CN103565872B - 预防或治疗肠道发炎疾病的蟛蜞菊属萃取物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明关于预防或治疗肠道发炎疾病的蟛蜞菊属萃取物及其用途，借由一种特定的萃取方法，使其萃取物达到有效的预防和治疗肠道发炎，其萃取物包含绿原酸和阿魏酸作为预防和治疗肠道发炎的成分。
Description
技术领域
本发明关于一种蟛蜞菊属的植物萃取物在预防和治疗肠道发炎上的运用和产品化。
背景技术
发炎性肠道疾病（Inflammatory bowel disease，IBD）是一种肠胃道慢性发炎病症，影响范围遍及全球数百万人口。流行病学和病理学上的研究证据显示发炎性肠道疾病发病的起因是经由一种复杂的环境诱因、家族性和遗传性的因子、免疫调节的缺陷以及微生物接触的交互作用，造成不当地持续活化黏膜免疫系统。
近年来，从草药衍生出的天然健康产品已经发展成常见疾病的另类或辅助疗法。新近的调查报告指出，在发炎性肠道疾病患者之中，最常使用的另类或辅助疗法是草药疗法。蟛蜞菊（Wedelia chinensis）是在亚洲国家广泛地被使用的一种重要草药，为草药茶中的一个重要组成成分。在台湾和东南亚，蟛蜞菊是被认为有疗效例如去咳、解热、排毒、消炎以及保护肝脏的效果。蟛蜞菊中的成分近来被报导有缓和雄性素受体的活性以及摄护腺癌的生长。
由于目前用以治疗发炎性肠道疾病的药物无法根除此疾病的复发且具有副作用，因此对于能有效治疗发炎性肠道疾病的疗法的研发仍有其需求。利用传统药草当作辅助疗法以缓解此种的疾病，已被认为是一种重要的方式。然而，缺乏科学证据以证明传统药草的疗效及安全性，和缺乏萃取方法和品种（species）对药草的影响的调查等问题，仍是在传统药草的研发和应用时需面对的。
目前已有从传统药用植物衍生出单一化合物/植物化学物质，例如，Curcuma longa的姜黄素[1]、Polygonum tinctorium[2]的色胺酮（tryptanthrin）、Scutelleria baicalensis的黄岑素[3]，Catalpa Ovata的梓苷（Catalposide）[4]、Copaifera Officinalis的β-石竹烯（β-caryophyllene）[5]以及其他已测试其可能为抗结肠炎的治疗药物。
然而，在传统药用植物特定组织中，萃取、制备和分离的方法会容易影响药用或膳食的植物材料的最终萃取物样品的药物或营养的特性[6]。Capecka[7]等人研究已发现，在制备唇形科种植物中，新鲜与干燥方式备制的抗氧化活性有显著的差异。
发明内容
在一方面，本发明是关于一种应用蟛蜞菊萃取物方法于预防和治疗肠道发炎疾病上的运用及产品化。对于具有急性肠道炎的小鼠展现出良好的抗肠炎作用，其显示蟛蜞菊具有舒缓或治疗IBD病患因肠道发炎所引起的临床症状和组织病理变化的潜力。
在另一方面，本发明揭露一种萃取蟛蜞菊萃取物的方法。本发明利用不同萃取方法所制得的蟛蜞菊萃取物，包括新鲜或阴干的蟛蜞菊所制得的热水萃取物及50%和100%酒精的萃取物，皆能舒缓葡聚醣硫酸钠（dextran sodiumsulfate，DSS）所诱发的肠道发炎。
前述或其他的实施例将可由以下对较佳实施例的描述及附图更为清楚，然而其改变或修饰并未脱离本发明揭露内容的精神、范围及概念。
相关附图可说明一个或多个本发明实施例，同时配合文字说明，可用于解释本发明的概念。附图中相同的组件符号用于标示一实施例中的相同或相似组件。
附图说明
图1显示给予具有DSS导入急性结肠炎的鼠WCHF疗法的影响。结肠炎的导入是经由含有2%DSS的饮水为期九天。小鼠同时间地经口服给予载体（1%吐温80）或WCHF（50mg/kg鼠体重）为期7天；之后为期九天的DSS的治疗。图1A显示相对体重的改变。图1B显示疾病活性的指针。图1C显示结肠的长度。图1D显示组织切片。图1E显示组织学评分。图1F显示骨髓过氧化酵素活性。数据以均值±SD（n=5-6）表示。经H&E染色的结肠中段组织切片以40倍和100倍放大。*P＜0.05，**P＜0.005，***P＜0.001，有显著的不同与对照组相比较。*P＜0.05，**P＜0.005，***P＜0.001，有显著的不同与DSS组相比较。
图2显示鼠具有DSS导入急性结肠炎对于以不同方法萃取出的蟛蜞菊的萃取物的效果。萃取的方法是依照本发明的材料和方法所述。小鼠同时间地经口服给予载体（1%吐温80）或不同的蟛蜞菊萃取物（50mg/kg鼠体重）为期7天；之后为期九天的DSS的治疗。第2A图显示相对体重的改变。第2B图显示结肠的长度。第2C图显示疾病活性的指针。数据以均值±SD（n=5-6）表示。WCHF:经热水新鲜蟛蜞菊萃取物；WCHD:经热水干燥蟛蜞菊萃取物；WC50和WC100:100%（WC100）和50%（WC50）的乙醇新鲜蟛蜞菊萃取物。*P＜0.05，**P＜0.005，***P＜0.001，有显著的不同与DSS组相比较。
图3显示经热水新鲜蟛蜞菊萃取物和经热水干燥蟛蜞菊萃取物的高效液相色谱法的特性以及候选的指针化学剂。WCHF，WCDF和单一纯化学剂被侦测到在不同的波长下（蓝色=208nm，红色=254nm，绿色=300nm，粉红色=350nm）。箭头指示在WCHF的特性中所显示的特定的高峰，其高峰减低或是并未发现在WCHD的特性中。
图4显示试验鼠的重要器官在WCHF的影响下其组织的亚毒性研究。
图5显示不同种的蟛蜞菊的热水萃取物对于具有DDS导入急性结肠炎的鼠，丧失其体重的效果。（A）鼠的体重在DSS治疗前。给予鼠口服热水萃取物的A:WC、B:WT、C:WB、D:WP和E:WPR（50mg/kg）、磺胺塞拉金（sulfasalazine，50mg/kg，正对照组）或载体（无菌水、对照组和DSS组）。（B）鼠的体重在DSS治疗后。将含有2%DSS的饮水喂于鼠，为期七天。同时给予磺胺塞拉金和不同种的蟛蜞菊的热水萃取物。WC=蟛蜞菊、WT=南美蟛蜞菊、WB=双花蟛蜞菊、WP=天蓬草舅、WBR=琉球蟛蜞菊、WPR=大天蓬草舅。数据以均值±S.E.M（n=14）。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001表示。
图6显示不同种的蟛蜞菊的热水萃取物对于在DDS导入结肠炎的小鼠的疾病活性指标的影响。将含有2%DSS的饮水喂于小鼠和接受口服的载体（无菌水、对照组和DSS组），磺胺塞拉金（50mg/kg，正对照组）或热水萃取物A:WC、B:WT、C:WB、D:WP和E:WPR（50mg/kg）。数据以均值±S.E.M（n=14）。*P<0.05，**P<0.01表示。
图7显示不同种的蟛蜞菊的热水萃取物对于具有DDS导入急性结肠炎的鼠的病理组织和组织学评分。将含有2%DSS的饮水喂于小鼠和接受口服的载体（无菌水、对照组和DSS组），磺胺塞拉金（50mg/kg，正对照组）或热水萃取物A:WC、B:WT、C:WB、D:WP和E:WPR（50mg/kg）。H&E染色的中段结肠切片放大于40倍（A）和100倍（B）。（C）组织学评分。数据以均值±S.E.M（n=14）。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001表示。
具体实施方式
定义
说明书中所使用的用语在该领域中具有其一般定义，包括在本发明的说明内容，以及特定文字内容部份所使用的用语。以下将讨论本发明所使用的特定用语，亦或说明书的其他部分，以作为实施者在实施本发明的导引。为了便利起见，某些词汇将特别标记，例如使用斜体及/或引号标示。这些标记的使用，将不影响该用语的范围或定义；该用语的范围或定义在文中仍然是相同的，无论其是否有标记。相同的事物可用一种以上的方式描述。因此，在此将使用超过一种的其他用语及同义字，该些用语并无其他特殊含义，无论该些用语是否有特别解释或阐述。在本文中使用了一些同义字，列举一或多种同义字并不代表排除了其他未提及或列举的同义字。在实施例或说明书中所使用的用语仅为用以说明，并非限定其本发明或实施例的范围或定义。同样地，本发明并非受限于说明书中的实施例。
除非另外定义，本文中所使用的技术上或科学上的用语，皆为该领域具有通常知识者所理解在本发明所涉及的一般定义。
在一方面，本发明是关于蟛蜞菊抗肠炎功效的可能性。本发明对于具有急性肠道炎的小鼠展现出良好的抗肠炎作用，其显示蟛蜞菊具有舒缓或治疗IBD病患因肠道发炎所引起的临床症状和组织病理变化的潜力。
在另一方面，本发明揭露一种萃取蟛蜞菊萃取物的方法。本发明利用不同萃取方法所制得的蟛蜞菊萃取物，包括新鲜或阴干的蟛蜞菊所制得的热水萃取物及50%和100%酒精的萃取物，皆能舒缓葡聚糖硫酸钠（dextran sodiumsulfate，DSS）所诱发的肠道发炎，其中以新鲜的制备的热水萃取物效果最佳。另外，本发明进一步利用高效液相层析仪分析各种蟛蜞菊属（Wedelia genus）植物的其他种（species）的鲜品水萃物的代谢物图谱。其结果发现，琉球蟛蜞菊（W.biflora var.ryukyuensis）、蟛蜞菊（Wedelia chinensis）及南美蟛蜞菊（W.trilobata）的高效液相层析仪分析的图谱与其他三者（双花蟛蜞菊（W.biflora）、天蓬草舅（W.prostrata）及大天蓬草舅（W.prostrata var.robusta.）有显著的不同；各种的蟛蜞菊亦有独特的波峰可供辨识。本研究也发现数种单一植化物（phytochemicals），如绿原酸（chlorogenic acid）及阿魏酸（ferulic acid）可能存在于蟛蜞菊属植物中，可做为蟛蜞菊属植物的鲜品水萃物的指标成分（indexcompounds），当作商业应用上的质量控管依据。
在本发明的一实施例中，一种预防或治疗肠道发炎疾病的蟛蜞菊属（Wedelia）萃取物，其由蟛蜞菊属植物以水或醇类萃取而得。
在本发明的另一实施例中，所述的蟛蜞菊属萃取物，其中该蟛蜞菊属植物选自于琉球蟛蜞菊（W.biflora var.ryukyuensis）、蟛蜞菊（Wedelia chinensis）、南美蟛蜞菊（W.trilobata）、双花蟛蜞菊（W.biflora）、天蓬草舅（W.prostrata）、大天蓬草舅（W.prostrata var.robusta.）及其任一组合所组成的群组
在本发明的另一实施例中，其中该蟛蜞菊属植物为新鲜或干燥的植物。
在本发明的另一实施例中，所述的蟛蜞菊属萃取物，其中该水为滚烫热水。
在本发明的另一实施例中，所述的蟛蜞菊属萃取物，其中该醇类为乙醇。
在本发明的另一实施例中，所述的蟛蜞菊属萃取物，其进一步包含绿原酸（chlorogenic acid）、阿魏酸（ferulic acid）或其混合物。
在本发明的另一实施例中，一种用于预防或治疗肠道发炎疾病的医药组成物，包括有效剂量的如权利要求1项所述的蟛蜞菊属萃取物，以及药学上可接受的载体。
在本发明的另一实施例中，所述的医药组成物，其中该肠道发炎疾病为结肠炎。
在本发明的另一实施例中，所述的蟛蜞菊属萃取物用于制备预防或治疗肠道发炎疾病的药物的用途。
在本发明的另一实施例中，所述的用途，其中该蟛蜞菊属萃取物具有抗发炎功效以达到预防或治疗肠道发炎疾病的效果。
实施例
以下将提供本发明的实施例，包括仪器、装置及方法，以及依据该些实施例所得的结果。在实施例中使用的名称及副名称是为了方便阅读，并非用以限制本发明的保护范围。进一步地，在此所揭露的原理，只要发明能够依据说明书所载据以实施，都不应限制本发明的保护范围。
材料及方法
蟛蜞菊萃取物的准备
依先前文献所记载及自行的研究，实验用的植物材料需用肉眼于外观、构造、植物化学和基因图表的特征上作确认。蟛蜞菊购自台北市有声誉的中医药草店或由种植者取得。干燥的蟛蜞菊是将新鲜干净的蟛蜞菊置放于阴凉处两个星期干燥而成。关于经由热水提炼的新鲜（亦称鲜品）或干燥蟛蜞菊萃取物，实验植物材料需称重然后加入适当的滚水（每一百公克的新鲜或干燥蟛蜞菊须一公升的水）煎煮，须煎煮至滚水剩余原来的四分之一。然后使用吸取泵将滚水的萃取物经由滤纸过滤以及使用旋转蒸发器将萃取物浓缩。乙醇提炼的萃取物是将整个新鲜蟛蜞菊浸泡于100%或50%EtOH（WC100或WC50）两星期，之后其萃取物经由上述的方法过滤以及浓缩。全部的萃取物在使用前须经冷冻干燥以及储藏在4℃中。
小鼠
七到八个月大的C57BL/6以及ICR雌小鼠是从National Laboratory AnimalCenter（台湾台北）购买的。小鼠安置固定的温度和湿度下，维持以12h/12h/日/夜的循环。小鼠给予食物和水持续至小鼠达到实验所需的理想体重。其步骤是依照中研院的实验动物管理与使用委员会（Institutional Animal Care andUse Committee，IACUC）的标准流程进行。
导入急性结肠炎
待小鼠适应环境之后，体重达到标准的雌小鼠（20-25公克）随机分置对照、结肠炎-对照和治疗等组。全部的小鼠给予正常的饮水从第-7天到第0天。为了导入急性结肠炎，除了对照组之外，其余的小鼠给予含有2%（w/v）葡聚醣硫酸盐（DSS，分子量:36000-50000Da，MP Biochenicals，Solon，Ohio，USA）的饮水从第0天到第8-9天。DSS溶液每两天更换一次，DSS的饮用量以均值（mean）纪录。在整个实验的期间，对照组和DSS组的小鼠经由口服给予其对照试验萃取物的载体（vehicle）（1%吐温80，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）。治疗组给予以不同方式提炼的蟛蜞菊萃取物，将萃取物溶解于载体，经由管喂（oral gavage）、口服的方式，其剂量为50mg/kg。为了评估结肠炎的程度，每天对小鼠的体重、排便状况以及粪便中的血液含量进行观察；结肠炎的疾病活动指数（disease activity index）是根据Cooper[8]等人的改良准则所计算的。在每个实验结束之后，将全部的试验小鼠测量体重并牺牲。小鼠的大肠被切除后，测量结肠长度，移除盲肠之后，洗浸于0.9%的生理食盐水，最后浸泡置10%中性福尔马林中。
结肠炎的组织病理学的评估
结肠组织检验的中段结肠的组织评分是根据Cooper等人所描述的评分系统。将已浸泡于福尔马林中的结肠分成三等段（equal segments）分别是前、中和后段，使用石蜡包埋，切片（2um）然后染色于苏木色素和伊红。DSS导入的结肠炎的损伤以肠道腺窝的丧失、肠道腺窝的再生、黏膜下层的水肿、发炎以及出血（纤维组织母细胞的渗透）来评分。根据Shackleford[9]等人所描述的方法（参见表一），其损害程度是以依照前述每项严重度1到5分来进行评分，最高总分为25分。
表一在亚急性毒性试验中分析WCHF对于试验鼠的血液参数（A）和血液生化（B）的影响
(A)血液参数
(B)血液生化参数
数据以均值±SD。MCV=mean corpuscular volume（血球容量的均值）、MCH=mean corpuscular hemoglobin（血红蛋白的均值）、MCHC=meancorpuscular hemoglobin concentration（血红蛋白浓度的均值）、RDW=red celldistribution width（红细胞分布的宽度）、MPV=mean platelet volume（血小板容量的均值）、PCT=plateletcrit（血小板比容）、PDW=platelet distributionwidth（血小板分布的宽度）、NEU=neutrophil count（嗜中性白血球数）、LYM=lymphocyte count（淋巴细胞数）、MONO=monocyte count（单核细胞数）、EOS=eosinophil count（嗜酸性粒细胞数）、BASO=basophil count（嗜碱性粒细胞数）AST=aspartate aminotransferase（天冬氨酸转胺酶）、ALT=alanineaminotransferase（丙氨酸转胺酶）、ALP=alkaline phosphatase（碱性磷酸酶）、TB=total bilirubin（全胆红素）、BUN=blood urea nitrogen（血尿素氮）。试验组与对照组没有显著的不同。
骨髓过氧化酵素（Myeloperoxidase）的活性
骨髓过氧化酵素活性的测量方式是依照Krawisz[10]等人所发表的规章经稍微改良，以一种生化指标来标示嗜中性白血球的累积。经由液态氮冷冻的结肠中段，磨碎后均质化于50mM磷酸盐钾的缓冲液（KH2PO4/K2HPO4，pH6.0），其缓冲液包含0.5%（w/v）十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyltrimethylammonium bromide，HETAB）。此均质物经由离心机分离（4℃，13000rpm，20分钟）后采集其浮在表层的东西。浮在表层之物的骨髓过氧化酵素活性的测量方式是将100μl的浮在表层之物与50μl已备好的tetramethylbenzidine（四甲基联苯胺，TMB）substrate（基质）（Clinical Science Product，MA，USA）混合于一个96孔盘，让其混合物反应两分钟，然后加入50μl2M的硫酸，使其反应停止。随后立即使用PowerWave XS Microplate分光亮度计（Bio-Te，Winooski，VT，USA）在450nm下进行（测量其光密度（optical density（O.D））。浮在表层之物的蛋白质浓度经由Coomassie蛋白质化验试剂（Thermo，Rockford，IL，USA）。骨髓过氧化酵素活性以O.D/ug蛋白表示。
统计分析
所有数据皆以平均值标准偏差（mean±S.E.M）的方式呈现。独立实验以学生t试验进行比较。以星号标示的差异表示其具有统计上显著意义（p<0.05）。
新鲜蟛蜞菊萃取物缓和DSS导入急性结肠炎的征状
经由热水萃取的新鲜蟛蜞菊的萃取物，经由DSS导入急性结肠炎的小鼠模式进行评估其效果。试验鼠经由口服给予载体溶液或新鲜蟛蜞菊萃取物（50mg/kg鼠体重）为期一星期之后，给予含2%DSS饮用水为期九天。DSS组的小鼠快速地显现出典型的结肠炎征状包括腹泻、直肠出血及体重减轻。依图1A所示，与对照组相比较下，DSS组小鼠的相对体重在第7、8和9天显著的减少（P<0.05，P<0.005，P<0.001）。新鲜蟛蜞菊萃取物组的小鼠表现出的体重与对照组没有不同。与DSS组的小鼠相比较之下，新鲜蟛蜞菊萃取物+DSS组的小鼠的疾病活性指标是显著的降低（图1B，P<0.001）。
除了体重减轻之外，结肠长度的缩短也是DSS导入急性结肠炎一个重要的症状特征。依图1C所示，新鲜蟛蜞菊萃取物有效减少试验鼠的结肠长度的缩短（P<0.001），也缓和病理组织学上的症兆（图1D）。当与从DSS鼠取出的典型的H&E染色的中段结肠切片相比较下，经新鲜蟛蜞菊萃取物治疗的鼠的组织切片显著地表现出降低肠道腺窝的破坏和单核细胞的渗透或是其他的淋巴球进入黏膜组织（图1D）。经新鲜蟛蜞菊萃取物治疗的鼠结肠切片的组织学评分也明显地下降（P<0.005，图1E）。我们随后收集结肠组织以及对试验样本进行骨髓过氧化酵素活性的分析。与组织学上的评分一致，DSS组的骨髓过氧化酵素活性大幅度的增加，但是新鲜蟛蜞菊萃取物治疗组的活性确被有效的降低至与对照组相同（P<0.05，图1F）。因此，本发明实验结果（第1A-F图）显示新鲜蟛蜞菊萃取物治疗以50mg/kg的剂量可以显著地缓和试验鼠的结肠组织因DSS导入发炎和创伤的临床征状和组织所造成的损害。
经热水新鲜蟛蜞菊萃取物疗法
为了在未来的应用上，使蟛蜞菊萃取物有最大的效果，便对于不同的萃取方法进行评估。本发明分析四种不同的萃取方法来制备天然植物的萃取物以及对其抗鼠结肠炎活性的效果评估。与DSS鼠相比较下，经不同蟛蜞菊萃取物治疗的鼠有效的减轻DSS所造成的体重的减少（第2A图）、结肠长度的缩短（第2B图）和疾病活性指数（第2C图）。在此四种萃取方法的萃取物中（热水新鲜蟛蜞菊萃取物（WCHF）、热水干燥蟛蜞菊萃取物（WCHD）以及100%（WC100）和50%（WC50）的乙醇新鲜蟛蜞菊萃取物），以热水新鲜蟛蜞菊萃取物展现出最高的抗结肠炎的效果。
高效液相色谱法
高效液相色谱法等级的溶剂和化学剂皆从J.T Baker（Phillipsburg，NJ，USA）购买的。热水提炼的新鲜和干燥蟛蜞菊萃取物经冷冻干燥后，分别将其磨碎至粉状后溶于二甲亚砜（DMSO，TEDIA company Inc.，Fairfield，OH，USA）储存备用（20mg/ml）。将等份的新鲜和干燥蟛蜞菊萃取物稀释于1mg/ml的甲醇中，之后放至离心机中以13000rpm进行分离，10分钟之后收集浮在表层之物。将20μl浮在表层之物的萃取物经由高效液相色谱法（Agilent1100Series System with G131A Quat Pump，Palo Alto，CA）及使用CosmosilC18-AR-II column（5um particle size，250*4.6mm，Nacalai Tesque，Kyoto，Japan）以1ml/min稳定的流速来进行分析。梯度流析（gradient elution）是以甲醇（溶剂B）和溶解于去离子水的0.05%的三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）（溶剂A）所组成的流动相（mobile phase）:0-30分钟，15%-100%溶剂B以及30-40分钟，100%溶剂B。检测的波长是设定在254nm、280nm、300nm和350nm。
使用高效液相色谱法分析蟛蜞菊萃取物中的植物化学剂
使用高效液相色谱法来分析热水新鲜蟛蜞菊萃取物与热水干燥蟛蜞菊萃取物的代谢物的特性。依图3所示，在WCHF的样本中有两次主要高点，侦测到的时间点是在第11.58分钟和第17.75分钟，但在WCHD的样本中，其代谢物的特性显著地减少，依照WCHF的样本所观察，其暗示着存在于此两种特有的植物中的代谢物的成分可能有助于改善抗结肠炎的活性。另外，之后将WCHF的高效液相色谱法的特性与一些已知的生物化学剂相比对，绿原酸（chlorogenic acid）和阿魏酸（ferulic acid）有相似的侦测时间点，其表示WCHF的制备方式可能含有绿原酸和阿魏酸。
亚急性口服毒性研究
体重达到标准的ICR小鼠，随机分配至四个群组，经口服施予水（对照组）或100、500、1000mg/kg（依鼠体重）的新鲜蟛蜞菊萃取物（分别是低、中、高剂量群组），为期28天。测量其体重以及食物的消耗量。临床征兆和生命力一天观察两次。在28天之后，将小鼠牺牲。其器官在肉眼下观察，选取重要的器官（心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏）测量其重量以及置放于10%中性甲醛溶液中。血液和尿液的血液学及生化分析是由Taiwan Mouse Clinic来进行的。
每日经口服给予WCHF对于试验鼠是没有毒性的
虽然蟛蜞菊作为药草或是饮食用的草本植物已经有很长的历史，就我们专业知识的了解，尚未有报导关于此种植物以科学证据为基础的毒性研究。为了评估蟛蜞菊一般毒性的可能性，我们进行一个28天亚急性口服毒性试验来测试不同剂量对于ICR鼠的影响（100，500以及1000mg/kg鼠体重）。全部接受治疗的鼠在整个实验期间表现正常形态和行为的表型和成长速度以及存活良好。在四个试验组之间观察，食物的摄取行为或最初和最后的体重并没有重大的变化（参见表二）。经肉眼观察从牺牲的小鼠切除下的器官也发现是正常的。另外，在任何的试验组中，重要器官的相对体重也没有重大的改变（参见表二）。在组织上，重要器官的组织检验没有表现出WCHF治疗所造成的组织损害（图4）。
表二在亚急性毒性试验中分析WCHF对于试验鼠的体重、饮食和器官相对体重的影响
数据以均值±SD（n=6）。WCHF=热水蟛蜞菊萃取物。BW=体重。对照组与实验组无显著的不同。
肝脏组织切片表现出轻微肝醣浸润与扩散以及空泡的形成，我们推测其造成的原因是由于在试验鼠牺牲前施行非空腹的措施。当与对照组相比较，WCHF的治疗方式没有造成试验鼠血液或血液生化的活性数据上重要改变，甚至在最高的WCHF剂量（1000mg/kg）下（参见前述表一）。这些实验结果让我们推断每日固定给予口服WCHF萃取物在一个高达1000mg/kg鼠体重只剂量下对于试验鼠是安全的。
本发明的优点是提供使用蟛蜞菊的萃取物，治疗和缓和结肠炎症状，其效果以经热水提炼出的蟛蜞菊的萃取物为最佳。显示蟛蜞菊具有舒缓或治疗IBD病患因肠道发炎所引起的临床症状及组织病理变化的潜力。我们亦发现，不同萃取方法所制得的蟛蜞菊萃取物，包括用新鲜或阴干的蟛蜞菊所制得的热水萃取物及50%和100%酒精的萃取物皆能舒缓DSS所诱发的肠道发炎。此外，也发现其他台湾常见的蟛蜞菊属的植物对于DSS所诱发的小鼠急性肠道炎有不同程度上的舒缓效果，表三为不同种蟛蜞菊的缩写，其中WC为蟛蜞菊、WT为南美蟛蜞菊、WB为双花蟛蜞菊、WP为天蓬草舅、WBR为琉球蟛蜞菊以及WPR为大天蓬草舅。
表三、不同种的蟛蜞菊的热水萃取物的抗结肠炎的效果
表1.台湾的蟛蜞菊种
本发明亦利用高效液相层析仪（high performance liquid chromatography、HPLC）分析前述各种蟛蜞菊的鲜品萃取物的代谢图谱。结果发现，琉球蟛蜞菊（W.biflora var.ryukyuensis）、蟛蜞菊（Wedelia chinensis）与南美蟛蜞菊（W.trilobata）的HPLC图谱与其他三者（双花蟛蜞菊（W.biflora）、天蓬草舅（W.prostrate）及大天蓬草（W.prostrata var.robusta.））有显著的不同；各种蟛蜞菊亦各有其独特的波峰可供辨识。另外，图5至图7则分别显示不同种的蟛蜞菊的热水萃取物对于在DDS导入结肠炎的小鼠的效果，例如体重分析、疾病活性指针及病理组织和组织学评分。在进一步的比对下，发现单一植化物（phytochemical），如绿原酸（chlorogenic acid）及阿魏酸（furulic acid）可能存在于蟛蜞菊属植物中，可作为蟛蜞菊属植物的鲜品水萃物的指标成份，当作商业应用的质量管控依据。这些指标成分及其他未知的植化物相混合、结合，已达成蟛蜞菊抗肠炎的功效。根据研究结果，本发明的萃取物是无毒性且安全。
在本发明的实施说明所引用及探讨的部分参考文献，可包括专利、专利申请书及不同的公开文献。该些参考文献的引用及/或讨论仅用于使本发明的叙述清楚，而非允许该些参考文献可当作本发明的先前技术。所有在说明书中引用及讨论的参考数据皆以其完整内容作为本文的一部分。
参考文献
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Claims (8)
1.一种蟛蜞菊属（Wedelia）萃取物用于制备预防或治疗肠道发炎疾病的药物的用途；该蟛蜞菊属萃取物，其由蟛蜞菊属植物以水或醇类萃取而得；
所述以水萃取的方法为：每一百公克的新鲜或干燥蟛蜞菊属植物与一公升的水煎煮，须煎煮至滚水剩余原来的四分之一；然后使用吸取泵将滚水的萃取物经由滤纸过滤以及使用旋转蒸发器将萃取物浓缩；
所述以醇类萃取的方法为：将整个新鲜蟛蜞菊属植物浸泡于100%或50% 醇类，之后其萃取物经由上述的方法过滤以及浓缩。
2.如权利要求1项所述的用途，其中该蟛蜞菊属萃取物具有抗发炎功效以达到预防或治疗肠道发炎疾病的效果。
3. 如权利要求1所述的用途，其中该蟛蜞菊属植物选自于琉球蟛蜞菊（W. biflora
var. ryukyuensis）、蟛蜞菊（Wedelia chinensis）、南美蟛蜞菊（W. trilobata）、双花蟛蜞菊（W. biflora）、天蓬草舅（W. prostrata）、大天蓬草舅（W. prostrata
var. robusta.）及其任一组合所组成的群组。
4.如权利要求1或2项所述的用途，其中该蟛蜞菊属植物为新鲜或干燥的植物。
5.如权利要求1项所述的用途，其中该水为滚烫热水。
6.如权利要求1项所述的用途，其中该醇类为乙醇。
7.如权利要求1项所述的用途，该蟛蜞菊属萃取物，进一步包含绿原酸、阿魏酸或其混合物。
8.如权利要求1项所述的用途，其中该肠道发炎疾病为结肠炎。
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