北蹉峨链霉菌（Streptomyces jumonjinensis）的异青霉素N合酶（IPNS）蛋白质。比对显示保守残基（下划线表示）包括铁结合模体His-X-Asp(53-57)X-His（阴影表示），该模体是非血红素Fe(II)依赖性双加氧酶共有的（Kreisberg-Zakarin等，Antonie Van Leeuwenhoek75:33-39,1999）。这些保守残基被认为是在活性位点中铁结合所需要的（Borovok等,Biochemistry35:1981-1987,1996）。Ss，甘蔗种（Saccharum species）；Sb，高粱；Tsm，玉米；ORYSA，水稻；ARATH，拟南芥；CUCMA，南瓜；STRJU，北蹉峨链霉菌；PETHY,矮牵牛（Petunia hybrida）；GARPE，矮牵牛（gardenpetunia）；2-ODD1，2-酮酸依赖性双加氧酶；GA2，赤霉素2β-羟化酶；GA20，赤霉素20-氧化酶；GA3，赤霉素3β-羟化酶；GA7，赤霉素7-氧化酶；A2，A2基因；LDOX，五色花色素双加氧酶；FLS，黄酮醇合酶；FL3H，黄烷酮3β-羟化酶；2A6，2A6基因。
图2显示高等植物2-ODD的系统发生分析。使用BLOSUM矩阵、利用Clustal算法比对主要类型2-ODD的高等植物代表的氨基酸序列。通过Neighbor-Joining法（NJ）在MEGA3.1版（Kumar等,Brief Bioinform.5:150-163,2004）中获得了系统发生重建，其中利用自引程序（1000次重取样）评估系统树的节点的强壮性。图中显示了大于50的自展值。在序列名称后提供有GenBank gi号或TIGR TC号。Ss2-ODD1被用方框框住。图中显示了具有拟南芥（GA5,GA4)、水稻（D18,SEMIDWARF1）和豌豆（SLENDER）的相应特征化的赤霉酸氧化酶突变体的蛋白质。物种名称和蛋白质名称缩写如下：At，拟南芥；Cm，南瓜；Cr，芥菜；Cro，长春花；Hv，大麦；Hn，天仙子；Le，番茄；Mm,Marah macrocarpus；Ms，苜蓿；Mt，截形苜蓿；Nt，烟草；Os，水稻；Ps，豌豆；Pt，矮牵牛（Petunia x hybrida）；St，马铃薯；Sb，高粱；Ss，甘蔗种；Zm，玉米。A2，由A2基因座编码的蛋白质，A2基因座影响花色素苷生物合成；ACCO，1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶；ANS，花色素合酶；CFI，查耳酮-黄烷酮异构酶；DV4H，去乙酸基文朵灵（desacetoxyvindoline）4-羟化酶；E8，1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶同系物（蛋白质E8）；F3H，黄烷酮-3-羟化酶；FLS，黄酮醇合酶；GAoxi，赤酶酸氧化酶；H6H，莨菪碱6-双加氧酶；IDS2，缺铁特异性-2（iron deficiency specific-2）；LDOX，无色花色素双加氧酶；P4H,脯氨酰4-羟化酶；SRGl，在生长停滞的拟南芥细胞中表达的编码转录体。
图3显示UBI-1::Ss2-ODD1as::NOS盒和UBI-1::Bar::NOS盒的示意图。图中显示了内切核酸酶（EarI和HindIII）被用来从原始克隆载体中释放所述盒。
图4显示被选择的UBI-1::Ss2-ODD1as::NOS株系（event）和非转基因对照栽培种RB835486的高度。在除去秆顶部后，对于每个样品（n=12）测量两个茎的高度。双星表示株系与栽培种RB835486非转基因对照（C）有显著区别（通过Dunnett法以99%的置信度测定）。误差棒（error bar）表示平均值的标准偏差。
图5显示被选择的UBI-1::Ss2-ODD1as::NOS株系和非转基因对照栽培种RB835486的节间数。在除去顶部后，对于每个样品（n=12）测量两个茎的节间数。双星表示株系与栽培种RB835486非转基因对照（C）有显著区别（通过Dunnett法以99%的置信度测定）。误差棒表示平均值的标准偏差。
图6显示被选择的UBI-1::Ss2-ODD1as::NOS株系和非转基因对照栽培种RB835486的平均节间长度。在除去顶部后，对于每个样品（n=12）测量两个茎的所有节间的长度。双星表示株系与栽培种RB835486非转基因对照（C）有显著区别（通过Dunnett法以99%的置信度测定）。误差棒表示平均值的标准偏差。
图7显示被选择的UBI-1::Ss2-ODD1as::NOS株系和非转基因对照栽培种RB835486的平均节间直径。在除去顶部后，对于每个样品（n=12）测量两个茎的节间直径。双星表示株系与栽培种RB835486非转基因对照（C）有显著区别（通过Dunnett法以99%的置信度测定）。误差棒表示平均值的标准偏差。
图8显示被选择的UBI-1::Ss2-ODD1as::NOS株系和非转基因对照栽培种RB835486的茎鲜重。在除去顶部后，对于每个样品（n=12）测量两个混合的（combined）茎的鲜重。双星表示株系与栽培种RB835486非转基因对照（C）有显著区别（通过Dunnett法以99%的置信度测定）。误差棒表示平均值的标准偏差。
图9显示被选择的UBI-1::Ss2-ODD1as::NOS株系和非转基因对照栽培种RB835486的汁液体积。在除去顶部后，对于每个样品（n=12）测量从两个混合的茎中提取的汁液体积。双星表示株系与栽培种RB835486非转基因对照（C）有显著区别（通过Dunnett法以99%的置信度测定）。误差棒表示平均值的标准偏差。
图10显示被选择的UBI-1::Ss2-ODD1as::NOS株系和非转基因对照栽培种RB835486的POL。在除去顶部后，对于每个样品（n=12）测量从两个混合的茎提取的汁液的POL。双星表示株系与栽培种RB835486非转基因对照（C）有显著区别（通过Dunnett法以99%的置信度测定）。误差棒表示平均值的标准偏差。
图11显示被选择的UBI-1::Ss2-ODD1as::NOS株系和非转基因对照栽培种RB835486的蔗糖产量。蔗糖产量被计算为：在除去顶部后，来自每个样品（n=12）的两个混合的茎的总汁液体积与其蔗糖浓度的积。双星表示株系与栽培种RB835486非转基因对照（C）有显著区别（通过Dunnett法以99%的置信度测定）。误差棒表示平均值的标准偏差。
图12显示被选择的UBI-1::Ss2-ODD1as::NOS株系和非转基因对照栽培种RB835486的甘蔗渣鲜重。在除去顶部后，对于每个样品（n=12）测量两个混合的茎的甘蔗渣鲜重。双星表示株系与栽培种RB835486非转基因对照（C）有显著区别（通过Dunnett法以99%的置信度测定）。误差棒表示平均值的标准偏差。
图13显示通过定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）测量在野生型甘蔗器官中Ss2-ODD1转录体的表达。使用从野生型甘蔗植物（栽培种RB835486）的不同器官中分离的RNA来进行定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）。Ss2-ODD1转录体相对于ACTIN（ACT）的转录体的多度以ΔCT值表示。棒显示来自三个独立的重复实验的平均值。误差棒表示平均值的标准偏差。
图14显示在被选择的UBI-1::Ss2-ODD1as::NOS株系和野生型甘蔗栽培种RB835486对照的+4叶中的Ss2-ODD1蛋白质水平。由从栽培种RB835486野生型植物（C）和株系09、14和21获取的+4叶片来制备提取物。叶蛋白质提取物（50μg）连同0.5ng的重组Ss2-ODD1（rSs2-ODDl）一起通过SDS-PAGE被分离。使用Ss2-ODD1亲和纯化的抗体进行免疫印迹法（上方图片）。箭头表示Ss2-ODD1蛋白。星号表示叶提取物中的非特异性交叉反应多肽（显示为加样对照）。分子量显示在右边（MW），以kDa表示。在转移后用考马斯蓝染色的凝胶被显示为加样对照（下侧图片）。
具体实施方式
本发明涉及用于植物原位（in planta）操作双加氧酶从而改良植物构型并提高植物生物量和/或蔗糖产量的方法和构建体（construct）。双加氧酶是含铁非血红素酶，其参与许多化合物的生物合成，包括青霉素生物合成、头孢菌素生物合成、头霉素生物合成、棒烷生物合成、肉碱生物合成和胶原生物合成（Prescott和Lloyd,Nat.Prod.Rep.,17:367-383,2000）。另外，某些双加氧酶长期以来被描述为氧化在各种蛋白质靶标中的多个氨基酸残基，以便于蛋白质折叠。对氨基酸氧化进行改变使得可以使用调控机制和结构机制(Ozer和Bruick,Nat.Chem.Biol.,3:144-153,2007)。特别是在植物中，各种双加氧酶在信号化合物（例如脱落酸、赤霉素和乙烯）和次生代谢物（特别是类黄酮和生物碱）的生物合成中发挥极其重要的作用。对双加氧酶催化的反应的研究已在多篇文章和其中的引用文献中给出（Prescott和John,Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.,47:245-271,1996；Prescott和Lloyd,Nat.Prod.Rep.,17:367-383,2000；Turnbull等,J.Biol.Chem.,279:1206-1216,2004；Ozer和Bruick,Nat.Chem.Biol.,3:144-153,2007)。
植物双加氧酶分为两类：脂加氧酶和催化羟化反应、环氧化反应和去饱和反应的2-酮戊二酸依赖性双加氧酶(2-oxoglutarate-dependent dioxygenases,2-ODD)。后者的成员常常在生物合成途径中以连续步骤催化不止一种反应类型。2-ODD族的酶一定需要2-酮戊二酸作为共底物。所有的2-ODD都是可溶性酶，它们在体外需要Fe2+和抗坏血酸以实现最佳的底物转化。某些酶一定需要抗坏血酸，但许多并不需要。通常，抗坏血酸的作用是不确定的，并且很可能与反应机制无直接联系且无关。
2-ODD的序列的特点是保守残基主要聚集在蛋白质的羧基端部分。微生物2-ODD—异青霉素N合酶的三维结构已经公开（IPNS；Kreisberg-Zakarin等,Antonie van Leeuwenhoek,75:33-39,1999)。虽然与植物2-ODD相比IPNS表现出相对低的序列同一性，但它共有许多保守残基/模体和结构元件，并且已被提议作为植物2-ODD结构的模型。该结构表明INPS的催化核心由双链β-螺旋（DSBH）折叠构成，该折叠含有HX[DE]二联体（其中X是任何氨基酸）和保守的羧基端组氨酸，它们共同螯合单个铁原子（Kreisberg-Zakarin等,Antonie van Leeuwenhoek,75:33-39,1999)。2-ODD超家族蛋白质的保守部分包含被排布在薄卷饼型拓扑结构的两个薄片中的核心DSBH，在酶中该拓扑结构是一种比较罕见的结构，其更普遍见于病毒壳体蛋白中。
分析比对（alignment），以比较一大群非血红素铁(II)-依赖性双加氧酶的一级氨基酸序列，这些双加氧酶都激活分子氧并且进行不同的反应，例如脂族羟化、去饱和和环化（Kreisberg-Zakarin等,Antonie van Leeuwenhoek,15:33-39,1999）。对这类酶的约52个成员的序列分析确定出仅有5个残基始终是保守的—Gly41、His212、Asp214、His268和Arg277（根据S.jumonjinensisIPNS（Borovok等,Biochemistry,35:1981-1987,1996）编号）。生化分析揭示，His212、Asp214和His268突变的酶在体外没有活性（Tan和Sim,J.Biol.Chem.,271:889-894,1996；Loke等,FEMS Microbiol.Lett.,157:137-140,1997)，这暗示两个保守的组氨酸和天冬氨酸对IPNS的活性是必须的。包含139个非冗余（non-redundant）非血红素铁(II)依赖性双加氧酶的更广泛的分析揭示两个保守的组氨酸和天冬氨酸以及甘氨酸是完全保守的（Kreisberg-Zakarin等,Antonie van Leeuwenhoek,75:33-39,1999)。该分析被用来界定所有非血红素铁(II)依赖性双加氧酶共同的序列模体—His-X-Asp(53-57)X-His，该序列模体被认为是在活性位点铁结合所需要的(Borovo等,Biochemistry,35:1981-1987,1996)。迄今没有任何作用归因于Gly41。
与此背景相反，本发明描述了一种通过下调双加氧酶编码基因来改良植物构型并提高植物生物量和/或蔗糖产量的方法。
在本说明书中使用的所有技术术语是生物化学领域、分子生物学领域、免疫学领域和农学领域中常用的；因此，它们易于被本发明所属领域的技术人员理解。这些技术术语可在以下文献中找到，例如：MOLECULARCLONING:A LABORATORY MANUAL,第3版,第1-3卷，Sambrook和Russel编著,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,2001；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,Ausubel等编著,Greene Publishing Associates和Wiley-Interscience,New York,1988（定期更新）；SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY:A COMPENDIUMOF METHODS FROM CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY,第5版,第1-2卷,Ausubel等编著,John Wiley&Sons,Inc.,2002；GENOME ANALYSIS:A LABORATORY MANUAL,第1-2卷,Green等编著,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1997；Harlow和Lane(ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL),Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1988）。本文描述了涉及植物生物技术的方法，该方法在例如METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY:A LABORATORY COURSE MANUAL,Maliga等编著,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1995的论文中有详细描述。各种应用PCR的技术在例如Innis等，PCR PROTOCOLS:A GUIDE TO METHODSAND APPLICATIONS,Academic Press,San Diego,1990以及Dieffenbach和Dveksler,PCR PRIMER:A LABORATORY MANUAL,第2版,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,2003中有描述。PCR引物对可以通过已知技术从已知序列中得到，例如使用用于该目的的计算机程序，例如Primer,第0.5版,1991,Whitehead Institute for Biomedical Research,Cambridge,MA。核酸的化学合成方法在例如Beaucage＆Caruthers，Tetra.Letts.22:1859-1862(1981)以及Matteucci&Caruthers,J.Am.Chem.Soc.103:3185(1981)中已讨论。
除非另有说明，限制性酶切、磷酸化、连接和转化如在Sambroo等,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,第2版(1989),ColdSpring Harbor Laboratory Press中描述的那样进行。除非另有说明，所有用于细菌细胞生长和维持的试剂和材料都从Aldrich Chemicals(Milwaukee,WI)、DIFCO Laboratories(Detroit,MI)、Invitrogen(Gaithersburg,MD)或SigmaChemical Company(St.Louis,MO)获得。
术语“编码（encoding）”和“编码（coding）”是指多核苷酸通过转录机制和翻译机制为细胞提供信息的过程，通过该过程一系列氨基酸可被组装成为特定的多肽。由于遗传密码的简并性，DNA序列中的某些碱基变化并不改变蛋白质的氨基酸序列。
术语“表达”表示由多核苷酸编码的多肽的产生。可选地或此外，“表达”表示由编码DNA分子（例如结构基因）经历以产生多肽的细胞内过程的结合，包括转录和翻译。“下调”和“抑制”具有相同的含义，用来表明在细胞或植物中特定基因序列的表达相对于对照细胞或植物已被降低。
关于多核苷酸的短语“改变的表达”表明在例如转基因植物或植物组织中的表达图式不同于在相同物种的野生型植物中的表达图式。因此，所感兴趣的多核苷酸在不同于野生型植物中序列表达所在细胞或组织类型的细胞或组织类型中表达，或者在不同于序列在野生型植物中的表达时间的时间表达，或者通过对不同诱导剂（例如激素或环境信号）的响应而表达，或者相比于野生型植物中发现的表达水平以不同的表达水平表达。所产生的表达图式可以是短暂的或稳定的、组成性的或可诱导的。关于多核苷酸，“改变的表达”可进一步涉及改变的活性水平，其由改变的蛋白质水平引起，或由多肽与外源或内源调质的相互作用引起，或由与因子间的相互作用引起，或由多肽的化学修饰引起。
术语“外源核酸”和“异源核酸”可互换使用，并且是指通过人的努力而被引入到细胞（或祖细胞）中的核酸、DNA或RNA。这种外源核酸可以是被引入序列的细胞中天然存在的序列的拷贝或其片段。
相反，术语“内源核酸”是指存在于将被基因工程化的植物或生物体中的核酸、基因、多核苷酸、DNA、RNA、mRNA或cDNA分子。内源序列对于将被基因工程化的植物或生物体来说是“天然的”，即，是固有的。
词语“同源序列”是指由于共同的祖先和序列保守性而相似的多核苷酸或多肽序列。同源序列可能是“直系同源的”（如果它们由于物种形成事件而隔离）或“旁系同源的”（如果它们由于基因复制事件而隔离）。
词语“功能同系物”是指由于共同的祖先和序列保守性而相似并且在催化水平、细胞水平或生物体水平具有相同或相似功能的多核苷酸或多肽序列。
双加氧酶序列
双加氧酶编码基因已在几种植物科中被识别，例如禾本科成员（如甘蔗和高粱）。根据本发明提供的内容，如上所述，可使用2-酮戊二酸依赖性双加氧酶（2-ODD）序列来改良植物构型和提高生物量和/或蔗糖产量。
在本发明中，“Ss-2ODD1”是指一种植物酶，其降低的蛋白质水平和/或活性导致产生具有改良植物构型和提高的生物量和/或蔗糖产量的植物。在本发明中，“Ss-2ODD1”是指一种植物酶，其降低的蛋白质水平和/或活性抑制导致改良的植物构型和增加的蔗糖和/或生物量，并且该酶具备可能催化至少一种下列反应的双加氧酶活性：
（a）分子氧的激活和底物转化的催化，包括羟化、去饱和、环化和环氧化，其需要或不需要2-酮戊二酸作为共底物；
（b）生物分子（代谢物和大分子）的氧化，其需要或不需要抗坏血酸作为辅因子；
（c）来自有机（代谢物和大分子）底物的O2的氧结合（oxygenincorporation）的催化；
（d）植物信号化合物（例如脱落酸、赤霉素和乙烯）的生物合成或降解；和
（e）次生代谢物（特别是类黄酮和生物碱）的生物合成或降解。
本发明的多核苷酸编码的多肽的特征是，与2-酮戊二酸依赖性双加氧酶（2-ODD）多肽具有高度序列同一性。虽然示例性的2-ODD序列来源于禾本科，例如甘蔗属2-ODD（Ss2-ODD1），但来自其他植物科的功能同系物可被用来生产具有改良的植物构型，以及增加的生物量和/或提高的蔗糖产量的植物。如图2所示，2-ODD序列已在几个植物科中被识别：禾本科（例如，甘蔗和高粱）、葫芦科（例如，南瓜和笋瓜）、十字花科（例如，拟南芥）、茄科（例如，烟草和番茄）、豆科（例如，豌豆）和夹竹桃科（例如，长春花）等等。预期来自其他植物科的植物2-ODD基因催化受Ss2-ODD1酶（SEQID NO:2）影响的相同反应，该Ss2-ODD1酶例证性地由SEQ ID NO:1编码；因此，该基因的降低的表达应导致上述表型，该表型由以下实施例中描述的植物说明。
而且，在禾本科甚至整个双子叶植物物种和单子叶植物物种中，共同的遗传机制控制植物性构型（vegetative architecture）。例如，参见Doust，Ann.Bot，100:941-50，2007和其中引用的出版物。因此，根据本发明，不同科的控制植物构型和生物量积聚的功能同系物的识别和分离，应该允许在大范围的植物中改良这些特性。
通过序列对比，可识别额外的2-ODD序列并对其进行功能注释。因此，技术人员可在合适的数据库（例如GenBank）中利用可公开获得的序列分析程序和参数轻易识别功能上相关的Ss2-ODD1序列。被初步识别为2-ODD的序列可被进一步表征，从而识别包含特异性序列串（与存在于已知双加氧酶家族中的序列模体一致）的序列。作为选择，筛选cDNA文库或基因组文库，使用合适的杂交探针和条件，应导致功能上相关Ss2-ODD1序列的识别。本领域也理解，具有降低水平的同一性的序列也可通过（简并的）寡核苷酸和基于PCR的方法的帮助而被分离。
因此，通过上述技术，序列可被识别并被功能标注为属于Ss2-ODD1家族。相似地，本说明书中的“Ss2-ODD1DNA序列”是指具有能够在严格或高度严格的条件下与SEQ ID NO:1中的序列杂交的核苷酸序列的任何核酸分子，“Ss2-ODD1 DNA序列”编码上述Ss2-ODD1酶。该术语表示的范围还包括与SEQ ID NO:1交叉杂交的序列，其优选与SEQ ID NO:1中所示的Ss2-ODD1核苷酸序列具有至少40％，优选至少60％，特别优选至少80％且尤其优选至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%的同一性。本发明的核苷酸序列可编码与SEQ ID NO:2中的预期基因产物同源的蛋白质。
此处短语“严格的条件”包含本领域熟知的参数。单链多核苷酸在基于各种充分表征的生化作用力联合在一起时杂交，所述生化作用力例如氢键键合、溶剂排斥（solvent exclusion）和碱基堆积。杂交的严格性反映了相关核酸的序列同一性的程度，因而严格性越高，两个多核苷酸链越相似。严格性受多种因素影响，包括存在于杂交液和洗液以及培育（和计数器（number）中的温度、盐浓度和成分、有机添加剂和无机添加剂、溶剂等。
对于在Southern或Northern杂交的过滤器上的互补核酸（具有多于10个互补残基）的杂交，“严格的”杂交条件的例子为：在确定的离子强度和pH时，比特异性序列的热解链点（thermal melting point,Tm）低约5℃至20℃的温度。Tm是指这样的温度，即在确定的离子强度和pH下，在该温度50%的靶标序列杂交至完全匹配的探针。在严格的条件下杂交的核酸分子通常将以整个cDNA或选定部分杂交至探针。更优选地，此处“严格的条件”是指本领域熟知的参数，例如在3.5×SSC、1×Denhardt's溶液、25mM磷酸钠缓冲液（pH7.0）、0.5%SDS和2mM EDTA中以65℃杂交18个小时，其后在2×SSC和0.1%SDS中洗涤（以65℃洗涤20分钟）过滤器4次，并且在0.5×SSC和0.1%SDS中（或者对于更高的严格性，在0.3×SSC和0.1%SDS中；对于还更高的严格性，在0.1×SSC和0.1%SDS中）最后洗涤至多20分钟。其他条件可被替代，只要严格性的程度与本文提供的（使用0.5×SSC最后洗涤相等。对于较不密切相关的同系物的识别，洗涤可在较低温度下进行，例如50℃。通常，通过升高洗涤温度和/或降低SSC的浓度来增加严格性。
本发明提供包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列的核酸分子，其编码SEQID NO:2中的氨基酸序列。要理解的是，本发明的蛋白质包括不改变酶的功能的氨基酸替代、添加和删除。例如，引入到本发明的序列的替代、删除和插入也被包括在本发明内。这种序列修饰可通过定点突变或其他本领域中已知的方法设计到序列中。氨基酸替代通常是单个残基替代；插入经常是约从1到10个氨基酸残基的插入；且删除将是约从1到30个残基的删除。在优选实施方式中，删除或插入是以相邻残基对的形式进行，例如两个残基的删除或两个残基的插入。替代、删除、插入或它们的任何组合可被结合以获得特定序列。在编码ODD1多肽（例如Ss2-ODD1）的多核苷酸中发生的突变不应将序列设置在阅读框之外并且不应形成可能产生二级mRNA结构的互补区域。优选地，由DNA编码的多肽执行所需的功能。
与所列出的序列同源的双加氧酶序列通常将共享至少约40%的氨基酸序列同一性。更密切相关的双加氧酶氨基酸序列与所列出的序列共享至少约50%、约60%、约65%、约70%、约75%或约80%或约90%或约95%、96%97%、98%或甚至99.9%的氨基酸序列同一性。在核苷酸水平，所述序列通常与一个或多个所列出的序列共享至少约40%的核苷酸序列同一性，优选至少约50%、约60%、约70%或约80%的序列同一性，更优选约85%、约90%、约95%、约97%或更高的序列同一性。遗传密码的简并性使得多核苷酸的核苷酸序列的主要变化成为可能，同时保持被编码蛋白质的氨基酸序列。
因此，本发明包括从植物中分离出来的、编码2-ODD多肽且它的抑制改良植物构型并增加植物生物量和/或蔗糖产量的任何核酸、基因、多核苷酸、DNA、RNA、mRNA或cDNA分子。DNA或RNA可以是双链的或单链的。单链DNA可以是编码链，也称为正义链，或它可以是非编码链，也称为反义链。
本领域技术人员将容易地理解的是，多种多核苷酸序列的任何一个都能够编码2-ODD多肽。由于遗传密码的简并性，除了在序列表中列举的那些序列以外，许多不同的多核苷酸也可编码相同和/或基本相似的多肽。
术语“变体”是偏离于标准的（或给定的）特定基因或蛋白质的核苷酸或氨基酸序列的核苷酸或氨基酸序列。变体可具有“保守的”变化，其中替代的氨基酸具有相似的结构或化学性质，例如以异亮氨酸替代亮氨酸。变体可具有“非保守的”变化，例如以色氨酸替代甘氨酸。类似的小的变化还可包括氨基酸删除或插入或两者兼有之。确定哪些氨基酸残基可被替代、插入或删除中的指引可使用本领域熟知的计算机程序找到，例如Vector NTI Suite（InforMax,MD）软件。“变体”还可指例如在美国专利第6,506,603号、第6,132,970号、第6,165,793号和第6,117,679号中描述的“改组基因（shuffledgene）”。
被考虑的还有片段和结构域（本文称为寡核苷酸），其在至少严格或高度严格的条件下杂交至上述多核苷酸序列。寡核苷酸被用作引物、探针等等。适合用作探针、引物、正义剂和反义剂（sense and antisense agents）的寡核苷酸的长度为至少约15个核苷酸，更多的时候为至少约18个核苷酸，通常为至少约21个核苷酸，常常长度为至少约30个核苷酸，或约40个核苷酸，或更长。核酸探针在杂交方案（包括微列阵实验的方案）中是有用的，例如用来识别本发明的额外的多肽同系物。引物可通过核苷酸杂交而退火至互补的靶DNA链，以在引物和靶DNA链之间形成杂交，然后通过DNA聚合酶沿靶DNA链延伸。引物对可例如通过聚合酶链反应（PCR）或其他核酸扩增方法而用于核酸序列的扩增。
关于多肽的术语“片段”或“结构域”是指多肽的亚序列。在某些情况下，片段或结构域是以与完整多肽基本相同的方式或相似的程度完成完整多肽的至少一种生物学功能的多肽的亚序列。例如，多肽片段可包含可识别的结构模体或功能域，例如结合至DNA启动子区域的DNA结合域、激活域或用于蛋白质-蛋白质相互作用的结构域。片段的大小可在少如6个氨基酸到多肽的全长之间变化，但是优选长度为至少约30个氨基酸，且更优选长度为至少约60个氨基酸。
如本文所使用的，“Ss2-ODD1DNA序列”被理解为意指Ss2-ODD1基因包括SEQ ID NO:1中的序列，以及由SEQ ID NO:1的变体组成的核酸分子，其中有一个或多个碱基被删除、替代、插入或添加，该变体编码具有至少40％氨基酸序列同一性的多肽。因此，具有“有一个或多个碱基被删除、替代、插入或添加的碱基序列”的序列，即使当被编码的氨基酸序列有一个或多个氨基酸被替代、删除、插入或添加时也保持生理活性。此外，可能存在多种形式的Ss2-ODD1酶，这可能归因于多肽的翻译后修饰或Ss2-ODD1基因的多种形式。具有这种修饰的核苷酸序列和编码双加氧酶的核苷酸序列被包括在本发明的范围内。
例如，多聚A尾巴或5'端或3'端非翻译区可被删除，并且碱基可被删除至氨基酸被删除的程度。碱基还可被替代，只要不导致读框移位。碱基还可被“添加”至氨基酸被添加的程度。但是，任何这种修饰必须不导致双加氧酶活性的丧失。本文中的被修饰的DNA可通过修饰本发明的DNA碱基序列使得在特异性位点上的氨基酸通过位点特异性突变被替代、删除、插入或添加而获得，例如，Zoller&Smith,Nucleic Acid Res.10:6487-500,1982。
除非另有说明，本文中通过DNA分子测序测定的所有核苷酸序列都是通过自动DNA测序仪测定的，例如来自Applied Biosystems公司的Model373。因此，如本领域对于由此自动方法测定的任何DNA序列所已知的，本文中测定的任何核苷酸序列可能含有某些错误。通过自动操作测定的核苷酸序列通常与被测序的DNA分子的实际核苷酸序列至少约95％相同，更典型地，至少约96％到至少约99.9％相同。实际序列可通过其他方法被更加精确的测定，包括本领域熟知的手动DNA测序方法。还如本领域所熟知的，与实际序列相比，在测定的核苷酸序列中单个插入或删除将导致在核苷酸序列的翻译中的读框移位，使得由测定的核苷酸序列编码的预期氨基酸序列从这个插入或删除的位点开始可能完全不同于真正由被测序的DNA分子编码的氨基酸序列。
核酸构建体
本发明包括含本文的一个或多个核酸序列的重组构建体。构建体通常包含已以正向或反向插入有核酸序列的载体，例如质粒、黏粒、噬菌体、病毒（例如植物病毒）、细菌人工染色体（BAC）、酵母人工染色体（YAC）或类似物。在优选的实施方式中，构建体进一步包含调节序列，包括例如可操作地连接至该序列的启动子。大量合适的载体和启动子是已知的且可购买得到。
可使用标准技术制备重组核酸构建体。例如，用于转录的核苷酸序列可通过用限制酶处理含有所述序列的载体以切除适当片段而获得。用于转录的核苷酸序列还可通过退火和连接合成寡核苷酸而产生，或通过在聚合酶链反应（PCR）中使用合成寡核苷酸以在每个末端提供合适的限制位点而产生。核苷酸序列随后被克隆进含有合适调节元件的载体，所述调节元件例如上游启动子序列和下游终止子序列。
通常，植物转化载体包括在5'和3'调节序列的转录控制下的一个或多个被克隆的植物编码序列（基因组或cDNA）和选择标记。这种植物转化载体通常还含有启动子（例如，控制诱导型或组成性表达、环境调节性或发育调节性表达、或细胞特异性或组织特异性表达的调节区）、转录起始位点，RNA加工信号（例如，内含子剪接位点）、转录终止位点和/或多腺苷酸化信号。
可用于表达本发明的ODD1序列的合适的组成性植物启动子包括但不限于：花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子和玉米多聚遍在蛋白启动子，它们在大多数植物组织中提供组成性的高水平表达（参见，例如，美国专利第5,510,474号；Odell等，Nature313：810-812，1985）；胭脂碱合酶启动子（An等，Plant Physiol.88：547-552，1988）；和章鱼碱合酶启动子（Fromm等，Plant Cell1:977-984，1989）；以及组织特异性启动子、组织偏爱性（tissue-preferred）启动子、细胞类型特异性启动子和诱导型启动子。例如，在甘蔗中，在叶中产生的蔗糖累积在“节间”（指茎轴在两个节点之间的部分），使用节间特异性启动子可能是有利的。
载体还可含有终止序列，其位于本发明的核酸分子的下游，使得终止mRNA的转录并加入多聚A序列。示例性的终止子有花椰菜花叶病毒（CaMV）35S终止子和胭脂碱合酶基因（NOS）终止子。
表达载体还可含有选择标记，通过此标记转化的细胞可在培养基中被识别。标记可与异源核酸分子（即，可操作地连接至启动子的基因）联合。如本文所使用的，术语“标记”是指编码性状或表型的基因，该性状或表型使得可以选择或筛选含有该标记的植物或细胞。例如在植物中，该标记基因将编码抗菌素或除草剂抗性。这使得可从未被转化或未被转染的细胞中选择出被转化的细胞。
合适的选择标记的例子包括腺苷脱氨酶、二氢叶酸还原酶、潮霉素B磷酸转移酶、胸苷激酶、黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、草甘膦和草丁膦（glufosinate）抗性以及氨基糖苷3'-O-磷酸转移酶（卡那霉素、新霉素和G418抗性）。这些标记可包括对G418、潮霉素、博来霉素、卡那霉素和庆大霉素的抗性。构建体还可含有选择标记基因Bar，其提供对除草剂膦丝菌素类似物（如草铵膦（ammonium gluphosinate））的抗性。Thompson等,EMBO J.6：2519-23（1987）。其他合适的选择标记也是已知的。
可使用可见标记，例如绿色荧光蛋白（GFP）。基于细胞分裂的控制来识别或选择已被转化的植物的方法也已有描述。参见John和Van Mellaert，WO2000/052168，以及Fabijansk等，WO2001/059086。
也可包括来源于细菌或病毒的复制序列（replication sequence），以允许载体在细菌或噬菌体宿主中被克隆。优选地，使用广宿主域原核复制起点。可包括细菌选择标记，以允许选择含有所需构建体的细菌细胞。合适的原核选择标记还包括对抗生素（例如卡那霉素或四环素）的抗性。
如本领域已知的，其他编码另外功能的核酸序列也可存在于载体中。例如，当农杆菌属是宿主时，可包括T-DNA序列以便后续转移至植物染色体和参入植物染色体。
改变多核苷酸序列的表达和多肽序列的方法
在本发明的一个方面，植物生物量和/或蔗糖产量通过下调本发明的多核苷酸序列的表达而被提高。转录后基因沉默（PTGS）的各种方法在本领域是熟知的，并且可被用于本发明中。
例如，本发明的序列在转基因植物中的表达的降低或消除（即，“敲除”）（例如，以改良植物性状），可通过以cDNA形式引入与感兴趣的多肽对应的反义构建体来实现。对于反义抑制，多核苷酸序列或同系物cDNA相对于表达载体上的启动子序列以相反方向排列（就编码序列而言）。被引入的序列不必是全长cDNA或基因，且不必与在将被转化的株型中发现的cDNA或基因相同。通常，反义序列可与天然信使RNA的任何连续序列互补，即，它可与接近5'端或加帽位点、加帽位点的下游、加帽位点和起始密码子之间的内源mRNA序列互补，并且它可覆盖全部或仅一部分非编码区、可桥接非编码和编码区、与全部或仅一部分非编码区互补、与编码区的3'端互补或与mRNA的3'未翻译区互补。
特定反义序列和反义序列的长度会不同，例如，取决于所期望的抑制程度和反义序列的稳定性。因此，当引入的序列长度较短时，将需要与内源Ss2-ODD1序列有较高程度的同一性以实现有效的反义抑制。虽然各种长度的反义序列都可被使用，但优选地，载体中引入的反义序列的长度将是从至少13个至约15个核苷酸、至少16个至约21个核苷酸、至少约20个核苷酸、至少约30个核苷酸、至少约50个核苷酸、至少约75个核苷酸、至少约100个核苷酸、至少约125个核苷酸、至少约150个核苷酸、至少约200个核苷酸，或甚至是将被下调的序列的整个长度。此外，序列可在其3'端或5'端被延长或缩短。通常可利用的技术和本说明书中提供的信息可指导适当的Ss2-ODDl编码反义序列的选择。参考本文的SEQ ID NO:1，本发明的寡核苷酸可以是Ss2-ODD1cDNA序列反义方向上的连续片段，其具有当被转化进入受体植物细胞时足以实现所需效果的任何长度。
本发明考虑了Ss2-ODD1编码序列的正义共抑制。在实施本发明中使用的正义多核苷酸具有的长度使得当在植物细胞中表达时，足以抑制植物Ss2-ODD1蛋白在那种植物细胞中的天然表达。这种正义多核苷酸本质上可能是编码Ss2-ODD1酶的整个基因组核酸或互补核酸，或其片段，这种片段的长度通常为至少15个核苷酸。通常可得到确定导致天然基因在细胞中的表达抑制的正义DNA的长度的技术。
在本发明的另一实施方式中，用含有编码RNA酶分子（“核酶”）的多核苷酸区段的核酸构建体转化植物细胞，如此文所述，该RNA酶分子作用于（即，切割）编码Ss2-ODD1的DNA的mRNA转录体。核酶含有结合至靶mRNA的可及区域的底物结合域和催化RNA裂解的结构域，阻止了翻译和蛋白生成。该结合域可包含与靶mRNA序列互补的反义序列；催化模体可以是锤头状模体或其他模体，例如发夹型模体。
可首先通过扫描靶分子以确定核酶切割位点（例如GUA序列、GUU序列或GUC序列）而识别RNA靶标内的核酶切割位点。一旦被识别，就可评价对应于含有切割位点的靶基因区域并具有15、20、30或更多核糖核苷酸的短RNA序列的预期结构特征。
候选靶标的适合性也可通过测试它们对与互补寡核苷酸杂交的可及性来评价（如本领域已知的，使用核糖核酸酶保护试验进行测试）。编码RNA酶分子的DNA可依据已知的技术制备。例如，参见美国专利第4,987,071号、第5,559,021号、第5,589,367号、第5,583,032号、第5,580,967号、第5,595,877号、第5,591,601号和第5,622,854号。
这种RNA酶分子在植物细胞中的产生和Ss2-ODD1蛋白质生成的破坏，本质上以与反义RNA分子的产生相同的方式降低了植物细胞中的蛋白质活性；即，通过破坏mRNA在产生酶的细胞中的翻译来降低蛋白质活性。术语“核酶”描述了用作酶的、含RNA的核酸，例如内切核糖核酸酶，并且该术语可与“RNA酶分子”互换使用。
本发明进一步包括编码核酶的核酸、编码核酶并已被插入到表达载体中的核酸、含有这种载体的宿主细胞以及使用核酶减少植物中Ss2-ODD1活性的方法。
在另一个实施方式中，本发明提供介导RNA干扰（RNAi）基因沉默的双链核酸分子。在实施方式中，本发明的siNA分子由在包含约15至约30（例如，约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30）个核苷酸的寡核苷酸之间的、含有约15个至约30个碱基对的双链体核酸分子构成。在另一个实施方式中，本发明的siNA分子包含具有约1至约32（例如，约1、2或3）个核苷酸的突出端的双链体核酸分子，例如，约21个核苷酸的双链体，其中约19个碱基对和3'端单核苷酸、二核苷酸或三核苷酸突出。在另一个实施方式中，本发明的siNA分子包含具有平端的双链体核酸分子，其中两端都是平端，或可选择地，其中一端是平端。
本发明的siNA分子可包含修饰核苷酸，同时保持介导RNAi的能力。修饰核苷酸可被用来改良体外或体内的特性，例如稳定性、活性和/或生物利用度。例如，本发明的siNA分子可以占存在于siNA分子中的核苷酸总数的百分数的形式包含修饰核苷酸。照这样，本发明的siNA分子通常可包含约5％至约100％的修饰核苷酸（例如，约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%的修饰核苷酸）。存在于给定siNA分子中的修饰核苷酸的实际百分数将取决于存在于siNA中的核苷酸的总数。如果siNA分子是单链的，修饰百分数可基于存在于单链siNA分子中的核苷酸的总数。同样地，如果siNA分子是双链的，修饰百分数可基于存在于正义链、反义链，或正义链和反义链中的核苷酸的总数。
用于基因工程的植物
本发明包括植物的基因操作，以改良植物构型和提高生物量和/或蔗糖产量。
术语“植物”指可被基因操作的任何含纤维素的植物材料，包括但不限于：分化的或未分化的植物细胞、原生质体、全株、植物组织或植物器官，或植物的任何成分，例如叶、茎、根、芽、块茎、果实、根茎或类似物。术语“繁殖体”包括具有产生新植物能力的结构体，例如，种子、孢子或如果从母体分离能独立生长的营养体的一部分。
“转基因植物”是指来源于基因工程植物细胞或原生质的植物或其子代，其中植物DNA含有引入的外源DNA分子。此外，“转基因植物”类别包括在其谱系中的转化体，例如通过标准的渐渗现象或另外的育种过程（例如常规育种）形成所述转化体。相反地，未经基因操作的植物是对照植物，且被称为“非转基因”植物。非转基因植物可从培养的细胞或组织中再生，该细胞或组织没有通过引入包含多核苷酸序列的构建体而进行前述修饰。此外，“野生型植物”指非转基因植物，其基因组既没有通过引入含本发明多核苷酸序列或其片段的构建体被修饰，也不是从培养的细胞或组织中再生的。
可根据本发明被工程化的植物包括但不限于任何高等植物，包括裸子植物、单子叶植物和双子叶植物。本发明的植物可包括作物，包括但不限于：大豆、小麦、玉米、马铃薯、棉花、水稻、油菜（包括卡诺拉（canola））、豆类、向日葵、苜蓿、甘蔗、草坪植物（turf）、大麦、黑麦、粟、高粱、甜菜、糖用甜菜、木薯、薯蓣和甘薯。植物还可以是木本植物，例如松树、杨树、白杨、柳树和桉树。植物也可以是禾本科植物，包括但不限于甘蔗属、蔗茅属、芒属、河八王属、斑茅属（Sclerostachya）、高粱、玉米、玉米草、摩擦禾属（Tripsacum）、粟、画眉草（teff）、柳枝稷、象草、水稻、野生稻、燕麦、大麦、黑麦、短柄草属、黑麦草、牛毛草、草坪草或竹类。更特别地，可根据本发明被工程化的植物包括但不限于木本树木、甘蔗和高粱。
“甘蔗植物”被理解为是指甘蔗属的植物，优选为热带种，更优选为由热带种和细茎野生种杂交生成的种间杂种。“高粱”是指高粱属成员的任何植物，并且包括具有高糖含量的“甜高粱”品种。
基因工程方法
本发明的多核苷酸可被用于生产具有改良的构型和提高的植物生物量和/或蔗糖产量的转基因植物。
参入多核苷酸和/或表达本发明的多核苷酸的转基因植物（包括植物细胞、植物外植体或植物组织）可通过如下文所述的各种成熟的技术而制造，且最适当的转化技术的选择可由操作者决定。在构建载体（最常见的是包括多核苷酸（例如Ss2-ODD1序列）的表达盒）后，可使用本领域已知的标准技术来将多核苷酸引入和稳定地整合进入感兴趣的植物、植物细胞、植物外植体或植物组织中。任选地，植物细胞、外植体或组织可被再生以产生转基因植物。
单子叶植物的和双子叶植物的被子植物或裸子植物的植物细胞都可被转化。例如，参见Klein和Fitzpatrick-McElligott.，Current Opinion inBiotechnology4:583-590，1993；Bechtold等，C.R.Acad.Sci Paris316:1194-1199，1993；Koncz和Schell，Mol.Gen.Genet.204:383-396，1986；Paszkowski等，EMBO J.3:2717-2722，1984;Sagi等，Plant Cell Rep.13：262-266，1994。例如，根据Nagel等，FEMS Microbiol Lett67:325-328,1990，可以使用农杆菌属物种，如根癌农杆菌和发根农杆菌。此外,植物可通过根瘤属转化、中华根瘤属转化或中生根瘤属转化而被转化。Broothaerts等，Nature433:629-633,2005。
基因工程化植物或细胞的另外的方法包括但不限于电穿孔、基因枪轰击（Klein等，Nature327:70-73,1987）、磷酸钙沉淀和聚乙二醇融合、转移进萌芽花粉粒、直接转化（Lorz等，Mol Gen.Genet.199:179-82,1985）和其他本领域已知的方法。
对于禾本科（玉米、甘蔗、高粱等）、豆科（苜蓿、大豆、三叶草等）、伞形科（胡萝卜、芹菜、欧洲防风草）、十字花科（甘蓝、萝卜、油菜、绿化椰菜等）、葫芦科（甜瓜和黄瓜）、禾本科（小麦、玉米、水稻、大麦、粟等）、茄科（马铃薯、番茄、烟草、胡椒等）和各种其他作物，可得到合适的实验方案。参见在下述文章中描述的实验方案：Ammirato等，Handbook ofPlant Cell Culture-Crop Species.Macmillan Publ.Co.,N.Y.,1984；Shimamoto等，Nature338:274-276，1989；Fromm等，Bio/Technology8:833-39,1990；和Vasil等，Bio/Technology8:429-34，1990。对于本发明，特别感兴趣的是甘蔗转化的实验方案。甘蔗可通过基因枪轰击（参见Bower&Birch，PlantJournal2:409-416，1992；Franks&Birch，Aust.J.Plant Physiol.18:471-80,1991；Gallo-Meagher&Irvine,Crop Science36:1367-1374,1996；Bower等，Molecular Breeding2:239-249,1996；Snyman等，S.Afr.J.Bot.62:151-154,1996）或通过农杆菌介导的基因转移而被转化。参见，例如Arencibia等，Transgenic Res.7:213-22,1998。
从被转化的细胞或培养物中再生转基因植物的方法根据植物种的不同而改变，但都以已知的方法为基础。例如，再生转基因甘蔗植物的方法是众所周知的。参见，例如Weng等，Pest Manag.Sci62:178-87,2006；Santosa等，Molecular Biotechnology28:113-19,2004；Bower和Birch,Plant Journal2:409-416,1992；和Falco等，Plant Cell Reports19:1188-194,2000。
如果使用选择标记，例如卡那霉素抗性，就可更容易地确定哪些细胞已经被成功地转化。标记基因可被包括在由特异性重组酶（例如cre或flp）识别的重组位点对中，以便在选择后除去标记。参见美国公开申请第2004/0143874号。
选择出内源2-ODD1基因表达降低的被转化的植物。例如，所发明的转基因甘蔗植物或细胞可通过以下事实而与野生型蔗糖区别开来，即，除了包含在蔗糖野生型植物/植物细胞中自然存在的核酸分子的拷贝之外，转基因植物或细胞还包含至少一个被稳定整合到它们的基因组中的、在SEQ ID NO:1中的核酸分子的拷贝。在这种情况下，转基因甘蔗植物/细胞，例如，可区别于甘蔗野生型植物/细胞，因为额外的拷贝或多个拷贝在基因组中的位置在野生型植物/细胞中并不存在。
在本发明的内容中，由前述方法生产的转基因植物可被用作在常规育种程序中的转基因来源。通常，来自转基因植物的花粉被用来给非转基因植物授粉。母体植物的种子可被用来生产与由前述方法生产的原始转基因植物不同的新的转基因植物。
定量提高的生物量和蔗糖产量的方法
本发明的转基因植物和细胞的特征是具有改变的植物构型和提高的生物量和/或提高的蔗糖产量。这可通过降低或抑制2-ODD表达来实现。
术语“性状”是指植物或特定植物材料或细胞的生理学、形态学、生物化学或物理学特性。在某些情况下，此特性是人眼可见的（例如种子或植物大小），或可通过可用的生化技术被测量（例如植物各部分的蛋白质或蔗糖含量），或可通过观察基因的表达水平被测量（例如，使用Northern分析、RT-PCR、微列阵基因表达分析或报告基因表达系统），或通过农业观察被测量（例如产量或改良的构型）。
在本说明书中，词语“提高的生物量”意味着，相对于相应非转基因植物的相应部分的生物量来说，在植物的一个或多个部分（特别是在地上（可收获的）部分）中生物量的增加，增加的根生物量或增加的任何其他可收获部分的生物量。“纤维产量”被理解为是指由植物产生的固体、水不溶性物质的总量。为本发明的目的，纤维被认为是生物量的成分，并且是指在甘蔗茎被破碎以提取其汁液后剩余的甘蔗渣。“提高的纤维产量”是指相对于非转基因植物，在转基因植物中的总纤维产量的增加。
“蔗糖产量”被理解为是指由植物产生的蔗糖的总量。蔗糖产量通过计算表观总蔗糖量（total apparent sucrose）来定量，表观总蔗糖量被定义为通过破碎茎而获得的汁液体积乘以该汁液中的蔗糖浓度的积。更优选地，在本发明的内容中，蔗糖产量是指每公顷转基因种植园生产的蔗糖的总量。词语“提高的蔗糖产量”是指与非转基因植物相比，转基因植物中蔗糖含量的增加。
此文定义的“改良的构型”包括叶、苗、茎、分蘖、花序（对于单子叶植物和双子叶植物来说）、穗、花粉、胚珠、种子、胚芽、胚乳、种皮和糊粉中任何一个或多个的外观和数量的改变。此外或作为选择，“改良的构型”通过以下至少一个显现：植物高度和/或重量的增加、茎节间数量的增加、茎节间直径的增加和/或茎节间长度的增加，和从转基因植物的底部到顶部的更均匀的节间直径。
量化植物生物量
提高的生物量可通过测量更容易辨别的特性而确定，包括但不限于植物重量和大小、茎重量和大小、叶重量和大小、根重量和大小以及种子数量和重量。
具有“提高的生物量”的植物是指与非转基因植物相比，转基因植物中干重和/或鲜重增加2-100%，优选5-90%，且更优选10-80%。
为本发明的目的，纤维被包括在生物量中。如果是甘蔗，纤维含量通常为鲜重的8%至14%。如本文所使用的，“纤维”是指在甘蔗茎被破碎以提取其汁液后剩余的甘蔗渣或生物量。因此，纤维产量通过使用大容量精密天平测量甘蔗渣鲜重来定量。甘蔗压榨机产生占其总压榨物近30%的甘蔗渣。已有许多研究试图将甘蔗渣用作用于发电和生产生物源（bio-based）材料的可再生原料。此外，甘蔗渣可被用作主要的燃料来源，因为当以一定数量燃烧时，它可产生足够的热能。
具有“提高的纤维产量”的植物是指与相同物种或相同品种的对照植物相比，总纤维产量增加2-70%，优选5-50%且更优选10-40%。
量化蔗糖产量
“蔗糖产量”被理解为是指由植物产生的蔗糖的总量。蔗糖产量通过计算表观总蔗糖量来定量，表观总蔗糖量被定义为通过破碎茎而获得的汁液体积乘以该汁液中的蔗糖浓度的积。更优选地，在本发明的内容中，蔗糖产量是指每公顷转基因甘蔗种植园生产的蔗糖的总量。
具有“提高的蔗糖产量”的植物是指与相同物种或相同品种的对照植物相比，总蔗糖产量增加2-100%，优选5-90%，且更优选10-80%。
评价植物构型改良
在描述本发明的植物时，具有“改变的植物构型”的植物是指在以下方面的改变，例如，植物高度、重量和直径；分蘖数；节间数、长度和均匀性；叶子数、长度、厚度和角度分布；根长度和重量。
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参考以下实施例进一步描述本发明，这些实施例仅是说明性的且不限定本发明。
实施例1.甘蔗属2-酮戊二酸依赖性双加氧酶(Ss2-ODD1)的识别和特征描述。
采用BLAST算法在GenBank的甘蔗表达序列标签（EST）数据库中利用来自水稻的2-ODD同系物的序列进行检索（Altschul等.,J.MoI.Biol.215:403-410,1990）。使用特定的水稻2-ODD同系物(gi27311281)的检索,识别了编码甘蔗属推定的2-ODD同系物的两簇（cluster）。其中一簇与GenBank中发现的2-ODD cDNA克隆（gi35984354)（其3’端不完整）几乎相同。我们发现这些簇对应于单个cDNA克隆，下文命名为Ss2-ODD1(SEQ ID NO:1)。通过与其最相似的植物同系物的序列比对确定，Ss2-ODD1含有编码可能是全长Ss2-ODD1多肽（SEQ ID NO:2）的开放阅读框（位置在50至982）。Ss2-ODD1编码具有310个氨基酸残基的多肽，多肽的计算的分子量为34,452。在美国国家生物信息中心保守结构域数据库（National Center forBiotechnology Information Conserved Domain Database collection）中的检索，显示2-酮戊二酸依赖性双加氧酶结构域（pfam03171）存在于Ss2-ODD1多肽的羧基端部分（残基170至271）。图1图示了在该结构域中存在保守残基，包括非血红素铁(II)依赖性双加氧酶共有的铁结合模体His-X-Asp(53-57)X-His（Kreisberg-Zakarin等.,Antonie Van Leeuwenhoek75:33-39,1999)。这些保守残基被认为是在活性位点中铁结合所需要的（Borovok等,Biochemistry.35:1981-1987,1996)。
实施例2.系统发生分析
在美国国家生物技术信心中心基因库（National Center for BiotechnologyInformation GenBank）的蛋白数据库中使用Ss2-ODD1序列进行BLAST检索，得到了一些描述了功能特征的（functionally characterized）2-ODD蛋白质和几种来源于多种高等植物物种的具有未知功能的类似2-ODD的蛋白质。使用BLOSUM矩阵，利用Clustal算法（Sugawara等,Nucleic Acids Res.31:3497-3500,2003）比对主要类型2-ODD的代表成员的全长氨基酸序列。使用MEGA3.1版（Kumar等,Brief Bioinform.5:150-163,2004），通过Neighbor-Joining(NJ)法进行了系统发生分析，其中系统树节点的强壮性通过自引程序（1000次重取样）来评估。在所生成的系统树中（图2），可识别出主要的功能上不同的2-OOD群组。值得注意的群组是主要由1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶表示的群组，和其他主要包含赤霉酸-2氧化酶、赤霉酸-3氧化酶和赤霉酸-20氧化酶的群组。在后者中的是由影响赤霉素在拟南芥、水稻和豌豆中的代谢的基因编码的蛋白质。Ss2-ODD1属于功能特征尚不清楚的2-ODD的独特群组，该群组具有来自拟南芥、长春花、截形苜蓿、水稻、高粱和玉米的几个同系物。此物种范围内的Ss2-ODD1相关序列的识别表明该群组在单子叶植物进化枝和双子叶植物进化枝中具有广泛的保守性。
实施例3.载体构建
使用从甘蔗杂交栽培种SP801842的未成熟叶中分离的总RNA，通过RT-PCR获得了619bp的片段，该片段为Ss2-ODD1cDNA（SEQ ID NO:1）的核苷酸58到676。寡核苷酸Ss2-ODD1as Fwd（SEQ ID NO:3,CGCGGATCCGAACCTGCACCTCCCCGT）和Ss2-ODD1as Rev（SEQ IDNO:4,CGGACTAGTCAGGCCAGGAGTGCCATC)基于Ss2-ODD1EST（GenBank gi35984354）设计。将BamHI位点和SpeI位点（下划线表示）分别设计进入引物Ss2-ODD1as Fwd和Ss2-ODD1as Rev。将扩增片段克隆进入pGEM-T Easy（Promega），通过测序验证，并通过用SpeI和BamHI消化来切除。消化产物用琼脂糖凝胶电泳分离，纯化并克隆在pUBI（Christensen和Quail,Transgenic Res.5:213-218,1996）的AvrII位点和BamHI位点上，将Ss2-ODD1片段以反义方向设置在来自玉米的多聚遍在蛋白基因UBI-1启动子和来自根癌农杆菌的胭脂碱合酶基因NOS转录终止子之间。所产生的构建体通过测序验证。用HindIII消化此构建体以释放UBI-1::Ss2-ODD1as::NOS盒(图3)。被克隆在pBLUESCRIPT SK-的盒UBI-1::Bar::NOS（Christensen和Quail,Transgenic Res.5:213-218,1996）通过用EarI消化而被释放（图3）。消化产物通过琼脂糖凝胶电泳而分离，且对应UBI-1::Ss2-ODD1as::NOS盒和UBI-1::Bar::NOS盒的片段被纯化并用于甘蔗胚性愈伤组织转化。
实施例4.甘蔗转化
从甘蔗杂交栽培种RB835486的顶端分生组织和初叶中建立起胚性愈伤组织培养物。通过前述粒子轰击法(Klein等,Plant Physiol.91:440-444,1989)，使用等摩尔浓度的UBI-1::Bar::NOS表达盒和UBI-1::Ss2-ODD1as::NOS表达盒（10μg DNA/3mg粒子)转化八周龄的愈伤组织。轰击后，将愈伤组织转移到含有1mg/L膦丝菌素（PPT）和1mg/L苄氨基嘌呤（BAP）的MS培养基（Murashige和Skoog,Physiol Plant15:473-479,1962），以抑制非转基因组织的发育并促进芽再生（shoot regeneration）。两周后，将愈伤组织转移到含有1mg/L膦丝菌素（PPT)和1mg/L吲哚-3-丁酸（IAB）的MS培养基，以实现芽的伸长并诱导根形成。两周后，将小植株放置到品红盒子中以实现驯化，且两周后，将具有发育良好的根的芽（10-15cm高）转移到盆土中并放置于温室内。通过PCR分析来确定是否存在选择标记基因（Bar）和UBI::Ss2-ODD1as::NOS转基因，而对再生转基因植物进行基因型分型。通过如上所述从甘蔗杂交栽培种RB835486的胚性愈伤组织中再生植物而获得组织培养的非转基因对照，但省略了用表达盒进行粒子轰击和膦丝菌素选择。植物通过枝插繁殖。
实施例5.UBI-1::Ss2-ODD1as::NOS植物的植物构型改变
为了评估降低Ss2-ODD1在转基因甘蔗植物中的表达的效果，在温室内评价了甘蔗品种RB835486的UBI-1::Ss2-ODD1as::NOS独立转基因株系和非转基因野生型植物。将植物（每个株系12个副本）种在50L罐的椰壳纤维基层中。每天用营养液灌溉植物三次（共1.5L）。等到每株植物具有四个分蘖才允许发育，超出的分蘖将被人工去除。幼苗出土后七个月，灌溉方法改为每天用自来水（共250mL）灌溉三次（灌溉14天），以促使其成熟。选择出每个副本的两个最同形的（homogeneous）分蘖用于分析，并从它们最老节点的下方切断它们的茎。识别在第一个可见垂肉（dewlap）下的八个节间，并在第七个节间和第八个节间之间切断它们的茎，并丢弃茎的顶端和所有的叶子。测量茎的高度和重量、节间数、宽度和长度。使用MINITAB Release14进行所有测量数据的方差分析（ANOVA）和用于均值比较的Dunnett测试。
在植物完全特征化之前的生长阶段，各种UBI-1::Ss2-ODD1as::NOS株系相比于非转基因对照栽培种RB835486在它们的尺寸上表现出可觉察到的改变。在幼苗出土后七个月时的测量显示株系06、09、12、13、14、15、18和21相比于非转基因对照具有显著增加的高度（图4）。在株系09、13、14和15中，这可能是由显著增加的节间数引起的（图5），而在株系12、18和21中，这可能是显著增加的平均节间长度的结果（图6）。测量还显示在株系06和21中节间直径被显著增加（图7）。如它们的茎鲜重所说明的（图8），由于它们总尺寸的增加，因而株系06、09和21具有显著提高的生物量。总而言之，Ss2-ODD1表达的降低看来以各种程度引起了植物构型的改变，导致尺寸增加。
实施例6.在UBI-1::Ss2-ODD1as::NOS植物中提高的蔗糖产量
为了评估降低Ss2-ODD1在转基因甘蔗植物中的表达的效果，在温室内评价了甘蔗品种RB835486的UBI-1::Ss2-ODD1as::NOS独立转基因株系和非转基因野生型植物。将植物（每个株系12个副本）种在50L罐的椰壳纤维基层中。每天用营养液灌溉植物三次（共1.5L）。等到每株植物具有四个分蘖才允许发育，超出的分蘖将被人工去除。幼苗出土后七个月，灌溉方法改为每天用自来水（共250mL）灌溉三次（灌溉14天），以促使其成熟。选择出每个副本的两个最同形的分蘖用于分析，并从它们最老节点的下方切断它们的茎。识别在第一个可见垂肉下的八个节间，并在第七个节间和第八个节间之间切断它们的茎，并丢弃茎的顶端和所有的叶子。为评估适当的成熟诱导，采用手持式Reichert糖度折射计测量总可溶固体，并计算第八个节间和倒数第三个节间的值的比率。该比率在所有情况下中都大于80%，这是成熟的阳性指标。使用三辊式强力破碎机从茎中提取汁液。汁液被立即通过不锈钢滤网过滤。测量汁液体积，并将汁液再次通过120目的滤网过滤。立即估算汁液中总可溶固体和蔗糖浓度。使用Bellingham+Stanley RFM840数字折射计通过折射法测量汁液总可溶固体。在加入氢氧化钙、氯化铝六水合物和C盐对汁液进行澄清后，通过使用Zeiss Polomat A旋光计测量圆双折射而估算汁液蔗糖浓度。汁液中的蔗糖浓度以%POL表示，其表示每100mL溶液中蔗糖的克数。表观总蔗糖量被计算为汁液体积乘以其中的蔗糖浓度（POL）的积。使用MINITAB Release14进行方差分析（ANOVA）和用于均值比较的Dunnett测试。
株系06和09相比于非转基因对照栽培种RB835486具有显著增加的汁液体积（图9），而株系13、14和21的汁液中具有显著增加的蔗糖浓度（图10）。我们计算了表观总蔗糖量作为蔗糖产量的估算。此分析显示，株系09、13、14、20和21具有显著增加的蔗糖产量（图11）。因此，Ss2-ODD1表达的降低看来引起了汁液体积及其蔗糖浓度的变化，这种变化导致蔗糖产量增加。
实施例7.在UBI-1::Ss2-ODD1as::NOS植物中的提高的生物量产量
为了评估降低Ss2-ODD1在转基因甘蔗植物中的表达的效果，在温室内评价了甘蔗品种RB835486的UBI-1::Ss2-ODD1as::NOS独立转基因株系和非转基因野生型植物。将植物（每个株系12个副本）种在50L罐的椰壳纤维基层中。每天用营养液灌溉植物三次（共1.5L）。等到每株植物具有四个分蘖才允许发育，超出的分蘖将被人工去除。幼苗出土后七个月，灌溉方法改为每天用自来水（共250mL）灌溉三次（灌溉14天），以促使其成熟。选择出每个副本的两个最同形的分蘖用于分析，并从它们最老节点的下方切断它们的茎。识别在第一个可见垂肉下的八个节间，并在第七个节间和第八个节间之间切断它们的茎，并丢弃茎的顶端和所有的叶子。使用三辊式强力破碎机从茎中提取汁液。在茎被破碎用于提取汁液后，使用大容量精密天平测量甘蔗渣的鲜重。使用MINITAB Release14进行方差分析（ANOVA）和用于均值比较的Dunnett测试。
此分析显示株系9和21相比于非转基因对照具有显著增加量的甘蔗渣鲜重（图12），说明这些株系具有增加的生物量产量。
实施例8.Ss2-ODD1转录体在甘蔗器官中的表达
为了确定Ss2-ODD1转录体在空间上和时间上的多度，我们使用从野生型甘蔗植物（RB835486）的不同器官中分离的RNA进行了定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）。从8月大的温室种植的植物获取最嫩叶的叶片、苗端、+4叶片、+4叶鞘、+4节间、最老绿叶的叶片、最老绿叶的叶鞘、连接至最老绿叶的节间、倒数第三个节间（从顶端到底部）和根部。+4叶片被定义为在叶片接头（blade joint）处具有清晰可见的垂肉的第4最嫩叶。从相同栽培种的30cm高的幼苗获取全叶和根。在本分析中使用了三个独立的8月大植物和三个包含三个幼苗的集合体（pool）。使用研钵和研杵将液氮冷冻的组织研磨成粉，并根据制造商的说明书使用Trizol试剂（Invitrogen）分离总RNA。使用DNaseI（Promega）处理总RNA，并使用2μg的总RNA采用Superscript II逆转录酶（Invitrogen）合成cDNA第一链。将十分之一的cDNA和500nM浓度的基因特异性引物与SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems）结合使用。在ABI Prism7000Sequence DetectionSystem（Applied Biosystems）上进行PCR。为扩增Ss2-ODD1转录体，使用了寡核苷酸引物Ss2-ODD1Fwd(SEQ ID NO:5,CAGTTGGTAAAGAGCGGTATTCGGTGGC)和Ss2-ODD1Rev(SEQ ID NO:6,CTTGATAGGTGGAAACCTTGGTGGACATGC)，这对引物在Ss2-ODD1的3'端编码序列（碱基对770-880）处退火。使用寡核苷酸引物SsACT Fwd(SEQ ID NO:7,AAGCAGCATGAAGATCAAGGTCGTTGCAC)和SsACT Rev(SEQ ID NO:8,CTGTGAACAATTGCCGGGCCAGACTC)扩增用作参照基因的肌动蛋白（SsACT；GenBank gi53759188)，该对引物在SsACT的3'端编码序列（碱基对972-1121）处退火。扩增过程为50℃2分钟，95℃10分钟,并以95℃15秒和60℃1分钟循环45次。扩增反应的特异性通过解离曲线的分析来评价。Ss2-ODD1扩增产物的量和SsACT扩增产物的量之间的比率采用2-ΔΔCt法（Livak和Schmittgen,Methods25:402-408,2001）计算。每个副本的标准化表达水平被计算为L=2-ΔCt和ΔCT=CT,Ss2-ODD1-CT,SsACT。Ss2-ODD1相对于SsACT的转录水平被计算为从被用作每个器官的生物学副本的三个独立样本获得的平均值。由此分析得到的结果显示在图13中。
Ss2-ODD1转录体在所有被分析的器官中都被检测到，与其在EST库的低出现率（frequency）相一致，Ss2-ODD1转录体的多度远低于SsACT转录体，表明Ss2-ODD1表达水平低。Ss2-ODD1转录体在8月大植物的叶片中最丰富。最高的表达水平发现于最老绿叶的叶片中，其次是+4叶片和最嫩叶片。幼苗全叶表现出中等表达水平。较低的转录水平发现于8月龄植物的叶鞘、根、节间和苗端，且在幼苗根部表达水平最低。尽管总表达图式表明Ss2-ODD1具有相当广泛的表达，但也暗示Ss2-ODD1在光合作用活跃的叶子中具有一定功能。
实施例9.Ss2-ODD1重组蛋白质的纯化和多克隆Ss2-ODD1的产生
UBI-1::Ss2-ODD1as::NOS转基因来源的反义转录体的表达是为了降低Ss2-ODD1蛋白质多度。我们尝试制备抗Ss2-ODD1重组蛋白质的多克隆抗体，以用于其在UBI-1::Ss2-ODD1as::NOS株系和非转基因对照中的免疫检测，以验证转基因来源的反义转录体是否降低了Ss2-ODD1蛋白质多度。
从由甘蔗（甘蔗杂交栽培种RB835486）叶制备的cDNA，使用HiFi TaqDNA聚合酶（Invitrogen）和Ss2-ODD1CDS Fwd引物（SEQ ID NO:9,AGCATGGCAGGCAACCTGCACCTCCCCGTG）以及Ss2-ODD1CDS Rev引物（SEQ ID NO:10,
CTTATTTGTATGTCGAATTTATTCGCCCAACTACGTATTCCCCAC）来扩增Ss2-ODD1全长编码序列。根据制造商的说明书将所产生的936-bp的扩增片段克隆进入pET SUMO(Invitrogen)，并通过测序验证其核苷酸序列。所产生的构建体，pET SUMO-Ss2-ODD1，编码由被融合在Ss2-ODD1氨基端的、六个组氨酸标记（SEQ ID NO:62）的小泛素修饰物（SUMO）多肽(SUMO-Ss2-ODD1)构成的融合蛋白。通过正向寡核苷酸引物，在Ss2-ODD1翻译起始甲硫氨酸密码子之前加入丝氨酸密码子，以便通过用SUMO蛋白酶（Invitrogen）消化而除去SUMO。通过在37℃使用1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导O.D.600～0.5的细胞培养物3小时，而将pETSUMO-Ss2-ODD1转化进入大肠杆菌CY(DE3)pLysS菌株(Farah和Reinach,Biochemistry38:10543-10551,1999)并表达SUMO-Ss2-ODD1融合蛋白质。离心收集细胞，并在补充有0.2mg/mL溶菌酶的PBS（pH7.2）中冰上裂解30分钟，然后超声处理。通过以15,000g离心15分钟来除去裂解物。在上清液中加入10mM咪唑，SUMO-Ss2-ODD1融合蛋白被结合至在1mL HiTrapHP柱（Amersham）上的Ni+2。在用含10mM咪唑的pH7.2的磷酸缓冲盐水（PBS）粗洗（extensive washing）后，使用在pH7.2的PBS中的10-500mM咪唑梯度洗脱SUMO-Ss2-ODD1融合蛋白质。天然的Ss2-ODD1蛋白质通过用SUMO蛋白酶（Invitrogen）切割亲和纯化的SUMO-Ss2-ODD1而获得，并依照制造商的说明书进行进一步纯化，但不进行用SUMO蛋白酶在25℃消化4小时的步骤。
天然的Ss2-ODD1（150μg）与弗氏完全佐剂一起注射进入兔子体内。使用150μg的Ss2-ODD1和弗氏不完全佐剂进行三次强化注射。如Harlow和Lane（ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1988）所描述的，从天然血清（crudesera）中亲和纯化出抗体。通过以50%的硫酸铵饱和度沉淀而从天然抗血清中获得富含IgG的部分。所产生的颗粒溶解于pH7.2的PBS中，并被透析。通过在4℃，与表达自pET SUMO-CAT（Invitrogen）的、六个组氨酸标记(SEQID NO:62)的结合SUMO-CAT（氯霉素乙酰基转移酶）融合蛋白一起，在1mLHiTrap HP柱（Amersham）上连续循环（过夜）而使该部分不含非Ss2-ODD1抗体。随后在4℃，将流通部分（flowthrough fraction）与共价连接的SUMO-Ss2-ODD1融合蛋白一起在1mL HiTrap NHS活化的HP柱（GEHealthcare Bio-Sciences AB）上连续循环（过夜）。用pH7.2的PBS粗洗抗体吸附柱，并用100mM NaCl、100mM甘氨酸、pH2.4的溶液洗脱抗体。收集部分立即用0.1倍体积的2M Tris-HCl（pH8.0）中和；那些含有大部分IgG的溶液被集中在一起并用Centricon-10spin cartridges(Millipore)浓缩，其后用pH7.2的PBS进行粗放的缓冲液更换（extensive buffer exchange）。
实施例10.在UBI-1::Ss2-ODD1as::NOS株系和非转基因对照中的Ss2-ODD1蛋白质水平
使用亲和纯化的多克隆抗体（用来抗重组的、天然Ss2-ODD1），我们进行了UBI-1::Ss2-ODD1as::NOS株系和非转基因对照植物的器官中的Ss2-ODD1的免疫印迹分析，以验证转基因来源的反义转录体是否降低了Ss2-ODD1蛋白质多度。对于每个转基因株系或野生型对照，都从8月大的温室种植的植物获取+4叶片。+4叶片被定义为在叶片接头处具有清晰可见的垂肉的第4最嫩叶。
获取的植物材料立刻被冷冻在液氮中，并在-80℃储存以用于后续处理。植物材料在液氮中被匀浆成精细粉末，并被转移到锥形微离心管中。向磨碎的组织加入三倍体积的补充有完全不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物（Roche Diagnostics GmbH）的冰冷提取缓冲液（100mM Tris-HCl pH6.8、5mM EDTA、0.1%SDS、175mMβ-巯基乙醇、10%丙三醇)，并在4℃持续搅拌20分钟。通过在4℃以15,000g离心15分钟而除去匀浆。蛋白质浓度用Bradford分析（Protein Assay kit,Bio-Rad）测定（使用BSA作为标准样）。可溶蛋白质提取物（50μg）通过12.5%的SDS-PAGE而被分离，并在槽式转印系统（Mini Trans-Blot Cell,Bio-Rad）的TGM缓冲液（25mM Tris、192mM甘氨酸、20%甲醇)中，在150伏特×小时（volts×hours）时被印迹在聚偏氟乙烯膜（Hybond-P PVDF,Amersham）上。
用在TBST（20mM Tris-HCl pH7.5、150mM NaCl、0.05%吐温-20）中的9%脱脂奶粉封闭膜，并在室温下与在TBST中以1:1000稀释的亲和纯化的抗体培育过夜。膜用TBST溶液洗10分钟，洗三次，并在室温下与在TBST中以1:10000稀释的、接合至辣根过氧化物酶的驴抗兔IgG（GE HealthcareBio-Sciences AB）培育1.5小时。膜随后用TBST洗涤三次，并用ECL Plus（GE Healthcare Bio-Sciences AB）显影，其后在X光胶片（Hyperfilm ECL;GE Healthcare Bio-Sciences AB）上曝光不同的时间间隔。
利用亲和纯化的抗体，Ss2-ODD1在+4叶片制备的提取物中被检测为具有约34kD的多肽，大小与重组的、天然Ss2-ODD1蛋白质一致（图14）。相比于野生型对照，来自株系9、14和21的+4叶片在不同程度上都具有减少量的Ss2-ODD1蛋白质（图14）。观察到的Ss2-ODD1蛋白质表达的差异从部分降低到几乎全部消失都有。在株系14中难以检测到Ss2-ODD1蛋白质，这说明Ss2-ODD1反义转录体的表达导致了Ss2-ODD1蛋白质表达的急剧降低。株系9和21的Ss2-ODD1蛋白质水平介于株系14和野生型对照所观察到的水平之间。在所有被分析的株系中，株系9的Ss2-ODD1蛋白质水平的降低量明显是最小的。
Ss2-ODD1蛋白质水平在+4叶片中的降低，与被分析的UBI-1::Ss2-ODD1as::NOS中观察到的显现表型（manifested phenotype）并没有太高的关联性。Ss2-ODD1蛋白质水平的降低程度，除了依赖于株系外，还可能在不同器官中是变化的，且表型与Ss2-ODD1多度在除+4叶片外的其他器官中的变化是最相关的。而且，Ss2-ODD1蛋白质水平的改变可能必须被以最佳方式调节，以获得最有利的表型效应（phenotypic effect）。
Claims (13)
1.转基因植物在提高植物生物量和/或蔗糖产量中的应用，所述转基因植物具有通过反义抑制、正义共抑制、RNA干扰或RNA酶使所述植物中的内源2-ODD DNA序列的表达相对于野生型对照植物而降低的外源性核酸构建体，其中，所述转基因植物属于禾本科、葫芦科、十字花科、茄科和豆科，并且，其中，在所述外源性核酸构建体中，异源植物可表达的启动子可操作性地连接至如下核酸序列：（i）所述核酸序列编码序列为SEQ ID NO:63的2-ODD1酶、序列为SEQ ID NO:64的2-ODD1酶，或编码序列包括SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16的2-ODD1酶；或者（ii）所述核酸序列为（i）的核酸序列的完全反义序列。
2.权利要求1所述的应用，其中所述植物属于禾本科。
3.权利要求2所述的应用，其中所述植物是甘蔗、高粱、玉米、水稻或芒属植物。
4.一种生产蔗糖的方法，其包括：
（a）提供一种相对于野生型对照植物而言具有被抑制的2-ODD1蛋白质水平的转基因植物，所述2-ODD1蛋白质水平通过反义抑制、正义共抑制、RNA干扰或RNA酶受到抑制，其中，所述2-ODD1蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64，或者所述2-ODD1蛋白质的氨基酸序列包括SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16；和
（b）从所述植物获得蔗糖。
5.权利要求4所述的方法，其中所述植物为甘蔗、高粱、玉米、水稻或芒属植物。
6.一种生产生物量的方法，其包括:
（a）提供一种相对于野生型对照植物而言具有被抑制的2-ODD1蛋白质水平的转基因植物，所述2-ODD1蛋白质水平通过反义抑制、正义共抑制、RNA干扰或RNA酶受到抑制，其中，所述2-ODD1蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64，或者所述2-ODD1蛋白质的氨基酸序列包括SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16；和
（b）从所述植物获得生物量。
7.权利要求6所述的方法，其中所述植物为甘蔗、高粱、玉米、水稻或芒属植物。
8.一种在植物中提高蔗糖产量的方法，包括通过反义抑制、正义共抑制、RNA干扰或RNA酶在所述的植物中抑制2-ODD1蛋白质水平，其中，所述2-ODD1蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64，或者所述2-ODD1蛋白质的氨基酸序列包括SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16。
9.权利要求8所述的方法，其中所述植物为甘蔗、高粱、玉米、水稻或芒属植物。
10.一种在植物中提高生物量的方法，其包括通过反义抑制、正义共抑制、RNA干扰或RNA酶在所述植物中抑制2-ODD1蛋白质水平，其中，所述2-ODD1蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64，或者所述2-ODD1蛋白质的氨基酸序列包括SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16。
11.权利要求10所述的方法，其中所述植物为甘蔗、高粱、玉米、水稻或芒属植物。
12.一种用于转化植物从而改良植物构型并且提高植物生物量和/或蔗糖产量的核酸构建体，其中，异源植物可表达的启动子可操作性地连接至如下核酸序列：（i）所述核酸序列编码序列为SEQ ID NO:63的2-ODD1酶、序列为SEQ ID NO:64的2-ODD1酶，或编码序列包括SEQ ID NO:14、SEQID NO:15和SEQ ID NO:16的2-ODD1酶；或者（ii）所述核酸序列为（i）的核酸序列的完全反义序列。
13.转基因植物或者细胞作为转基因来源的应用，所述转基因植物或者细胞包含权利要求12所述的核酸构建体。
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