CN103589796A - 鉴定人类胎儿和成人角膜内皮细胞新的分子标记物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种鉴定人类胎儿和成人角膜内皮细胞（cornealendothelialcells,CECs）新的分子标记物的方法，确定了245个在胎儿期角膜内皮细胞和284个在成人期角膜内皮细胞高表达的特异基因，鉴定了四个新的胎儿和成人角膜内皮细胞的分子标记物为Wnt5a、S100A4、S100A6和IER3。本发明提供的一种鉴定胎儿和成人角膜内皮细胞的方法，通过该方法确认了四个新的胎儿和成人角膜内皮细胞的分子标记物为Wnt5a、S100A4、S100A6和IER3。角膜内皮细胞（CECs）发育过程中阶段特异性标记物的确定将对定义由干细胞分化而来的CECs以及细胞替代治疗角膜内皮相关疾病具有重要意义，弥补了现有技术中鉴定人角膜内皮细胞的标记物不足的缺憾。

Description

鉴定人类胎儿和成人角膜内皮细胞新的分子标记物的方法
技术领域
本发明涉及生物医学领域，更具体地，涉及鉴定人类胎儿和成人角膜内皮细胞新的分子标记方法。
背景技术
角膜内皮细胞（corneal endothelial cells, CECs）位于角膜最内层，为一单层六角形立方上皮，胞质内细胞器含量丰富，细胞间连接紧密，主要为缝隙连接，具有良好的屏障作用。角膜内皮细胞膜上存在Na+-K+-ATP酶，该酶参与钠、钾离子的交换过程，主动将Na+转至细胞外，并将K+泵入细胞内，从而维持细胞膜内外的离子浓度梯度。角膜内皮细胞Na+-K+-ATP酶在进行离子转运的同时，也将水分子从基膜侧（基质）转运到顶膜侧（房水），以抵消基质通过角膜上皮和内皮时被动性水吸收带来的肿胀趋势，从而维持角膜基质的相对脱水状态和角膜的透明性。成人角膜内皮细胞失去有丝分裂能力，细胞停留在G1期。由遗传性疾病、创伤和老化等导致的角膜内皮细胞缺陷将导致角膜不可逆水肿、失去透明性并最终导致失明。
角膜内皮细胞的遗传性紊乱，包括富克斯角膜内皮营养不良（Fuchs endothelial coneal dystrophy, FECD）、后部多形性角膜营养不良（posterior polymorphous coneal dystrophy, PPCD）、先天遗传性内皮营养不良1型和2型（congenital hereditary endothelial dystrophy type 1 and 2, CHED1 and CHED2）、X连锁性角膜内皮营养不良（X-linked endothelial corneal dystrophy, XECD）等。近年来，有关这些遗传性角膜营养不良症的遗传学机制有了陆续的研究和报道。比如，有研究指出，后弹力层（由角膜内层上皮细胞分泌而来）的主要组成成分—VIII A2型胶原蛋白（COL8A2)—的变异，与早期FECD及PPCD相关；而溶质携带物家族A11 (SLC4A11)的变异与迟发性FECD及PPCD2相关。鉴于目前的研究现状，更多的靶基因有待发现。
临床上，除了移植整个角膜，内角膜移植术和后弹力层角膜内皮移植术等眼科手术也可以用于替代功能性失调CECs，但均存在供体细胞来源缺乏和免疫排斥等问题。干细胞的发展为获得功能性的CECs提供了全新的思路，有研究者从神经嵴细胞分化得到CECs，以及有用人类成体干细胞，比如角膜内皮基质干细胞、间充质干细胞、骨髓内皮祖细胞分化得到CECs的报道。理论上讲，通过体外多能干细胞（人类胚胎干细胞或诱导多能干细胞）分化，可以获得无限量的CECs用于细胞替代治疗。
目前，研究者多以蛋白标记物用于鉴定成人CECs，这些蛋白多与细胞黏附、缝隙连接以及泵功能相关，比如N-钙黏着蛋白（N-cadherin）、间隙连接蛋白43（connesin-43）、ZO-1、Na+-K+-ATP酶（Na+-K+-ATPase）和密封蛋白（Occludin）等。但是，与CECs成熟过程相关的分子通路和胎儿/成体CECs特异的分子标记物的研究少之又少。
发明内容
本发明解决了现有技术中鉴定人角膜内皮细胞的标记物的不足，提供一种基于RNA-Seq技术及生物信息学分析用于鉴定人类胎儿和成人角膜内皮细胞新的分子标记物的方法。
本发明的技术方案为：一种鉴定人类胎儿和成人角膜内皮细胞新的分子标记物的方法，包括以下几步：
（1）胎儿和成人角膜内皮细胞中组织特异性基因表达
A：从Illumina系统的RNA-Seq公共数据库中获得12种不同类型细胞和组织，共计97个样本；
B：确定了245个在胎儿期角膜内皮细胞和284个在成人期角膜内皮细胞高表达的特异基因；
（2）胎儿和成人角膜内皮细胞之间基因差异性表达
C：比较成人和胎儿角膜内皮细胞表达谱，分别得到了在成人和胎儿角膜内皮细胞中高表达的518个和668个基因；
D：通过GO基因注释分析和KEGG通路分析，得到S100蛋白家族在成人角膜内皮细胞中的表达量高，所述S100蛋白家族为钙结合蛋白，其包括S100A4, S100A5和S100A6；
（3）在蛋白水平验证并确认成人和胎儿的角膜内皮细胞中的阶段特异性标记基因
E：检测Wnt信号通路组分，基因分析结果显示，参与Wnt信号通路的基因在胎儿角膜内皮细胞高度富集，而免疫组化结果显示，该信号通路的胞内信号分子在成人和胎儿角膜内皮细胞中均表达；但是Wnt5a只在胎儿角膜内皮细胞表达，而在成人角膜内皮细胞不表达，说明在蛋白水平，Wnt5a通路仅在胎儿角膜内皮细胞发挥功能而在成人角膜内皮细胞并无此功能，即Wnt5a是成人和胎儿角膜内皮细胞的新标记物；
F：通过免疫组化验证了，所述S100A4和S100A6蛋白在成人膜内皮细胞和胎儿角膜上皮细胞表达，而在胎儿角膜内皮细胞不表达，得到S100A4和S100A6钙结合蛋白是两个区分成人和胎儿角膜内皮细胞的新标记物；
G：检测成人和胎儿角膜内皮细胞高表达的蛋白在细胞中定位，结果显示在角膜内皮细胞成熟过程中，以应激诱导蛋白IER3为代表的胞内蛋白的新定位，免疫组化结果显示，IER3在胎儿和成人角膜内皮细胞中均有表达，但在亚细胞定位表达完全相反，IER3在成体角膜内皮细胞，定位于细胞质中，而在胎儿角膜内皮细胞则定位于细胞核中，IER3为判定角膜内皮细胞发育程度的蛋白标记物。
本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，所述的245个在胎儿期角膜内皮细胞高表达的特征基因参与胞外基质结构组成、血小板来源生长因子结合和生长因子活性。
本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，所述的284个在成人期角膜内皮细胞高表达的特征基因参与调节无机阴离子的跨膜转运活性、转录因子活性和细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制因子的活性。
本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，步骤C中得到了在成人和胎儿角膜内皮细胞中高表达的518个和668个基因，是基因表达倍数界限提至5倍变化数，以此为分析标准而得到的。
本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，参与代谢过程的基因在所述成人角膜内皮细胞中高表达的518个基因中是上调的。
本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，所述胎儿角膜内皮细胞中高表达的668个基因参与金属肽酶活性、胞外结构和TGF-beta信号。
本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，步骤（2）胎儿和成人角膜内皮细胞之间基因差异性表达在角膜内皮细胞发育成熟的过程中在选定的信号通路上存在转录变化。
本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，所述S100蛋白家族的mRNA仅在成人角膜内皮细胞高表达。
本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，在TGF-beta和Wnt信号通路中表达特异基的标记物因包括以下一种或几种：S100A4、S100A5、S100A6和Wnt5a。
本发明的解决了现有技术的缺陷，具有以下有益效果：本发明提供的一种鉴定胎儿和成人角膜内皮细胞的方法，通过该方法确认了四个新的胎儿和成人角膜内皮细胞的分子标记物为Wnt5a、S100A4、S100A6和IER3。角膜内皮细胞（CECs）发育过程中阶段特异性标记物的确定将对定义由干细胞分化而来的CECs以及细胞替代治疗角膜内皮相关疾病具有重要意义，弥补了现有技术中鉴定人角膜内皮细胞的标记物不足的缺憾。
附图说明
图1：成体和胎儿CECs新的特异标记物Wnt5a的免疫荧光检测。
图2：成体和胎儿CECs新的特异标记物S100A4的免疫荧光检测。
图3：成体和胎儿CECs新的特异标记物S100A6的免疫荧光检测。
图4：成体和胎儿CECs新的特异标记物IER3的免疫荧光检测。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明，并使本发明的上述优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
（1）本发明提供了胎儿和成体CECs中组织特异性基因的表达
为了更好地研究胎儿和成体CECs的特异标记物，首先用RNA-Seq技术分析了3个成体和2个胎儿的CECs转录组，得到了179百万个与参考序列相对应的特异reads（一个read代表一段序列）。为了确定胎儿和成体特异的基因，从公共数据库中获得了12种不同类型细胞和组织（共计97个样本），为避免可能的平台偏差，我们仅选择Illumina系统的RNA-Seq数据。
聚类分析结果显示胎儿CECs更接近于相对不成熟的细胞类型，比如hESCs、神经前体细胞（NPC）和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）。相反，成体CECs离这些早期阶段细胞关系较远，而与其他分化完全的体细胞较近。通过主成份分析发现，成人CECs离成体脑组织更近，这与CECs来源于神经嵴细胞是吻合的。总之，相同细胞类型聚类在一起说明了每种细胞类型具有明确的转录模式。特别指出的是，与其他细胞相比，成体和胎儿CECs聚类更相近，显示CECs也具有自身特异的转录模式。
为进一步确定成体和胎儿CECs与其他类型细胞分子标记的不同，通过统计学分析方法（单因素方差分析或ANOVA）确定了在成体或胎儿CECs特定过表达的基因。以方差分析Tukey-Kramer多重比对校正后的p-values<0.01，以及与其他所有12种组织相比表达倍数变化≥2为标准，分别确定了245个在胎儿期CECs和284个在成人期CECs高表达的特异基因。GO基因注释分析（Gene ontology，GO）显示，在成体CECs表达上调的284个基因主要参与调节无机阴离子的跨膜转运活性、转录因子活性和cyclin依赖性蛋白激酶抑制因子的活性等成熟CECs特有的功能。胎儿CECs特异的基因参与胞外基质结构组成、血小板来源生长因子结合和生长因子活性。这些结果显示胎儿CECs发育过程中，胎儿CECs具有参与生长因子活性的功能特性。
然后，用系统方法研究了成人或胎儿CECs是否表达特异的转录网络（或模块），用权重基因共表达网络分析方法（WGCNA），确定了代表成人CECs（n=300）和胎儿CECs（n=343）转录组的一些单个模块。将此结果与单个基因统计分析结果相比较，发现有很好的一致性：成人CECs重合率为70%（n=209），胎儿CECs为44%（n=160）。综上，多方法分析结果显示这些胎儿和成人CECs特异的基因表达谱是高度特异的。
WGCNA分析也可以衡量基因与特定模块的相似性（或者关系）。一个单元中，关系密切的基因一般认为是关键基因，即在网络中发挥重要作用。在成体CECs，确定了SLC4A11作为关键基因中的最重要的一个基因。资料表明SLC4A11与遗传性角膜营养不良相关，体外培养CECs中，敲除该基因会诱发凋亡。因此，网络分析结果有助于完善和评估成人或胎儿CECs网络中的关键基因。提供了成人和胎儿CECs阶段特异关键基因的排序。简言之，以上分析结果清晰的描绘了成人和胎儿CECs中的转录特征，而所检验的其它类型细胞或组织包括其他类型内皮细胞中并没有这些特征。
（2）本发明提供了成人和胎儿CECs之间基因差异性表达模式
通过比较成人和胎儿CECs表达谱，以基因表达倍数变化≥2为标准，分别在成人和胎儿CECs中确定了688个和1763个基因。为了增加特异性并确定两种CECs中表达差异性较大的基因，将界限提至5倍变化数，以此为分析标准，分别得到了在成人和胎儿CECs中高表达的518个和668个基因。需特别指出的是，差异表达基因的功能注释表明成人和胎儿CECs之间具有截然不同的功能。例如，GO分析和KEGG通路分析确定了参与代谢过程的基因在成人CECs中是上调的，而在胎儿CECs中，这些基因主要参与金属肽酶活性、胞外结构和TGF-beta信号等。钙结合蛋白比如S100家族成员（S100A4, S100A5和S100A6）在成人CECs中表达量较高。结果显示，成人和胎儿CECs之间的基因表达存在明显的差异性，说明在CECs发育成熟过程中，在所选定的信号通路上存在转录的变化。
（3）本发明提供了利用蛋白水平验证并确认成人和胎儿CECs中的阶段特异性标记基因
尽管在mRNA水平，筛选并推定了诸多分子标记物以区分成人和胎儿CECs，但这些基因是否会在蛋白水平得到确认尚未可知。收集了胎儿和成人角膜组织用于免疫组化分析。结果与预想的一致，紧密连接蛋白ZO-1在成人（37岁以上）和胎儿（孕17周）CECs中均有表达。作为CECs泵功能最重要标记之一的钠钾ATP酶在成人CECs中高表达，而在胎儿CECs中并没有表达，钠钾ATP酶的免疫组化结果与RNA-Seq分析的结果是一致的，这说明孕17周时胎儿CECs的泵功能并没有完全确立。
然后，检测了Wnt信号通路的组分，该通路是视觉器官发育重要的调控因子。如图1所示，参与Wnt信号通路的基因在胎儿CECs高度富集，而免疫组化结果显示，该信号通路的胞内信号分子，比如axin2和beta-钙联蛋白在成人和胎儿CECs中均表达。但是Wnt5a只在胎儿CECs表达，而在成人CECs不表达，说明在蛋白水平，Wnt5a通路仅在胎儿CECs发挥功能而在成人CECs并无此功能。
如图2-3所示，S100蛋白家族由几种钙结合蛋白组成，参与调控细胞各项生理机能。我们发现S100蛋白家族成员（S100A4，S100A5和S100A6）的mRNA仅在成人CECs高表达。免疫组化结果也进一步验证了这一结论，S100A4和S100A6蛋白在成人CEC和胎儿角膜上皮细胞表达，而在胎儿角膜内皮细胞不表达。因此，确定S100A4和S100A6钙结合蛋白是两个区分成人和胎儿CECs的新标记物。
此外，检测了在成人和胎儿CECs高表达的蛋白在细胞中的定位。如图4所示，结果发现，在CEC成熟过程中，以应激诱导蛋白IER3为代表的胞内蛋白的新定位。免疫组化结果显示，IER3在胎儿和成人CECs中均有表达，但在亚细胞定位表达完全相反。IER3在成体CECs，定位于细胞质中，而在胎儿CECs，则定位于细胞核中。因此，IER3可以作为另一个判定CECs发育程度的蛋白标记物。
实施例
（1）获得成人和胎儿CED样品
成人角膜样品（年龄为分别为31、56和64岁）为自愿捐献的正常人角膜。胎儿CEC样品是从胎儿眼睛（16-18周龄）分离的。在显微镜下分离出整个角膜内皮层，立即放入用于提取RNA的试剂中。
（2）RNA的提取
应用RNeasy Micro Kit（Qiagne，USA）按操作说明提取成人和胎儿组织的RNA。应用Nanodrop分光光度计测提取到的成人和胎儿组织的RNA浓度。
（3）RNA-Seq库的构建和高通量测序
按照Illumina TruSeq RNA Sample Preparation Guide操作说明构建RNA-Seq库。RNA初始量为100ng，通过含有poly-T的微珠纯化mRNA，将mRNA片断化，用随机引物反转录合成双链cDNA，末端修复、加碱基A、连接测序接头及PCR扩增纯化等步骤，PCR纯化产物经Qubit Fluorometer (Invitrogen, USA)测浓度，稀释至浓度为10 nM，使用Illumina hi-Seq 2000测序仪进行测序。使用BWA软件将测序结果和hg19基因组进行比对。
（4）统计和生物信息学分析
对于所有的数据分析，我们先将比对好的转录本的read数量转换为RPKM，将RPKM＜1的基因过滤掉，再进行分位数标准化。通过 Student t-检验之后Storey的多重检验校正来算出假阳性率（FDR），平均倍数变化（fold-change）大于2和FDR ＜5%的基因为差异表达基因。所有的统计分析都是用Matlab的内置函数来运行；GO分析（Gene ontology）和KEGG通路分析都是由DAVID 生物信息在线软件来分析的。
（5）组织特异表达
我们从公共领域收集了多个样本的数据，这些数据都是由Illumina公司Solexa平台得到的，以降低平台的偏差。我们采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行统计分析，选择在成人或胎儿CEC样品特异高表达的基因。采用两个界限（cutoff）：1）杜克克莱默（Tukey-Kramer）多重比较校正的p值<0.01，对于不同的大小样本，这是一个相对保守的单因素方差分析方法；2）相对于其他所有类型的组织，CEC样品表达平均高于2倍。这些分析是由Matlab的内置函数anova1和multcomp来完成的。
（6）加权基因共表达网络分析（Weighted Gene Co-expression Network Analysis, WGCNA）
WGCNA是一个公用的R语言软件包，我们构建了一个签名的加权相关网络。简要地说，成对的相关性矩阵是由所有样品基因所有对之间产生的。该矩阵提高至power 12以产生邻接矩阵，用来计算拓扑重叠（TO），一个强大的和生物学意义的相互联系测量网络，在TO上运用平均连接的层次聚类分析将具有类似共表达的基因聚类在一起，模块成员用于计算每个基因i在模块q，即MMiq=cor(xi, Eq)，公式中xi为基因i的表达状态，Eq为模块q的eigengene。模块高的基因被认为是核心基因。
（7）免疫染色
成人和胎儿CEC组织室温下在4%的PFA中固定30分钟，30%蔗糖脱水过夜。OCT包被，用microtome-cryostat (Leica, USA)冰冻切片，厚度为10um。PBS洗三次后，0.4% Triton-X通透一小时，4.5%驴血清封闭，一抗4℃孵育过夜。所用的一抗为Wnt5a (Santa Cruz), S100A4 (Abnova), S100A6 (Abnova), IER3 (Abgent), ZO-1 (Invitrogen), Na+-K+-ATPase (Millipore), Axin2 (abcam), Beta-catenin (BD)。PBS清洗3次后，室温条件下荧光标记的二抗孵育一小时，核染用hoechst。用溶于50%的甘油浓度为5%的正丙硫醇封片。用荧光共聚焦显微镜（Leica TCS-SP; Leica Microsystems）拍照。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求所界定的保护范围为准。

Claims (9)

1.一种鉴定人类胎儿和成人角膜内皮细胞新的分子标记物的方法，其特征在于，包括以下几步：
（1）胎儿和成人角膜内皮细胞中组织特异性基因表达
A：从Illumina系统的RNA-Seq公共数据库中获得12种不同类型细胞和组织，共计97个样本；
B：确定了245个在胎儿期角膜内皮细胞和284个在成人期角膜内皮细胞高表达的特异基因；
（2）胎儿和成人角膜内皮细胞之间基因差异性表达
C：比较成人和胎儿角膜内皮细胞表达谱，分别得到了在成人和胎儿角膜内皮细胞中高表达的518个和668个基因；
D：通过GO基因注释分析和KEGG通路分析，得到S100蛋白家族在成人角膜内皮细胞中的表达量高，所述S100蛋白家族为钙结合蛋白，其包括S100A4, S100A5和S100A6；
（3）在蛋白水平验证并确认成人和胎儿的角膜内皮细胞中的阶段特异性标记基因
E：检测Wnt信号通路组分，基因分析结果显示，参与Wnt信号通路的基因在胎儿角膜内皮细胞高度富集，而免疫组化结果显示，该信号通路的胞内信号分子在成人和胎儿角膜内皮细胞中均表达；但是Wnt5a只在胎儿角膜内皮细胞表达，而在成人角膜内皮细胞不表达，说明在蛋白水平，Wnt5a通路仅在胎儿角膜内皮细胞发挥功能而在成人角膜内皮细胞并无此功能，即Wnt5a是成人和胎儿角膜内皮细胞的新标记物；
F：通过免疫组化验证了，所述S100A4和S100A6蛋白在成人膜内皮细胞和胎儿角膜上皮细胞表达，而在胎儿角膜内皮细胞不表达，得到S100A4和S100A6钙结合蛋白是两个区分成人和胎儿角膜内皮细胞的新标记物；
G：检测成人和胎儿角膜内皮细胞高表达的蛋白在细胞中定位，结果显示在角膜内皮细胞成熟过程中，以应激诱导蛋白IER3为代表的胞内蛋白的新定位，免疫组化结果显示，IER3在胎儿和成人角膜内皮细胞中均有表达，但在亚细胞定位表达完全相反，IER3在成体角膜内皮细胞，定位于细胞质中，而在胎儿角膜内皮细胞则定位于细胞核中，IER3为判定角膜内皮细胞发育程度的蛋白标记物。
2.根据权利要求1所述的鉴定人类胎儿和成人角膜内皮细胞新的分子标记物的方法，其特征在于，所述的245个在胎儿期角膜内皮细胞高表达的特征基因参与胞外基质结构组成、血小板来源生长因子结合和生长因子活性。
3.根据权利要求2所述的鉴定人类胎儿和成人角膜内皮细胞新的分子标记物的方法，其特征在于，所述的284个在成人期角膜内皮细胞高表达的特征基因参与调节无机阴离子的跨膜转运活性、转录因子活性和细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制因子的活性。
4.根据权利要求3所述的鉴定人类胎儿和成人角膜内皮细胞新的分子标记物的方法，其特征在于，步骤C中得到了在成人和胎儿角膜内皮细胞中高表达的518个和668个基因，是基因表达倍数界限提至5倍变化数，以此为分析标准而得到的。
5.根据权利要求4所述的鉴定人类胎儿和成人角膜内皮细胞新的分子标记物的方法，其特征在于，参与代谢过程的基因在所述成人角膜内皮细胞中高表达的518个基因中是上调的。
6.根据权利要求5所述的鉴定人类胎儿和成人角膜内皮细胞新的分子标记物的方法，其特征在于，所述胎儿角膜内皮细胞中高表达的668个基因参与金属肽酶活性、胞外结构和TGF-beta信号。
7.根据权利要求6所述的鉴定人类胎儿和成人角膜内皮细胞新的分子标记物的方法，其特征在于，步骤（2）胎儿和成人角膜内皮细胞之间基因差异性表达在角膜内皮细胞发育成熟的过程中在选定的信号通路上存在转录变化。
8.根据权利要求1所述的鉴定人类胎儿和成人角膜内皮细胞新的分子标记物的方法，其特征在于，所述S100蛋白家族的mRNA仅在成人角膜内皮细胞高表达。
9.根据权利要求1所述的鉴定人类胎儿和成人角膜内皮细胞新的分子标记物的方法，其特征在于，在TGF-beta和Wnt信号通路中表达特异基的标记物因包括以下一种或几种：S100A4、S100A5、S100A6和Wnt5a。
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