CN103589745B - 一种靶向敲除家蚕核型多角体病毒复制非必需基因的方法 - Google Patents

一种靶向敲除家蚕核型多角体病毒复制非必需基因的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种靶向敲除家蚕核型多角体病毒BmNPV复制非必需基因的方法，所述方法以BmNPV为材料，通过PCR对其一个复制非必需片段两端的同源序列进行扩增并克隆至载体pUC19中；通过重叠PCR法依次拼接BmNPV的IE1早期启动子、标记基因(EGFP)、终止序列SV40polyA，并克隆至上述载体pUC19获得重组转移载体pUC19-lef7-IE1-EGFP-SV40polyA-gp64；将该载体与野生BmNPV的基因组共转染BmN细胞，经同源重组获得带有荧光标记的重组病毒RBmNPV-EGFP；将其基因组DNA与不带有标记基因的转移载体pUC19-lef7-gp64共转染BmN细胞，通过同源重组获得不带有荧光标记基因的重组病毒RBmNPV。本发明解决了重组病毒基因组中带有标记基因的问题，提高了阳性重组病毒的筛选效率，且此标记基因可以被反复利用。

Description

一种靶向敲除家蚕核型多角体病毒复制非必需基因的方法
技术领域
本发明涉及DNA重组技术和基因打靶技术领域，特别涉及一种靶向敲除家蚕核型多角体病毒复制非必需基因的方法。
背景技术
基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初，胚胎干细胞(ES细胞)分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型。直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。也是研究基因功能的重要手段。现在基因敲除技术被广泛的应用于病毒基因组功能的研究中。所以一般设计一种替换型载体与病毒基因组共转染细胞来缺失基因。但是病毒基因组上留有标记基因的问题，还未进行全面的改善，这给病毒本身的功能带来了巨大的影响以及后续的病毒筛选也带来了很大的麻烦，因此我们采用两次同源重组的方法既缺失了靶基因又解决了病毒基因组上带有标记基因的难题，这为以后的科学实验有着重要的意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种可敲除家蚕核型多角体病毒BmNPV复制非必需基因的带有标记基因的转移载体pUC19-IE1-EGFP-SV40polyA及其制备方法。
为达到上述目的，本发明提供一种带有标记基因的转移载体的制备方法，所述方法包括以下步骤：
1)用PCR的方法依次获得基因：IE、EGFP、SV40polyA；
2)采用重叠PCR方法依次拼接IE1、EGFP, 以IE1-EGFP的连接产物作为亚基因与基因SV40polyA进行拼接，获得三联体基因IE1-EGFP-SV40polyA；
3)将步骤2)所得的三联体基因IE1-EGFP-SV40polyA克隆至载体pUC19中，获得转移载体pUC19-IE1-EGFP-SV40polyA；
4)转移载体pUC19-IE1-EGFP-SV40polyA转化DH5α大肠杆菌感受态细胞；
5)蓝白斑筛选(含氨苄青霉素 Ampicillin 的固体培养基)，挑取含有转移载体pUC19-IE1-EGFP-SV40polyA的白色菌落。
6)转移载体pUC19-IE1-EGFP-SV40polyA进行PCR和双酶切鉴定并送华大基因测序。
本发明进一步提供一种带有标记基因的转移载体，通过上述的方法制得。
本发明目的之二在于提供一种靶向敲除家蚕核型多角体病毒复制非必需基因的方法，以解决重组病毒基因组上含有标记基因的难题，且此标记基因可被重复利用。
为达到上述目的，本发明还提供一种靶向敲除家蚕核型多角体病毒复制非必需基因的方法，所述方法包括以下步骤：
1)抽提家蚕核型多角体病毒BmNPV基因组；
2)PCR方法获得复制非必需片段两端的同源序列LEF7、gp64；
3)将步骤2)所得的同源序列lef7、gp64克隆至上述的转移载体pUC19-IE1-EGFP-SV40polyA中，获得重组转移载体pUC19-lef7-IE1-EGFP-SV40polyA-gp64，并与家蚕核型多角体病毒基因组共转染BmN细胞，经同源重组获得带有EGFP标记(荧光蛋白标记基因)的重组病毒RBmNPV-EGFP，对该重组病毒RBmNPV-EGFP进行鉴定并扩大培养；
4)提取重组病毒RBmNPV-EGFP的基因组与无标记基因的转移载体pUC19-lef7-gp64(通过脂质体介导转染法)共转染BmN细胞；
5)筛选无标记基因的重组病毒RBmNPV，扩大培养用于后续实验。
本发明的有益效果：一是利用本发明构建的转移载体可以连续敲除BmNPV基因组中不同转录时相的复制非必需基因，无需构建太多的载体；二是选用绿色荧光蛋白(EGFP)作为标记基因，可以快速、直观地获得重组病毒；三是经两次同源重组解决了重组病毒基因组中含有标记基因的问题，且此标记基因可以重复使用，无需更换标记基因。
附图说明
图1 为IE1 、EGFP、SV40polyA三个基因的电泳图； M：10kb DNA标记；1：IE1的PCR产物； 2：EGFP的PCR产物；3：SV40polyA的PCR产物；
图2 为 IE1与EGFP的重叠PCR 的电泳图；M：10kb DNA标记； 1: IE1-EGFP的PCR产物；
图3 为 三联体基因IE1-EGFP-SV40polyA的电泳图；M：10kb DNA标记；1：IE1-EGFP-SV40polyA的PCR产物；
图4为转移载体pUC19-IE1-EGFP-SV40polyA的PCR及双酶切鉴定图；M：10kb DNA标记；1： pUC19-IE1-EGFP-SV40polyA的PCR产物； 2： pUC19-IE1-EGFP-SV40polyA的双酶切产物；
图5为转移载体pUC19-IE1-EGFP-SV40polyA-gp64的PCR及双酶切鉴定图；M：10kb DNA标记；1：pUC19-IE1-EGFP-SV40polyA-gp64的PCR产物；2：pUC19-IE1-EGFP-SV40polyA-gp64的双酶切产物；
图6为重组转移载体pUC19-lef7-IE1-EGFP-SV40polyA-gp64 的PCR及双酶切鉴定图；M：10kb DNA标记；1：pUC19-lef7-IE1-EGFP-SV40-gp64的PCR产物；2：pUC19-lef7-IE1-EGFP-SV40-gp64的双酶切产物；
图7为家蚕正常细胞的显微图；
图8为只转染了重组转移载体pUC19-lef7-IE1-EGFP-SV40polyA-gp64的家蚕细胞的显微荧光图；
图9为重组病毒RBmNPV-EGFP的基因组与重组转移载体pUC19-lef7-IE1-EGFP-SV40polyA-gp64共转染的显微荧光图；
图10为重组质粒pUC19-LEF7的PCR及双酶切鉴定图；M：10kb DNA标记；1：pUC19-LEF7的PCR产物；2：pUC19-LEF7的双酶切产物；
图11为无标记基因的转移载体pUC19-LEF7-GP64的PCR及双酶切鉴定图；M：10kb DNA标记；1：pUC19-LEF7-GP64的PCR产物；2：pUC19-LEF7-GP64的双酶切产物。
具体实施方式
应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。
在本说明书中，除非特别指明，否则所用技术术语为本领域中的普通技术人员常用术语；本说明书中未注明具体条件的实验方法是按常规实验方法；本说明书中所用的试验材料如无特别说明均为市售购买产品，各种试剂和培养基的成分和配制方法可参见常规实验手册中的操作。
通过对 BmNPV 基因组的分析与研究，推测BmNPV的50%左右的基因对于病毒在培养细胞中的增殖是非必需的。杆状病毒基因组可以较大区域的缺失，从而增加了外源基因表达的有效途径。此外，通过去除某些基因，如半胱氨酸蛋白酶(cysteine)、组织蛋白酶(cathepsin)、几丁质酶(chitinase)基因能增进重组蛋白的稳定性。本发明就以同时敲除组织蛋白酶(cathepsin)和几丁质酶(chitinase)为例来阐述发明内容。
组织蛋白酶(cathepsin)和几丁质酶(chitinase)是BmNPV的晚期表达基因，在基因组中处于相邻的位置，且转录方向相反，是家蚕核型多角体杆状病毒复制的非必需基因，据相关文献报道敲除之后对病毒基因的复制没有影响。
下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。
实施例1： 转移载体pUC19-IE1-EGFP-SV40polyA的构建：
1、以高珍等构建的重组质粒PSK-IE1-EGFP (高珍，洪叶挺，周芳等. 家蚕BmAGO1基因的克隆、表达分析及其结合RNA的分离与鉴定[OL].  [2012-01-09]. 中国科技论文在线，http://www.paper.edu.cn/index.php/default/releasepaper/content/201201-252)为模板分别设计：
(IE-1)F:5- TTT GTCGAC AGTCGTTTGGTTGTTCACGATCG-3 (加粗倾斜部分为SalI 的酶切位点)
(IE-1)R:  5-CTCGCCCTTGCTCACCATGATTTGCAGTTCGGGACATAAAT-3
(EGFP)F: 5-TTATGTCCCGAACTGCAAATCATGGTGAGCAAGGGCGAG-3
(EGFP)R: 5-AATGTGGTATGGCTGATTATGATCTTACTTGTACAGCTCGTC-3
(SV40polyA) F: 5- CATGGACGAGCTGTACAAGTAAGATCATAATCAGCCATACC-3
(SV40polyA)R: 5-CGG GGTACC ATCCAGACATGATAAGATACATTG-3 (加粗倾斜部分为KpnI 的酶切位点) (三个基因的PCR结果见图1)，与预期的大小一致。  
2、 通过重叠PCR的方法拼接三联体基因：IE1-EGFP-SV40 (如图2、图3所示)，其中IE1的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，EGFP 的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，SV40polyA 的碱基序列如SEQ ID NO：3所示：
(1) IE1与EGFP连接的 PCR反应体系如下：
PCR反应程序如下：
 (2)在上述反应之后再加入10μL的体系进行反应：
     
PCR反应程序如下：
割胶回收IE1-EGFP的连接产物，-20℃保存备用。
IE1-EGFP的亚基因与SV40polyA的连接方法与上述(1)、(2)所述的方法相同。
(3) 载体pUC19和三联体基因IE-EGFP-SV40polyA的PCR产物的双酶切体系如下：
在无菌的Eppendorf管中，依次加入：
37℃水浴酶切30min，割胶回收备用。
(4)连接反应：
室温连接30min，得到转移载体pUC19-IE1-EGFP-SV40polyA的连接产物，经测序正确后继续后续实验。
(5) 连接产物的转化
1)取5 μL转移载体pUC19-IE1-EGFP-SV40polyA的连接产物，加到200 μL DH5α感受态细胞(购自Invitrogen公司)悬液中，轻轻混匀，冰上放置30 min；
2)42 ℃水浴热激90秒，迅速取出置冰上冷却3-5 min；
3)加入1 mL， 37 ℃预热的LB液体培养基(蛋白胨和酵母提取物购自Oxoid公司)((不含抗生素)，混匀后37 ℃摇床摇1 h，使细菌恢复正常生长状态；
4)将转化好的菌液4000 rpm离心10 min，弃1 mL上清，沉淀重悬后取约200 μL培养液；
5)放置30 min，待菌液完全被培养基吸收后倒置避光培养16-24h；
6)挑取含有重组质粒的白色菌落，进行PCR和酶切鉴定，其电泳结果见图4 (并送华大基因测序后用于后续的实验)，表明带有标记基因的转移载体构建成功，可以在此载体的基础上克隆任意BmNPV 复制非必需基因两端的同源序列。
实施例2：重组转移载体pUC19-lef7-IE1-EGFP-SV40polyA-gp64的构建
以BmNPV病毒基因组(其中，病毒DNA抽提试剂盒购自生工生物工程有限公司)为模版，扩增同源序列lef7、gp64，按照实施例1-2所述的步骤将基因lef7、gp64克隆至转移载体pUC19-IE1-EGFP-SV40polyA中，得到重组转移载体pUC19-lef7-IE1-EGFP-SV40polyA-gp64。
然后，对重组转移载体pUC19-lef7-IE1-EGFP-SV40polyA-gp64进行PCR和双酶切鉴定，其电泳结果见图5、图6， 图5的鉴定结果表明靶基因一端的同源序列克隆至转移载体pUC19-IE1-EGFP-SV40polyA中，图6 的鉴定结果显示靶基因两端的同源序列已经成功克隆至转移载体pUC19-IE1-EGFP-SV40polyA中，测序正确后用于后续的转染实验。
实施例3： BmNPV病毒基因组的提取：
1)收集约100ml被家蚕核型多角体杆状病毒感染的细胞液，分别在-80℃，37℃反复冻融三次，4℃，12000rpm 离心1h，取上清；
2)4℃，30000rpm 超离1h，弃上清，收集病毒粒子，溶解在1 x TE中，加入20μL，20mg/ml的蛋白酶K(购自Invitrogen公司), 20μL，10%的SDS, 50℃水浴过夜(至少12h)；
3)加入 10μL，10mg/ml 的RNaseA(购自北京鼎国生物技术公司), 37℃水浴 1h；
4)用苯酚，氯仿抽提病毒基因组：
a、先用(等体积)Tris-平衡酚轻轻混合，持续5min，12000rpm 离心10min；
b、再用体积比为25：24：1的苯酚、氯仿及异戊醇(三者体积之和与离完心后的上清体积相同) 抽提一次，轻轻混合，持续5min，12000rpm，离心10min；
c、再用体积比为24：1的氯仿与异戊醇(二者体积之和与离完心后的上清体积相同)抽提一次，12000rpm 离心10min；
5)取上清，用2倍体积于离完心后的上清的预冷的无水乙醇，轻轻混合，加入1/10体积于离完心后的上清(离完心后的上清不包括无水乙醇的体积)的NaAc，在-80℃沉淀2h，12000rpm，离心30min，沉淀溶于100μl 1x TE中，4℃备用。
实施例4：将家蚕核型多角体病毒基因组与重组转移载体pUC19-lef7-IE1-EGFP-SV40polyA-gp64通过脂质体(购自Roche公司)介导共转染BmN细胞(购自Invitrogen公司)：
1)将1X104个BmN细胞接种于35mm的培养皿中，培养12小时，让细胞尽可能地贴壁生长，待细胞生长到60%-70%的丰度时，用无血清培养基洗细胞2-3次待用，准备重组转移载体pUC19-lef7-IE1-EGFP-SV40polyA-gp64 (2-3μg)约30μl，野生家蚕核型多角体病毒基因组DNA(3-4μg)约30μl，用无血清培养基补充到100μl，即为A液；
 2)取10μl的脂质体，用无血清培养基补充到100 μl，即为B液；
 3)将A与B两种液体混合均匀，室温静置15-20min，再补充800 μl的无血清培养基混合均匀，用枪头吸弃平皿中的培养基，逐滴加入平皿中，27℃下培养箱培养12小时，加入含有20%胎牛血清FBS培养基(购自Invitrogen公司)，1ml，继续培养48小时，用倒置荧光显微镜观察，结果显示，少数细胞带有微弱的荧光出现(见图9)；其中家蚕正常细胞、单独转染了重组转移载体pUC19-lef7-IE1-EGFP-SV40polyA-gp64的家蚕细胞分别作为对照。图7显示的是家蚕正常细胞的显微图，图8显示的是单独转染了重组转移载体pUC19-lef7-IE1-EGFP-SV40polyA-gp64的家蚕细胞的显微荧光图。随着时间的延续，荧光会逐渐增强，说明了重组转移载体与病毒基因组共转染成功，同时标记基因置换掉了病毒基因组上的靶基因，从而达到了缺失靶基因的目的。
实施例5：带有荧光标记基因的重组病毒RBmNPV-EGFP的筛选
1)待荧光逐渐增强时，用1%低熔点琼脂糖固定细胞，用灭过菌的枪头挑取带荧光的细胞，放入96孔板扩大培养；
2)从步骤1)所得细胞中提取病毒基因组并进行鉴定。
实施例6：重组病毒RBmNPV-EGFP基因组的提取
按照实施例3所述的方法及步骤提取重组病毒RBmNPV-EGFP基因组。
实施例7：无标记基因转移载体的构建
按照实施例2所述的方法及步骤构建无标记基因转移载体，并进行PCR和双酶切鉴定，其电泳结果见图10、图11，图10、图11表明无标记基因的转移载体构建成功，构建此载体的目的是为了置换掉病毒基因组上的标记基因，以便标记基因可以被重复利用继续其他靶向基因的敲除。
实施例8：重组病毒RBmNPV-EGFP的基因组与无标记基因转移载体共转染及其重组病毒RBmNPV的筛选
按照实施例4-5所述的方法及步骤筛选重组病毒RBmNPV-EGFP的基因组与无标记基因转移载体共转染及其重组病毒RBmNPV。
以上所述，仅为本发明的实施例，应当指出，对于本技术中的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术特征的前提下，还可以做若干的改进和润饰，这些润饰和改进也应属于本发明的专利保护范围。
SEQUENCE LISTING
 
<110>  天津耀宇生物技术有限公司
 
<120>  一种靶向敲除家蚕核型多角体病毒复制非必需基因的方法
 
<130>  121326-I-CP-TJYU
 
<160>  3   
 
<170>  PatentIn version 3.5
 
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<213>  IE1 启动子序列
 
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ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc atgtctggat      240

Claims (2)

1.一种靶向敲除家蚕核型多角体病毒复制非必需基因的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1) 抽提家蚕核型多角体病毒BmNPV基因组， 通过PCR方法获得复制非必需片段两端的同源序列LEF7、gp64；
(2)将步骤(1)所得的同源序列lef7、gp64依次克隆至转移载体pUC19-IE1-EGFP-SV40polyA中，获得重组转移载体 pUC19-lef7-IE1-EGFP-SV40polyA-gp64，并与家蚕核型多角体病毒基因组通过脂质体介导转染法共转染BmN细胞，经同源重组获得带有EGFP标记的重组病毒RBmNPV-EGFP；
(3)提取重组病毒RBmNPV-EGFP的基因组与无标记基因的转移载体pUC19-lef7-gp64共转染BmN细胞；
(4)筛选无标记基因的重组病毒RBmNPV。
2.如权利要求1所述的靶向敲除家蚕核型多角体病毒复制非必需基因的方法，其特征在于，所述转移载体pUC19-IE1-EGFP-SV40polyA通过以下步骤制得：
(a)用重叠PCR的方法制备三联体基因：1)用PCR的方法依次获得基因：IE1、EGFP、SV40polyA； 2)采用重叠PCR方法依次拼接IE1、EGFP, 以IE1-EGFP的连接产物作为亚基因与基因SV40polyA进行拼接，获得三联体基因IE1-EGFP-SV40polyA；
(b)将步骤(a)所得的IE1-EGFP-SV40polyA克隆至载体pUC19中，获得所述转移载体pUC19-IE1-EGFP-SV40polyA；
(c)转移载体pUC19-IE1-EGFP-SV40polyA转化DH5α大肠杆菌感受态细胞；
(d)在含氨苄青霉素的固体培养基上进行蓝白斑筛选，挑取含有转移载体pUC19-IE1-EGFP-SV40polyA的白色菌落；
(e)转移载体pUC19-IE1-EGFP-SV40polyA进行PCR和双酶切鉴定，并测序。
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