CN103565822B - 氢气饱和生理盐水在制备防治腹主动脉瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及氢气饱和生理盐水在制备防治腹主动脉瘤药物中的应用。动物实验表明，腹腔注射氢气饱和生理盐水，不仅能改善炎症细胞浸润，减少炎症介质释放，还能减轻组织过氧化，增强抗氧化酶活性，进而减少血管壁蛋白水解酶的表达，抑制血管弹性纤维的降解，从而减轻血管损伤，抑制血管扩张，减小血管的最大外径。氢气生理盐水制备过程简单、使用方便、价格低廉、无毒副作用，从动物实验的结果来看具有良好的防治优势，所以，本发明开发了氢气饱和生理盐水在制备防治腹主动脉瘤药物中的新用途。

Description

氢气饱和生理盐水在制备防治腹主动脉瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及氢气饱和生理盐水在制备防治腹主动脉瘤药物中的应用。

背景技术

腹主动脉瘤(abdominal aortic aneurysms，AAA)实际上是一种因动脉血管壁退化变性而导致的动脉扩张性疾病，而非通常意义上的“肿瘤”，然而它对人体健康的威胁却绝不亚于任何一种恶性肿瘤。近年来，全球腹主动脉瘤的发病率正在迅速攀升。在美国，腹主动脉瘤的发病率比30年前上升了7倍，达2％～7％，每年约有15000人因此而死亡，占疾病死因的第11位；在欧洲，自然人群腹主动脉瘤发病率为4.5％～5.9％，远超过一般恶性肿瘤的发病率；在我国，随着人口老龄化社会趋势的到来和现代医学诊断技术的进步，腹主动脉瘤的发病率已经达到2％，在过去的30年中增长了近3倍。腹主动脉瘤一旦发生其结果是逐渐增大并最终破裂，直径超过5cm的腹主动脉瘤，年破裂率超过60％，在得到诊断的症状性腹主动脉瘤中，2年内自然破裂率达到50％，90％以上的破裂者发生猝死。

由于该病有很高的发病率和致死率，根据美国心脏病学会/美国心脏学会(ACC/AHA)临床治疗指南，腹主动脉瘤体直径在5.0-5.5cm以上应予外科手术或血管腔内支架修复。相比之下，直径＜5.0cm的小腹主动脉瘤多呈缓慢扩张的趋势，破裂的危险性小，而且早期行开腹或腔内修复对改善生存率并无益处，对于此类患者目前推荐的处理方法是定期影像学检查监测瘤体直径，一旦瘤体直径达到5.0-5.5cm或瘤体扩张率＞5mm/6月，才会实施选择性修复术。显然，这种建立在“观察等待”基础上的疗法是不够的。因此，明确腹主动脉瘤的发病机制并寻找一种更为积极的方法来稳定或延缓腹主动脉瘤的进展是当前血管性疾病研究的热点与焦点。

在腹主动脉瘤发病机制研究中公认的相关病理过程包括：①主动脉壁慢性炎症浸润，伴随新生血管生成和促炎因子表达；②瘤体组织过量表达基质金属蛋白酶；③基质结构蛋白大量减少，主要是弹力蛋白和胶原蛋白；④血管中膜平滑肌细胞凋亡，使得结缔组织修复能力下降。基于炎症与氧化应激作用于腹主动脉瘤上述病理变化过程的证据，靶向炎症反应和氧化应激效应中某些分子靶点的药物治疗策略已被认为是控制其进展的潜在途径，而且有些药物已经经过动物实验的验证，有的已进入临床试验阶段。如大环内酯类和四环素类抗生素主要通过抑制包括白细胞粘附分子和趋化因子在内等炎症介质表达，减少组织中以巨噬细胞为主的炎症细胞浸润来抑制腹主动脉瘤的发展；非甾体抗炎药可抑制前列腺素E2的增加和环氧合酶的活性增强，从而抑制巨噬细胞活化，阻止腹主动脉瘤的形成发展；抗氧化剂可阻止自由基的产生或灭活自由基，消除自由基引起的血管壁损伤，进而减缓腹主动脉瘤的发展。上述药物已经显示出抑制腹主动脉瘤进展的潜在作用，但在其发挥治疗作用的同时，不可避免的带来一定副作用，因而人们一直致力于研究开发更有效更安全的防治腹主动脉瘤的药物。

2007年，日本学者率先在《NAT MED》报道，大鼠呼吸2％的氢气能够显著改善脑缺血再灌注损伤，经过体外试验证明，氢气在溶液中可选择性中和羟自由基和亚硝酸阴离子，而后两者是导致细胞氧化损伤的最主要介质，目前体内尚未找到内源性特异性清除途径。因此认为，氢气治疗脑缺血再灌注的基础是选择性抗氧化作用。于是，氢气的治疗效应迅速引起广泛关注，并掀起了研究氢气治疗疾病的热潮。随后研究发现，氢气对炎症性疾病也具有治疗作用，其作用机制是下调炎症介质表达，抑制炎症细胞浸润活化，从而减轻炎症损伤，改善预后。鉴于炎症和氧化应激是腹主动脉瘤形成的重要启动和促进因素以及氢气的抗炎、抗氧化作用，我们猜测氢气具有防治腹主动脉瘤的潜在功能。而且与传统药物相比，氢气应用于医药技术领域有非常鲜明的优势：首先，氢气还原性弱，只与活性强和毒性强的自由基反应，而对其它具有重要生物学功能、毒性和活性较低的自由基影响不大，此即氢气的选择性抗氧化作用。其次，氢气是一种小分子，可以非常容易地扩散到其它药物难以到达的器官、细胞和细胞器，甚至在血运重建前到达组织损伤部位，发挥生物学效应。再次，人和动物胃肠道内正常菌群每天都在产生氢气，可以被机体吸收代谢，而通过呼吸或饮用或注射摄取的外源性氢气，其组织相容性好，安全，副作用少，即使过量，也能通过呼吸排出体外，没有残留。最后，氢气资源丰富、制备方便、价格低廉、无毒环保。氢气的这些优点为氢气的科学研究和临床应用奠定了坚实的基础，故本研究我们选用腹主动脉瘤模型动物研究了氢气对腹主动脉瘤的保护作用及可能的机制。

目前用于腹主动脉瘤机制研究的模型多为中外膜损伤模型，如基因缺陷诱导法、弹力酶灌注法、氯化钙孵育法等。基因缺陷诱导法对动物的饲养、繁殖条件要求严格，且来源有限，对开展实验研究有一定限制。弹力酶灌注法和氯化钙孵育法相对简便、快速、稳定，现已被广泛应用。在氯化钙模型，造成血管损伤的始动因素是高浓度的钙离子，高浓度钙离子可以导致血管局部细胞应激反应和坏死，坏死的细胞释放大量内源性物质，导致持续性的炎症反应，动脉扩张从炎症应答就开始。而弹力蛋白酶模型依赖的是一个初始的灌注压介导的机械性损伤，继发炎性损伤，这个模型模拟了动脉瘤的生长而不是初始。由于我们研究的是氢气对腹主动脉瘤发生发展的影响，故血管旁孵育高浓度氯化钙诱发的腹主动脉瘤模型是本研究最好的模式生物。

中国专利公开号CN101347451A公开了一种含氢注射液。该发明已被证明可用于治疗心、脑、肾等组织器官缺血再灌注损伤(中国专利公开号CN101347451A)和高脂血症疾病(中国专利公开号CN102210701A)。但是关于氢气饱和生理盐水在制备防治腹主动脉瘤药物中的应用目前还未见相关报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种氢气饱和生理盐水在制备防治腹主动脉瘤药物中的新用途。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

氢气饱和生理盐水在制备防治腹主动脉瘤药物中的应用。

所述药物需将氢气加压助溶于无菌生理盐水达到饱和水平，分装制成注射剂或口服液剂等常规剂型(具体实施步骤参见具体实施方式三)。所用氢气饱和生理盐水均为1周内配置，维持氢气浓度不低于0.6mM。

根据实验大鼠有效剂量推算，所述氢气饱和生理盐水在制备防治腹主动脉瘤药物中的有效剂量约为5ml/kg/d。

选取体重200～220g的SD雄性大鼠作为实验对象，按体重随机分成四组，室温22～26℃下饲养，自由进食进水，12小时光照/黑暗，每天按测得体重给药。其中，模型组大鼠经腹主动脉旁孵育0.5mol/L CaCl₂后，持续4周腹腔注射生理盐水(5ml/kg/d)。氢气预防组经腹主动脉旁孵育0.5mol/L CaCl₂后，持续4周腹腔注射氢气饱和生理盐水(5ml/kg/d)。氢气治疗组在给予0.5mol/L CaCl₂建模后，先腹腔注射生理盐水2周，再腹腔注射氢气饱和生理盐水2周。另一组大鼠，腹腔注射生理盐水4周，作为阴性对照组。

需要说明的是：将氯化钙局部应用于大鼠肾下腹主动脉，2周后有显著的动脉扩张，4周后动脉瘤开始回缩，所以上述的治疗时间点和处死时间点分别选在造模后2周和4周。

应用对照金属杆(直径0.81mm)平行放置于血管旁，作为参照，进行拍照，使用Image-ProPlus 6.0专业分析软件测量肾下腹主动脉直径，由至少2名合格但并不知晓实验分组的工作人员独立完成测量，至少取20个不同的横截面进行测量，最后求得最大直径进行统计学分析，以实验前后腹主动脉最大直径增加大于50％为诊断腹主动脉瘤的标准。利用苏木素-伊红(HE)染色法观察血管结构、血管损伤程度、炎症细胞浸润程度。利用醛品红法(弹力纤维的特殊染色方法)观察弹力纤维的破坏和降解。利用酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒分别检测瘤壁组织中白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)浓度。利用分光光度法检测瘤壁组织丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)含量。利用基质金属蛋白酶2、9(MMP-2、MMP-9)免疫组化染色定性观察瘤壁表达，利用实时定量PCR(Real-time PCR)法检测瘤壁组织MMP-2mRNA、MMP-9mRNA、趋化素样因子-1(CKLF-1)mRNA的表达水平。

结论：

(1)腹腔注射氢气饱和生理盐水能抑制血管扩张，减小腹主动脉瘤的最大直径。

(2)腹腔注射氢气饱和生理盐水能减少血管壁蛋白水解酶的表达，抑制血管弹力纤维的降解。

(3)腹腔注射氢气饱和生理盐水能改善炎症细胞浸润，减少炎症介质释放，减轻炎症损伤。

(4)腹腔注射氢气饱和生理盐水能减轻组织过氧化，增强抗氧化酶活性，减轻氧化应激。

本发明有益效果主要体现在：提供了氢气饱和生理盐水在制备防治腹主动脉瘤药物中的新应用。氢气，能有效预防腹主动脉瘤的发生，延缓腹主动脉瘤的进展，同时又具有抗炎、抗氧化的功效，是一种应用前景广阔的防治药物。

附图说明

图1为代表性的血管大体图显示氯化钙孵育后4周，腹主动脉形成明显的动脉瘤，而氢气饱和生理盐水预防性地给药减少动脉瘤的形成，治疗性给药抑制动脉瘤的进行性发展。

图2为对血管最大直径进行定量学分析显示，在血管旁孵育高浓度氯化钙，在4周可以形成明显的腹主动脉瘤，证明建模成功；在血管旁孵育氯化钙的同时给予氢气饱和生理盐水进行预防性给药，能够明显抑制血管扩张，减少动脉瘤的形成；而在2周后，给予氢气饱和生理盐水治疗，也能够减小血管的最大直径，抑制动脉瘤的进行性发展；数据表示为 ^*P＜0.05，^**P＜0.01。

图3为氯化钙损伤后4周不同处理组腹主动脉瘤特征性的组织病理学分析，血管横切面做HE染色显示，氢气饱和生理盐水能够抑制炎性细胞浸润，减轻血管的损伤，保护血管结构的相对完整。

图4为醛品红(弹力纤维的特殊染色方法)染色显示氢气饱和生理盐水能够减少弹力纤维的破坏和降解。

图5为免疫组化染色显示在氯化钙损伤后4周，氢气饱和生理盐水能够抑制血管组织局部MMP-2的表达。

图6为对动脉组织中基质金属蛋白酶MMP-2mRNA进行定量学分析显示，氢气饱和生理盐水能够抑制血管组织MMP-2mRNA的表达；数据表示为 ^*P＜0.05，^**P＜0.01。

图7为免疫组化染色显示在氯化钙损伤后4周，氢气饱和生理盐水能够抑制血管组织局部MMP-9的表达。

图8为对动脉组织中基质金属蛋白酶MMP-9mRNA进行定量学分析显示，氢气饱和生理盐水能够抑制血管组织MMP-9mRNA的表达；数据表示为 ^*P＜0.05，^**P＜0.01。

图9为对动脉组织中IL-1β进行定量学分析显示，氢气饱和生理盐水能够减少血管组织IL-1β含量；数据表示为 ^*P＜0.05，^**P＜0.01。

图10为对动脉组织中TNF-α进行定量学分析显示，氢气饱和生理盐水能够减少血管组织TNF-α含量；数据表示为 ^*P＜0.05，^**P＜0.01。

图11为对动脉组织中CKLF-1mRNA进行定量学分析显示，氢气饱和生理盐水能够抑制预防组血管组织CKLF-1mRNA的表达，不影响治疗组的表达；数据表示为 ^*P＜0.05，^**P＜0.01。

图12为对动脉组织中MDA进行定量学分析显示，氢气饱和生理盐水能够减少血管组织MDA含量；数据表示为 ^*P＜0.05，^**P＜0.01。

图13为对动脉组织中SOD进行定量学分析显示，氢气饱和生理盐水能够增加治疗组血管组织SOD含量，不影响预防组含量；数据表示为 ^*P＜0.05，^**P＜0.01。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

(一)实验分组

选取体重200～220g的SD雄性大鼠40只(军事医学科学院动物中心)作为实验对象，按体重随机分成四组，每组10只，室温22～26℃下饲养，自由进食进水，12小时光照/黑暗，每天按测得体重给药。其中，模型组大鼠经腹主动脉旁孵育0.5mol/L CaCl₂(国药集团化学试剂北京有限公司)后，持续4周腹腔注射生理盐水(5ml/kg/d)。氢气预防组经腹主动脉旁孵育0.5mol/L CaCl₂后，持续4周腹腔注射氢气饱和生理盐水(5ml/kg/d)。氢气治疗组在给予0.5mol/L CaCl₂建模后，先腹腔注射生理盐水(5ml/kg/d)2周，再腹腔注射氢气饱和生理盐水(5ml/kg/d)2周。另一组大鼠，腹腔注射生理盐水(5ml/kg/d)4周，作为阴性对照组。

(二)模型建立

大鼠腹主动脉瘤模型制备采用经典的腹主动脉旁孵育0.5mol/L CaCl₂方法。200～220g雄性SD大鼠，戊巴比妥钠(国药集团化学试剂北京有限公司)麻醉(300mg/kg，腹腔注射)后，仰卧位固定。碘伏消毒，取腹部正中切口，上至界剑突下1cm，向下延续长5cm，逐层剪开皮肤、皮下组织、腹膜，暴露腹腔脏器。探查腹腔内脏器无异常。将肠管轻柔向右推出腹腔，置于生理盐水润湿的纱布块上，其上覆盖生理盐水湿润纱布。观察腹膜后血管形态有无异常。以盐水棉签钝性分离腹主动脉前壁及侧壁结缔组织，显露肾下至髂动脉分叉的腹主动脉，期间注意保护输尿管。将浸泡于0.5mol/L CaCl₂溶液的棉花块放置于游离的腹主动脉上方，15min后移除棉花块。用消毒纱布小心吸干腹腔残留的CaCl₂溶液，并用无菌生理盐水冲洗周围的组织，以减少其对周围组织的损伤。仔细检查并止血，观察肠管颜色正常后将其复位，逐层关腹。4周实验结束后，大鼠再次麻醉开腹，分离取出腹主动脉组织，部分浸泡于含10％福尔马林的溶液中，组织固定。其余-80℃冰冻保存。

(三)氢气饱和生理盐水的制备

在0.5MPa压力下加压暴露4小时，将纯氢气溶解在无菌生理盐水中至饱和状态，分装到排除气体的医用密封软包装袋中，常压4℃保存备用。

(四)腹主动脉直径的定量检测

实验前(第一次开腹)和实验终点(二次开腹)时应用对照会属杆(直径0.81mm)平行放置于血管旁，作为参照，进行拍照，使用Image-Pro Plus 6.0专业分析软件测量肾下腹主动脉直径，由至少2名合格但并不知晓实验分组的工作人员独立完成测量，至少取20个不同的横截面进行测量，最后求得最大直径。以实验前后腹主动脉最大直径增加大于50％为诊断腹主动脉瘤的标准。根据第二次开腹测量结果，比较四组间大鼠腹主动脉最大直径。

(五)组织染色

福尔马林固定完全的动脉组织标本制成常规石蜡切片，厚约5μm，分别行常规HE染色；用醛品红染液行弹力纤维的特殊染色，其中弹力纤维染成紫色；MMP-2及MMP-9免疫组织化学染色(兔源MMP-2多克隆抗体、鼠源MMP-9单克隆抗体，规格：1.0mg/ml，英国Abcam公司)，以磷酸盐缓冲液代替一抗作阴性对照，DAB显色，阳性表现为细胞质、细胞膜或细胞核上有棕褐色颗粒样沉淀。在100倍和400倍显微镜下观察两组血管结构、血管损伤程度、炎症细胞浸润程度，弹力纤维的破坏和降解，血管壁MMP-2、MMP-9表达情况等。

(六)组织蛋白定量检测

取腹主动脉组织，用冰冷的生理盐水漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重，放入已洗干净的组织匀浆器中，然后按体积重量比为1∶9的比例量取预冷的生理盐水，移入组织匀浆器中，充分研磨，使组织匀浆化，然后将匀浆转移到5ml的离心管中，4℃下4000rpm/min离心10min，将离心好的匀浆留上清弃下面沉淀，即得到10％腹主动脉组织匀浆。以酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒(MultiSciences公司)定量检测腹主动脉组织上清液中的IL-1β和TNF-α的含量。以分光光度法，参照(南京建成生物工程研究所)试剂盒的使用说明，检测腹主动脉组织上清液中的MDA、SOD含量。

(七)实时荧光定量PCR检测

1.设计引物序列

见第9页(末页)

2.实验步骤

取腹主动脉组织提取总RNA，提取采用Trizol试剂，按试剂盒(Qiagen，德国)说明进行。在实时检测扩增仪上扩增并检测荧光。反应体系见下表

内参照GAPDH的反应体系相同。反应条件：95℃预变性2min，以95℃20s变性，59℃25s复性，72℃30s延伸，同时检测荧光进行45个循环。以各组2^-ΔΔCT为MMP-2、MMP-9、CKLF-1基因的相对量。

(八)统计学分析

实验结果用均值±标准差表示，使用chiss专业统计软件，对预防以及治疗不同实验处理组采用单因素方差分析，当方差分析结果为多组间差异具有统计学意义时，再用SNK-q检验进行多重比较。P＜0.05认为有统计学差异。

(九)实验结果见图1～图13

(十)实验结论：

(1)腹腔注射氢气饱和生理盐水能抑制血管扩张，减小腹主动脉瘤的最大直径(预防组从3.35mm降到2.22mm，治疗组从3.35mm降到2.64mm)。

(2)腹腔注射氢气饱和生理盐水能减少血管壁蛋白水解酶的表达(MMP-2mRNA：预防组从11.79降到2.40，治疗组从11.79降到6.02；MMP-9mRNA：预防组从6.74降到2.88，治疗组从6.74降到4.52)，抑制血管弹力纤维的降解。

(3)腹腔注射氢气饱和生理盐水能改善炎症细胞浸润，减少炎症介质释放(IL-1β：预防组从164.83pg/ml降到81.22pg/ml，治疗组从164.83pg/ml降到113.79pg/ml；TNF-α：预防组从359.61pg/ml降到109.07pg/ml，治疗组从359.61pg/ml降到245.43pg/ml；CKLF-1mRNA：预防组从4.56降到2.34，治疗组表达不受影响)，减轻炎症损伤。

(4)腹腔注射氢气饱和生理盐水能减轻组织过氧化(MDA：预防组从4.95U/mg降到1.36U/mg，治疗组从4.95U/mg降到2.93U/mg)，增强抗氧化酶活性(SOD：治疗组从71.56U/ml升到84.94，预防组不受影响)，减轻氧化应激。

设计引物序列

GAPDH 575bp

上游：5′-CCATCACCATCTTCCAGGAG-3′

下游：5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3′

MMP-2 217bp

上游：5′-GCTGATACTGACACTGGTACTG-3′

下游：5′-CAATCTTTTCTGGGAGCTC-3′

MMP-9 280bp

上游：5′-AAGGATGGTCTACTGGCAC-3′

下游：5′-AGAGATTCTCACTGGGGC-3′

CKLF-1 85bp

上游：5′-CGCACGCGCGTCTGGACTTA-3′

下游：5′-TGCTCTCCAGGACTCGCGCA-3′

Claims (3)

1.氢气饱和生理盐水在制备防治腹主动脉瘤药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物制成注射剂或口服液剂。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物有效剂量为5ml/kg/d。