CN103599070B - 负载金纳米簇和抗癌药物的脂质体温度荧光探针的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及负载金纳米簇和抗癌药物的脂质体温度荧光探针的制备方法，该方法具体包括以下步骤：1)以二硫辛酸为保护剂，氯金酸为原料，硼氢化钠为还原剂，采用微波热解法水相制备出近红外发射的荧光金纳米簇；2)用氯仿与甲醇的混合溶剂溶解卵磷脂和胆固醇，旋转蒸发溶剂制得薄层磷脂干膜，然后用金纳米簇悬浊液和抗癌药物水溶液溶解，采用超临界二氧化碳法孵化，制备出内水相负载金纳米簇和抗癌药物的脂质体悬浊液。与现有技术相比，本发明方法简单，成本较低，制备的脂质体药物载体具有光致热敏性，荧光强度的温敏性，可发展成一种新颖的基于脂质体药物载体的温度荧光探针，对于其它药物载体的制备及应用都具有十分重要的参考价值。
Description
技术领域
本发明属于生物材料与纳米医药技术领域，具体涉及一种基于负载金纳米簇和抗癌药物的脂质体温度荧光探针的制备方法。
背景技术
脂质体(liposome)是指以磷脂为膜材，外加辅助剂组成的封闭囊泡，具有类似于生物膜的双分子层结构，可以包封水溶性或脂溶性药物于囊内而成为一种新型的药物载体。脂质体的基本组分为磷脂，它是生物体的固有成分，能够在体内经生物转化而降解，无毒性及免疫原性。鉴于脂质体具有提高药物稳定性，减少药物用量，降低毒性，减轻免疫反应，延缓释放，降低体内消化速度，改变药物在体内分布等诸多优点，脂质体被认为是目前最具发展前途的药物载体之一，可广泛用于肿瘤、感染性疾病、心血管疾病和皮肤病等常见病症的临床治疗。
金纳米材料具有独特的物理及化学性质，由于一定尺寸的金纳米球或纳米团簇表面的等离子体共振效应，使其在近红外区有吸收峰，尤其是制备出的特定尺寸金纳米簇，可以发射近红外的荧光，且在某一特定波长光照射下，该金纳米簇会发热即表现出显著的光致热敏效应(如：Xueqin An，Fan Zhang，Yinyan Zhu，Weiguo，Shen，Chem.Comm.，2010，46，7202-7204；Yan Ma，Xiaolong Liang，Sheng Tong，Gang Bao，Qiushi Ren，Zhifei Dai，Adv.Funct.Mater.，2013，23，815-822)。基于此，若制备的金纳米簇同时具有近红外荧光和光致热敏功能，及低毒性，将在生物荧光示踪或成像、肿瘤热疗、光致热敏药物载体等领域展现出重要的应用价值。
将上述金纳米簇和抗癌药物同时负载进入脂质体内水相中，可获得一种新型多功能脂质体药物载体。其中，可采用某一波长光照射使金纳米簇发热，进而使脂质体双分子膜层结构发生转变，内水相中的抗癌药物开始释放，实现了光致热敏药物控制释放。此外，金纳米簇的荧光(近红外荧光最佳，避开生物自体荧光干扰)是热敏的，即随环境温度升高而荧光强度减弱，通过控制金纳米簇尺寸及在脂质体中的比例，有望获得温度与荧光强度的线性关系，即获得基于负载荧光纳米粒和药物的脂质体载体的温度荧光探针，尤其是用作细胞内的具有光控释药功能的温度荧光探针，展现出巨大的应用前景。
迄今为止，有关多功能脂质体纳米载体的制备方法已有中国专利报道。例如：贺蓉等将量子点和5-氟尿嘧啶分散在脂质体内部，采用薄膜挤出器通过聚碳酸酯膜制备了纳米脂质体(公开号CN101327189A)；储茂泉等采用薄膜分散法制成脂质为膜，量子点为核的脂质体，然后在脂质体表面形成二氧化硅制得脂质体包埋量子点的微球(公开号CN101362066A)；万锕俊等制备了内水相负载磁纳米粒和碳量子点的pH及热双敏感性脂质体(公开号CN103041409A)。
尽管以上示例中提及了多功能脂质体纳米药物载体的制备方法，但某些关键的技术问题依然亟待解决，如制备工艺复杂，功能组分的毒性，脂质体的多功能化，以及药物释放的可控性等。因此，发展一种制备简单、成本低、多功能化的脂质体，对于发展高质量脂质体载药体系的研究及应用都具有十分重要的意义。截至目前，尚未见负载光致热敏荧光纳米材料的脂质体，同时负载荧光金纳米团簇与抗癌药，以及基于脂质体药物载体的温度荧光探针的相关中国专利报道。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种方法简单，快速、成本低的负载金纳米簇和抗癌药物的脂质体温度荧光探针的制备方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种负载金纳米簇和抗癌药物的脂质体温度荧光探针的制备方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：
(1)配置二硫辛酸水溶液，用氢氧化钠调节至碱性，加入氯金酸配成均质混合液，在快速搅拌下逐滴加入硼氢化钠水溶液，将此反应混合液转入微波反应器中反应一段时间，反应混合液冷却至室温，高速离心，超滤分离，最后将沉积物分散在磷酸缓冲液中，制得金纳米簇分散液：
(2)卵磷脂与胆固醇溶解在氯仿-甲醇混合溶剂中，旋转蒸发溶剂成脂质体膜，加入金纳米簇分散液与抗癌药物水溶液，转入高压反应釜中，通入二氧化碳气体，调节釜内温度和压力后作用一段时间，释放釜内气体，得到澄清透明溶液，即内水相负载金纳米簇和抗癌药物的脂质体分散液；
(3)采用近红外光照射此脂质体分散液，用电子温度计记录不同照射时间点脂质体分散液的温度，然后在不同温度下测定脂质体分散液的荧光强度，构建基于不同照射时间与温度，温度与荧光强度的关系，着重构建出基于此多功能脂质体药物载体的温度荧光探针。
步骤(1)中所述的反应混合液中二硫辛酸／氯金酸／硼氢化钠的摩尔比为10：1：1～100：1：2，pH为8～10，微波反应器的功率180～250W，反应时间1～10min，超滤分离所用滤膜剪切分子量10～20kDa。
步骤(2)中所述的卵磷脂／胆固醇摩尔比1：1～5：1，氯仿／甲醇体积比为1：1～5：1，脂质体膜／金纳米簇／抗癌药物质量比5：1：1～10：1：5，所述的抗癌药物为水溶性紫杉醇、阿霉素、黄连素或顺铂，高压反应釜的釜内温度25～60℃，釜内压力10～20MPa，高压反应釜内原料的孵化时间10～60min。
步骤(3)中所述的近红外光波长808～980nm，照射光强度1～10W，照射时间0～10min，温度变化区间15～50℃，荧光强度变化幅度100～20％，脂质体分散液作为探针的质量浓度0.1～10mg·mL-1。
本发明微波热解法制备出荧光金纳米簇，然后采用超临界二氧化碳法将金纳米簇分散液和水溶性抗癌药物与脂质体膜一并在一定的温度和压力下孵化，制得内水相负载荧光金纳米簇和抗癌药物的脂质体。与现有技术相比，本发明方法简单，成本较低，制备的脂质体药物载体具有光致热敏性，荧光强度温敏性，可发展成一种新颖的基于脂质体药物载体的温度荧光探针，对于其它药物载体制备及应用都具有十分重要的参考价值。
附图说明
图1为不同光照时间下负载金纳米簇和抗癌药物的脂质体温度的变化；
图2为该脂质体的荧光强度随温度变化的关系；
图3为该脂质体的荧光强度与温度的线性拟合。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
负载金纳米簇和抗癌药物的脂质体温度荧光探针的制备方法，详细的制备步骤过程如下：称取50mmol二硫辛酸加入20mL去离子水中，用氢氧化钠调节至pH8.0，依次加入2.5mmol氯金酸和5mmol硼氢化钠，磁力搅拌混合均匀。然后转入微波反应器中，在180W功率下反应5min，反应结束后产物冷却至室温20℃，离心分离，用15kDa剪切分子量滤膜过滤，得到沉淀物并将其分散在1mM磷酸缓冲液中(pH7.4)，分散液即为金纳米簇分散液，在4℃下保存或用于后续实验。
称取3mmol卵磷脂和1mmol胆固醇溶于由15mL氯仿和5mL甲醇组成的混合溶剂中，磁力搅拌配成均质溶液，在37℃和N2气氛下旋转蒸发溶剂得到薄层磷脂膜，真空干燥制成干膜(～10mg)，加入1mL浓度为1.0mg·mL-1的金纳米簇分散液和2mL浓度为1.0mg·mL-1的紫杉醇水溶液，配置成混合反应液，然后转入高压反应釜中，通入CO2气体，调节压力位15MPa，温度为40℃，反应时间30min，反应结束后，缓慢释放釜内气体，得到澄清透明溶液，即为负载金纳米簇和紫三醇的脂质体悬浊液。
采用808nm激光(2W)照射该脂质体悬浊液1～10min，用电子温度计记录每10s时间点的悬浊液温度(如图1所示)，并采用荧光光谱仪测定不同温度下的荧光发射光谱，激发波长为575nm(如图2所示)，拟合荧光发射光谱中705nm波长处为荧光强度与温度的线性关系(如图3所示)。
实施例2
称取50mmol二硫辛酸加入20mL去离子水中，用氢氧化钠调节至pH8.5，依次加入5mmol氯金酸和5mmol硼氢化钠，磁力搅拌混合均匀。然后转入微波反应器中，在200W功率下反应5min，反应结束后产物冷却至室温20℃，离心分离，用15kDa剪切分子量的滤膜过滤，得到沉淀物并将其分散在1mM磷酸缓冲液中(pH7.4)，分散液即为金纳米簇分散液，在4℃下保存或用于后续实验。
称取4mmol卵磷脂和1mmol胆固醇溶于由20mL氯仿和5mL甲醇组成的混合溶剂中，磁力搅拌配成均质溶液，在37℃和N2气氛下旋转蒸发溶剂得到薄层磷脂膜，真空干燥制成干膜(～10mg)，加入1mL浓度为1.0mg·mL-1的金纳米簇分散液和5mL浓度为1.0mg·mL-1的黄连素水溶液，配置成混合反应液，然后转入高压反应釜中，通入CO2气体，调节压力位16MPa，温度为45℃，反应时间30min，反应结束后，缓慢释放釜内气体，得到澄清透明溶液，即为负载金纳米簇和紫三醇的脂质体悬浊液。该脂质体的表征与研究方法均与实施例1相同。
实施例3
称取50mmol二硫辛酸加入20mL去离子水中，用氢氧化钠调节至pH9.0，依次加入1mmol氯金酸和2mmol硼氢化钠，磁力搅拌混合均匀。然后转入微波反应器中，在200W功率下反应3min，反应结束后产物冷却至室温20℃，离心分离，用10kDa剪切分子量的滤膜过滤，得到沉淀物并将其分散在1mM磷酸缓冲液中(pH7.4)，分散液即为金纳米簇分散液，在4℃下保存或用于后续实验。
称取5mmol卵磷脂和1mmol胆固醇溶于由25mL氯仿和5mL甲醇组成的混合溶剂中，磁力搅拌配成均质溶液，在37℃和N2气氛下旋转蒸发溶剂得到薄层磷脂膜，真空干燥制成干膜(～10mg)，加入1mL浓度为1.0mg·mL-1的金纳米簇分散液和5mL浓度为1.0mg·mL-1的顺铂水溶液，配置成混合反应液，然后转入高压反应釜中，通入CO2气体，调节压力位18MPa，温度为50℃，反应时间45min，反应结束后，缓慢释放釜内气体，得到澄清透明溶液，即为负载金纳米簇和紫三醇的脂质体悬浊液。该脂质体的表征与研究方法均与实施例1相同。
实施例4
称取50mmol二硫辛酸加入20mL去离子水中，用氢氧化钠调节至pH8.0，依次加入2mmol氯金酸和2mmol硼氢化钠，磁力搅拌混合均匀。然后转入微波反应器中，在180W功率下反应5min，反应结束后产物冷却至室温20℃，离心分离，用10kDa剪切分子量的滤膜过滤，得到沉淀物并将其分散在1mM磷酸缓冲液中(pH7.4)，分散液即为金纳米簇分散液，在4℃下保存或用于后续实验。
称取5mmol卵磷脂和1mmol胆固醇溶于由15mL氯仿和5mL甲醇组成的混合溶剂中，磁力搅拌配成均质溶液，在37℃和N2气氛下旋转蒸发溶剂得到薄层磷脂膜，真空干燥制成干膜(～10mg)，加入1mL浓度为1.0mg·mL-1的金纳米簇分散液和1mL浓度为1.0mg·mL-1的阿霉素水溶液，配置成混合反应液，然后转入高压反应釜中，通入CO2气体，调节压力位20MPa，温度为60℃，反应时间30min，反应结束后，缓慢释放釜内气体，得到澄清透明溶液，即为负载金纳米簇和紫三醇的脂质体悬浊液。该脂质体的表征与研究方法均与实施例1相同。
实施例5
一种负载金纳米簇和抗癌药物的脂质体温度荧光探针的制备方法，该方法具体包括以下步骤：
(1)配置二硫辛酸水溶液，用氢氧化钠调节至碱性，加入氯金酸配成均质混合液，在快速搅拌下逐滴加入硼氢化钠水溶液，将此反应混合液转入微波反应器中反应一段时间，反应混合液冷却至室温，高速离心，超滤分离，最后将沉积物分散在磷酸缓冲液中，制得金纳米簇分散液；所述的反应混合液中二硫辛酸／氯金酸／硼氢化钠的摩尔比为50：1：2，pH为10，微波反应器的功率250W，反应时间1～10min，超滤分离所用滤膜剪切分子量20kDa。
(2)卵磷脂与胆固醇溶解在氯仿-甲醇混合溶剂中，旋转蒸发溶剂成脂质体膜，加入金纳米簇分散液与抗癌药物水溶液，转入高压反应釜中，通入二氧化碳气体，调节釜内温度和压力后作用一段时间，释放釜内气体，得到澄清透明溶液，即内水相负载金纳米簇和抗癌药物的脂质体分散液；所述的卵磷脂／胆固醇摩尔比1：1，氯仿／甲醇体积比为1：1，脂质体膜／金纳米簇／抗癌药物质量比5：1：1，所述的抗癌药物为阿霉素，高压反应釜的釜内温度25℃，釜内压力10MPa，高压反应釜内原料的孵化时间10～60min。
(3)采用近红外光照射此脂质体分散液，用电子温度计记录不同照射时间点脂质体分散液的温度，然后在不同温度下测定脂质体分散液的荧光强度，构建基于不同照射时间与温度，温度与荧光强度的关系，着重构建出基于此多功能脂质体药物载体的温度荧光探针。所述的近红外光波长980nm，照射光强度1～10W，照射时间0～10min，温度变化区间15～50℃，荧光强度变化幅度100～20％，脂质体分散液作为探针的质量浓度0.1～10mg·mL-1。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种负载金纳米簇和抗癌药物的脂质体温度荧光探针的制备方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：
(1)配置二硫辛酸水溶液，用氢氧化钠调节至碱性，加入氯金酸配成均质混合液，在快速搅拌下逐滴加入硼氢化钠水溶液，将此反应混合液转入微波反应器中反应一段时间，反应混合液冷却至室温，高速离心，超滤分离，最后将沉积物分散在磷酸缓冲液中，制得金纳米簇分散液；
(2)卵磷脂与胆固醇溶解在氯仿-甲醇混合溶剂中，旋转蒸发溶剂成脂质体膜，加入金纳米簇分散液与抗癌药物水溶液，转入高压反应釜中，通入二氧化碳气体，调节釜内温度和压力后作用一段时间，释放釜内气体，得到澄清透明溶液，即内水相负载金纳米簇和抗癌药物的脂质体分散液；
(3)采用近红外光照射此脂质体分散液，用电子温度计记录不同照射时间点脂质体分散液的温度，然后在不同温度下测定脂质体分散液的荧光强度，构建基于不同照射时间与温度，温度与荧光强度的关系，构建出基于此多功能脂质体药物载体的温度荧光探针；
步骤(2)中所述的卵磷脂/胆固醇摩尔比1:1～5:1，氯仿/甲醇体积比为1:1～5:1，脂质体膜/金纳米簇/抗癌药物质量比5:1:1～10:1:5，所述的抗癌药物为水溶性紫杉醇、阿霉素、黄连素或顺铂，高压反应釜的釜内温度25～60℃，釜内压力10～20MPa，高压反应釜内原料的孵化时间10～60min。
2.根据权利要求1所述的一种负载金纳米簇和抗癌药物的脂质体温度荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的反应混合液中二硫辛酸/氯金酸/硼氢化钠的摩尔比为10:1:1～100:1:2，pH为8～10，微波反应器的功率180～250W，反应时间1～10min，超滤分离所用滤膜剪切分子量10～20kDa。
3.根据权利要求1所述的一种负载金纳米簇和抗癌药物的脂质体温度荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的近红外光波长808～980nm，照射光强度1～10W，照射时间0～10min，温度变化区间15～50℃，荧光强度变化幅度100～20％，脂质体分散液作为探针的质量浓度0.1～10mg·mL-1。
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