CN103602624B - 通过加强辅酶循环再生速率提高Bacillus amyloliquefaciens 2,3-丁二醇产量 - Google Patents

通过加强辅酶循环再生速率提高Bacillus amyloliquefaciens 2,3-丁二醇产量 Download PDF

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本发明从B.amyloliqefaciens B10-127中克隆出参与2,3-丁二醇合成途径中辅酶循环再生的关键酶基因3-磷酸甘油醛脱氢酶(gapdh)和3-羟基-2-丁酮还原酶(acr)，并将该基因与穿梭表达质粒pMA5-HpaII连接，成功构建了携带基因gapdh和acr基因的穿梭表达质粒pMA5-HpaII-acr-HapII-gapdh，并转入解淀粉芽孢杆菌B10-127中，获得加强gapdh和acr基因表达的解淀粉芽孢杆菌pMA5-HpaII-acr-HapII-gapdh／B.amyloliquefaciens。原始菌株相比，重组菌2,3-丁二醇产量提高了14.7％，副产物如3-羟基-2-丁酮、乳酸和丁二酸的积累分别降低65.6％、43.8％和42.4％，且发酵周期有所缩短。通过补料流加发酵，2,3-丁二醇产量达到121.3g／L。

Description

通过加强辅酶循环再生速率提高Bacillus amyloliquefaciens 2,3-丁二醇产量
技术领域
通过加强辅酶循环再生速率提高Bacillus amyloliquefaciens合成2，3-丁二醇产量，属于基因工程技术领域。
背景技术
随着能源资源的日益短缺和环境问题的日益严重，开发可再生的生物质资源为原料，经过化学、生物及其集成方法生产各种化学品、功能材料和能源物质的生物炼制技术越来越受到国内外的高度重视。2，3-丁二醇是重要的化工原料和液体燃料，广泛应用于化工、食品、燃料及航空航天等领域。2，3-丁二醇脱氢生成双乙酰，是一种高价值食品风味剂，具有一定的抑菌效果；在脱氢酶的作用下，生成的3-羟基-2-丁酮(乙偶姻)是一种应用广泛的天然食用香料；脱水生成的甲乙酮可作为一种高价值的液体燃料添加剂，亦是重要的低沸点溶剂，应用于涂料、粘结剂、润滑剂、燃料、油墨等行业；脱水生成的1，3-丁二烯可用于合成橡胶、ABS树脂及SBS弹性体等；酯化产品是合成聚酯和聚氨酯的前体。而且2，3-丁二醇是一种极具价值的液体燃料，其燃烧值与甲醇(22.1kJ／g)、乙醇(29.0kJ／g)相当。由于2，3-丁二醇的高辛烷值，它可作为汽油的辛烷值提升剂或航空燃料另外，2，3-丁二醇及其衍生物亦可广泛用于药用载体、增塑剂、柔软剂等的生产。
近年来用糖质原料发酵生产2，3-丁二醇取得了较好的实验室研究结果，但生物法生产2，3-丁二醇尚未实现工业化。目前报道的2，3-丁二醇生产菌株多为克雷伯氏菌属(Klebsiella)肠杆菌属(Enterobacter)和沙雷氏菌属(Serratia)等，这些菌种具有潜在致病性，不符合符合工业化安全生产的要求。因此，使用安全菌种利用葡萄糖发酵生产2，3-丁二醇具有良好的工业化前景。本发明人在前期研究中筛选得到一株安全菌株Bacillus amyloliquefaciens，该菌具有良好的2，3-丁二醇生产潜力，但是发酵过程中积累较多的副产物如3-羟基-2-丁酮、乳酸和丁二酸等。葡萄糖代谢合成2，3-丁二醇的过程也是一个氧化还原反应，该反应途径中需要辅酶NADH和NAD+的参与。葡萄糖首先经过EMP途径生产丙酮酸，此途径中的关键酶3-磷酸甘油醛脱氢酶氧化3-磷酸甘油醛合成磷酸烯醇式丙酮酸，需要氧化型辅酶NAD+的参与；随后丙酮酸经过三个关键酶催化合成2，3-丁二醇，而2，3-丁二醇的合成最后一步是乙偶姻还原酶催化还原乙偶姻合成2，3-丁二醇，此反应需要还原型辅酶NADH的参与。3-磷酸甘油醛脱氢酶和乙偶姻还原酶组成一个辅酶循环再生体系。为进一步提高该菌株2，3-丁二醇合成能力，并减少副产物的积累，发明人提出了一种通过加强辅酶循环再生速率提高Bacillusamyloliquefaciens合成2，3-丁二醇能力的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种通过加强辅酶循环再生速率提高Bacillus amyloliquefaciens合成2，3-丁二醇能力的方法。
本发明所使用菌种为Bacillus amyloliquefaciens B10-127(已保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2012年9月14日；保藏编号为：CCTCC NO：M2012349)。本发明首先从解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B10-127中克隆出参与2，3-丁二醇合成途径中辅酶循环再生的关键酶基因3-磷酸甘油醛脱氢酶(gapdh)和3-羟基-2-丁酮还原酶(acr)，并将该基因与穿梭表达质粒pMA5-HpaII连接，成功构建了携带基因gapA和acr基因的穿梭表达质粒pMA5-HpaII-acr-HapII-gapdh，并转入解淀粉芽孢杆菌B10-127中，获得加强gapdh和acr基因表达的解淀粉芽孢杆菌pMA5-HpaII-acr-HapII-gapdh／B.amyloliquefaciens(重新命名为pAG)。并对原始菌及重组菌pAG进行2，3-丁二醇发酵性能检测，说明加强gapdh和acr基因的表达能够提高2，3-丁二醇产量，降低副产物如3-羟基-2-丁酮、乳酸和丁二酸的积累。
基于以上研究，对原始菌以及重组菌pAG进行发酵实验，结果表明，与原始菌株相比，重组菌2，3-丁二醇产量提高了14.7％，副产物如3-羟基-2-丁酮、乳酸和丁二酸的积累分别降低65.6％、43.8％和42.4％，且发酵周期有所缩短。为了进一步提高重组菌的发酵性能，我们采用补料流加，发酵48h，发酵液中2，3-丁二醇积累量达到121.3g/L，这是现有技术所不能达到的结果。
本发明的有益效果：
本发明人所用菌株是一株安全菌株B.amyloliquefaciens，通过加强辅酶循环再生速率提高B.amyloliquefaciens合成2，3-丁二醇效率，并减少发酵过程中副产物如3-羟基-2-丁酮、乙酸、乳酸和丁二酸等的积累，这有利于提高生产效率，降低生产成本。
附图说明
图1质粒pMA5-HpaII-acr-HapII-gapdh构建示意图
图2SDS-PAGE分析蛋白表达情况
具体实施方式
实施例1：目的基因的扩增及重组解淀粉芽孢杆菌的构建
质粒pMA5-HpaII-acr-HapII-gapdh构建示意图如图1所示，具体过程如下：
首先，以菌株B10-127的染色体DNA为模板，利用引物P1和P2，通过PCR技术扩增得到一段901bp大小的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的acr基因，将纯化后的acr基因经限制性内切酶NdeI和BamHI消化后，与同样经过上述两种限制性内切酶消化的质粒pMA5-HapII连接(pMA5-HapII序列如SED ID NO：3所示)，构建重组质粒pMA5-HapII-acr，经双酶切验证后，表明该重组质粒构建成功。随后，利用引物P3和P4通过PCR扩增得到核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示的基因gapdh，将纯化后的acr基因经限制性内切酶MluI和BamHI消化后，与同样经过上述两种限制性内切酶消化的质粒pMA5-HapII连接，构建另一个重组载体pMA5-HapII-gapdh；然后以重组载体pMA5-HapII-gapdh为模板，利用引物P4和P5通过PCR技术扩增出带有启动子HapII的基因片段HapII-gapdh；最后，将该基因片段通过限制性内切酶Mlu I处理后，与同样经过Mlu I处理和去磷酸化处理的载体pMA5-HapII-acr在T4DNA连接酶的作用下16℃过夜连接，将连接液转化至大肠杆菌感受态E.coli JM109中，挑取阳性转化子，提取转化子中的质粒，经酶切验证并确认重组质粒pMA5-HapII-acr-HapII-gapdh构建成功。将重组质粒pMA5-HapII-acr-HapII-gapdh以电击转化的方法转化至解淀粉芽孢杆菌，挑取阳性转化子，即得到重组解淀粉芽孢杆菌pMA5-HpaII-acr-HapII-gapdh／B.amyloliquefaciens。对原始菌以及重组菌pAG胞内蛋白表达分析可以看出，基因gapdh和acr在重组菌pAG成功实现过量表达。
以B.amyloliquefaciens基因组总DNA为模板，设计两条引物，PCR扩增引物设计如下：
P1：5’-CGCATATGATGAAAGCGGCAAGATGGC-3’   (Nde I)，
P2：5’-CGGGATCCTTAATTCGGTTTTACTAAG-3’   (BamH I)。
P3：5’-CGGGATCCATGAAGGTAAAAGTAGC-3’   (BamH I)，
P4：5’-CGACGCGTCTACACAGCTGACGGGTG-3’   (Mlu I)，
P5：5’-CGACGCGTTTTTGAGTGATCTTCTC-3’   (Mlu I)
实施例3：菌原始菌及重组菌的发酵性能验证
(1)种子培养
从活化平板上挑取单菌落接种于种子培养基中，种子培养温度37℃，摇床转速160r／min，培养时间为12h左右，种子培养基组成：酵母提取物5g／L，胰蛋白胨10g／L，NaCl10g／L。
(2)发酵培养
初始发酵培养体积为2.5L，采用的发酵培养基成分如下：
发酵培养基成分：葡萄糖160g/L，玉米浆5g／L，尿素3g/L，柠檬酸钠6g/L，K2HPO44g／L，MgSO40.2g/L；将上述发酵培养基用5mol／L的NaOH调节其pH至6.5，在121℃下高温灭菌30min。
发酵发酵条件：将上述培养好的种子液按4％接种量接种于发酵培养基中进行发酵培养，发酵温度37℃，空气流量为120m3／h·m3培养基，搅拌转速为350r／min。定时取样测定细胞浓度、底物残留量和3-羟基-2-丁酮产量。发酵结束后，发酵液中产物2，3-丁二醇和乙偶姻用气相色谱测定(GC-1690J气相色谱仪，杭州科晓化工仪器公司)。色谱条件如下：毛细管柱，30m×0.32mn色谱柱中固定液为AT.SE-30，，检测器为FID，柱温150℃，汽化室与检测器的温度均为250℃，载气为N2，流速0.1Mpa，进样量2μL，采用外标法定量。利用液相色谱分析发酵液中有机酸含量。色谱条件：色谱柱为KC-811，流动相A为4mM高氯酸，流动相B为超纯水，流动相梯度为0～7.5min25％～75％A，7.51～15min75％A，流动相流速为1.0mL／min，紫外检测波长为210nn，进样量为20μl，柱温为60℃。结果如表1所示，与原始菌株相比，重组菌2，3-丁二醇产量提高了14.7％，副产物如3-羟基-2-丁酮、乳酸和丁二酸的积累分别降低65.6％、43.8％和42.4％，且发酵周期有所缩短。
(3)补料流加发酵培养
种子培养基发酵培养条件和实施例3(1)和3(2)相同，当发酵液中葡萄糖残留浓度低于20g/L，通过补料泵一次性补加60-70g/L左右的葡萄糖，当葡萄糖消耗速率低于6g／L·h时停止补料，当残留在发酵液中的葡萄糖被消耗完时结束发酵。通过补料流加发酵，2，3-丁二醇产量达到121.3g/L。
表1原始菌以及重组菌pAG发酵生产2，3-丁二醇性能比较

Claims (2)

1.一种加强辅酶循环再生速率的重组解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)，其特征在于：将SEQ ID NO：1所示的3-羟基-2-丁酮还原酶基因acr和SEQ ID NO：2所示的3-磷酸甘油醛脱羧酶基因gapdh共同克隆到穿梭载体pMA5-HpaII构建成为重组穿梭表达质粒pMA5-HpaII-acr-HapII-gapdh并转化至保藏编号为CCTCC NO：M2012349的解淀粉芽孢杆菌中，从而提高解淀粉芽孢杆菌合成2，3-丁二醇的能力。
2.权利要求1所述的加强辅酶循环再生速率的重组解淀粉芽孢杆菌用于2，3-丁二醇发酵上的应用。
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