CN103525703A - 一种以乙酰甲胺磷为底物的降解菌株的筛选方法 - Google Patents
一种以乙酰甲胺磷为底物的降解菌株的筛选方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103525703A CN103525703A CN201310472888.4A CN201310472888A CN103525703A CN 103525703 A CN103525703 A CN 103525703A CN 201310472888 A CN201310472888 A CN 201310472888A CN 103525703 A CN103525703 A CN 103525703A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- acephate
- degradation bacteria
- screening
- take
- cultivated
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种以乙酰甲胺磷为底物的降解菌株的筛选方法，包括以下步骤：1）降解菌的富集；2）降解菌的驯化培养；3）降解菌平板培养；4）降解菌平板划线分离单菌落；5）降解菌透明圈筛选。应用该方法得到的降解菌可以利用乙酰甲胺磷为唯一碳源，并有效降解乙酰甲胺磷农药。本发明提供的以乙酰甲胺磷为底物的降解菌株的筛选方法可以用于其它有机磷类杀虫剂降解菌株的筛选，在农药残留降解菌株的筛选方面提供了一定的理论指导。
Description
技术领域
本发明涉及生物降解农药残留技术领域，具体地说是一种以乙酰甲胺磷为底物的降解菌株的筛选方法。
背景技术
乙酰甲胺磷(Acephate)又名高灭磷，化学名称为O,S-二甲基乙酰基硫代磷酰胺酯。乙酰甲胺磷属低毒杀虫剂，具有胃毒和触杀作用，可杀卵并有一定的熏蒸作用，原药大鼠经口LD50值为945mg/kg。自2007年1月1日起我国全面禁用甲胺磷等5种高毒农药后，乙酰甲胺磷作为多种高毒有机磷农药的替代品被广泛推广。
乙酰甲胺磷的药效和甲胺磷相当，但毒性是甲胺磷的1/30，主要用于蔬菜、茶叶等经济作物上。但乙酰甲胺磷只有不到0.1%的量到达靶生物，高达99.9%的农药则散布到环境中，对微生物、植物及生态环境产生潜在危害。因此，由乙酰甲胺磷带来的危害环境安全以及食品安全问题迫切需要解决，而利用微生物去除农药残留是一种十分有效的方法。
利用生态系统中微生物代谢类型的多样性、生化适应能力的极强性以及能迅速产生相应酶系的应急性来降解各类人工合成的农药，使其完全降解成无机物是目前最有潜力的有效方法之一。乙酰甲胺磷的微生物降解研究起步较晚、成果也较少，迄今为止，国内外仅有几篇报道。因此，分离、筛选具有高效降解乙酰甲胺磷农药的微生物对消除农药污染、净化环境和社会的可持续发展具有重要的现实意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种以乙酰甲胺磷为底物的降解菌株的筛选方法，通过寻找高效降解乙酰甲胺磷的菌株，以期能够有效控制农药造成的环境污染与危害。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种以乙酰甲胺磷为底物的降解菌株的筛选方法，包括以下步骤：
1）降解菌的富集培养：称取长期受农药污染的活性污泥或土样于富集培养基中，培养条件为25-37℃，摇床培养5-9天，共转接4次，以培养液5-25wt%的接种量转接入含有乙酰甲胺磷浓度梯度递增的富集培养基中；
所述富集培养基的组份包括：MgSO4·7H2O0.1-0.5g/L，K2HPO40.05-0.2g/L，(NH4)2SO40.05-0.2g/L，CaSO40.01-0.1g/L，FeSO4·7H2O0.001-0.005g/L，葡萄糖5-20g/L，蛋白胨1-10g/L，pH为6.0-8.0；
2）降解菌的驯化培养：取步骤1)中培养的最终富集菌液，以5-25wt%的接种量转接到基础培养基中，添加乙酰甲胺磷进行驯化培养，培养条件为25-37℃，摇床培养5-9天，如此重复进行3次驯化；
所述基础培养基的组成包括：MgSO4·7H2O0.1-0.5g/L，K2HPO40.1-0.5g/L，(NH4)2SO40.1-0.5g/L，CaSO40.05-0.1g/L，FeSO4·7H2O0.001-0.005g/L，酵母膏0.01-0.1g/L，pH为6.0-8.0；
3）降解菌平板培养：取步骤2)中培养的最终驯化菌液稀释104-105后，涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上，25-37℃恒温倒置培养3-7天，获得降解菌的菌落；
所述牛肉膏蛋白胨固体培养基的组成包括：牛肉膏1-10g/L，胰蛋白胨5-20g/L，NaCl5-20g/L，pH为6.0-8.0；
4）降解菌平板划线分离单菌落：取步骤3)中涂布培养的菌落，划线培养于所述牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上，25-37℃恒温倒置培养3-7天，获得降解菌的单菌落；
5）降解菌筛选：取步骤4)分离获得的单菌落，点涂于添加有乙酰甲胺磷的筛选培养基中，25-37℃恒温倒置培养3-7天，挑选能够生长并有明显透明圈的菌株，作为筛选的以乙酰甲胺磷为唯一碳源的降解菌株；
所述筛选培养基的组成包括：葡萄糖5-20g/L，MgSO4·7H2O0.1-0.5g/L，KCl0.1-0.5g/L，MnSO4·H2O0.01-0.05g/L，(NH4)2·SO40.1-1g/L，NaCl0.1-0.5g/L，FeSO4·7H2O0.01-0.05g/L，CaCO31-10g/L，琼脂1.8%-2.0%，pH为6.0-8.0。
优选地，所述步骤1）中的富集培养基中，降解菌首次培养时乙酰甲胺磷的浓度为100mg/L，在之后的转接过程中，富集培养基中的乙酰甲胺磷浓度以100mg/L的梯度递增。
优选地，所述步骤2）中基础培养基中添加的乙酰甲胺磷浓度为500mg/L。
优选地，所述步骤5）中筛选培养基中添加的乙酰甲胺磷浓度为50-500mg/L。
优选地，所述步骤5）中筛选培养基中添加的乙酰甲胺磷浓度为100mg。
优选地，所述步骤1）中所述富集培养基的组成包括：MgSO4·7H2O0.2g/L，K2HPO40.1g/L，(NH4)2SO40.1g/L，CaSO40.04g/L，FeSO4·7H2O0.001g/L，葡萄糖10.0g/L，蛋白胨5.0g/L，pH为7.0。
优选地，所述步骤2）中所述基础培养基的组成包括：MgSO4·7H2O0.4g/L，K2HPO40.2g/L，(NH4)2SO40.2g/L，CaSO40.08g/L，FeSO4·7H2O0.002g/L，酵母膏0.05g/L，pH为7.0。
优选地，所述牛肉膏蛋白胨固体培养基的组成包括：牛肉膏5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl10g/L，pH为7.0。
优选地，所述步骤5）中所述筛选培养基的组成包括：葡萄糖10g/L，MgSO4·7H2O0.3g/L，KCl0.3g/L，MnSO4·H2O0.03g/L，(NH4)2·SO40.5g/L，NaCl0.3g/L，FeSO4·7H2O0.03g/L，CaCO35g/L，琼脂2.0%，pH为7.0。
本发明具有以下有益效果：
1）本发明釆用的筛选方法中通过设计菌体筛选的各种培养基的组成配方，从田间土壤中获得能够有效降解有机磷农药的菌株。所筛选的菌株对于乙酰甲胺磷、对硫磷、甲基对硫磷、甲胺磷、氧化乐果、敌敌畏和毒死蜱均具有良好的消解效果。其中，所筛选的菌株对于乙酰甲胺磷的消解效果最好，消解率达到87%以上，在优选的培养基组成配方的情况下所筛选的菌株，则能够将乙酰甲胺磷完全消解。所述的筛选方法简单易行、经济廉价，所得菌株可以用来制备乙酰甲胺磷的降解菌剂，在实践中有很好的应用潜力。
2）本发明利用长期受乙酰甲胺磷污染的田间土壤为处理对象，所得的降解菌是田间土壤中的土著菌，制成菌剂后田间应用不易被排斥，效果会更好。
3）本发明提供的以乙酰甲胺磷为底物的降解菌株的筛选方法可以用于其它有机磷类杀虫剂降解菌株的筛选，在农药残留降解菌株的筛选方面提供了一定的理论指导。
附图说明
图1为本发明实施例中降解菌降解乙酰甲胺磷水解圈。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。
实施例1
1、以乙酰甲胺磷为底物的降解菌株的筛选
1）降解菌的富集培养：称取5g长期受农药污染的活性污泥或土样于50ml富集培养基中，所述富集培养基中乙酰甲胺磷的浓度为100mg/L，培养条件为25℃，120r/min摇床培养5天。然后以培养液5wt%的接种量转接入新鲜富集培养基中，即转接量按质量百分比为新鲜富集培养液的5%，转接的富集培养基中的乙酰甲胺磷的浓度提高为200mg/L，以后每培养5天转接一次，每次转接的富集培养基中的乙酰甲胺磷的浓度以100mg/L的梯度递增，直至乙酰甲胺磷在培养液中的浓度达到500mg/L，每次转接后的菌体培养条件相同。
所述富集培养基的制备方法为：称取MgSO4·7H2O0.1g，K2HPO40.05g，(NH4)2SO40.05g，CaSO40.01g，FeSO4·7H2O0.001g，葡萄糖5g，蛋白胨1g，加去离子水至1000mL，调pH为6.0，于0.1MPa、121℃灭菌20min；待培养基冷却到50℃时，添加乙酰甲胺磷分别为100mg、200mg、300mg、400mg、500mg；获得乙酰甲胺磷浓度分别为100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L的富集培养基。
2）降解菌的驯化培养：取步骤1)中培养的最终富集菌液，以5wt%的接种量转接到基础培养基中，培养条件为25℃，120r/min摇床培养5天。以上述相同培养条件，反复培养3次进行驯化。
所述基础培养基的制备方法为：称取MgSO4·7H2O0.1g，K2HPO40.1g，(NH4)2SO40.1g，CaSO40.05g，FeSO4·7H2O0.001g，酵母膏0.01g，加去离子水1L，调pH为6.0，于0.1MPa、121℃灭菌20min；待培养基冷却到50℃时，添加乙酰甲胺磷，使乙酰甲胺磷的浓度为500mg/L。
3）降解菌平板培养：取步骤2)中培养的最终驯化菌液稀释104-105后，涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上，25℃恒温倒置培养3天，获得降解菌的菌落。
所述牛肉膏蛋白胨固体培养基的制备方法为：称取牛肉膏1g，胰蛋白胨5g，NaCl5g，加去离子水溶解后调pH为6.0，定容至1L，于0.1MPa、121℃灭菌20min。
4）降解菌平板划线分离单菌落：将步骤3)中涂布培养的菌落，划线培养于牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上，25℃恒温倒置培养3天，获得降解菌的单菌落（菌株）。
5）降解菌透明圈筛选：将步骤4)分离获得的单菌落（菌株），一部分划线培养于牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上以备保存菌株，另一部分点涂于透明圈筛选培养基，25℃恒温倒置培养3天，能够生长并有明显透明圈的菌株即为筛选的以乙酰甲胺磷为唯一碳源的降解菌株，命名为SWS-10003。
所述筛选培养基的制备方法为：称取葡萄糖5g，MgSO4·7H2O0.1g，KCl0.1g，MnSO4·H2O0.01g，(NH4)2·SO40.1，NaCl0.1g，FeSO4·7H2O0.01g，CaCO31g，加去离子水至1000mL，调pH为6.0；加琼脂1.8%，包装好；于0.1MPa、121℃灭菌20min；乙酰甲胺磷添加量为50mg。
2、筛选菌株SWS-10003对有机磷农药降解能力的鉴定
将保存于斜面上的筛选菌株SWS-10003接种于含有0.5mg/mL乙酰甲胺磷的液体基础培养基中活化，将活化好的菌转接于50mL LB培养基中大量培养，将生长至对数生长期的菌离心收集菌体，去除培养基，并将菌用Burk无机盐培养基洗两次以彻底去除细菌表面上粘的LB完全培养基。用50mLBurk无机盐培养基将菌体悬起，取2%接种于5mL Burk液体无机盐培养基中，在此培养基中分别加有乙酰甲胺磷、对硫磷、甲基对硫磷、甲胺磷、氧化乐果、敌敌畏和毒死蜱，同时做对照，空白对照中的有机磷农药量与实验管相同，但未接种菌液，而是用Burk培养基代替。在32℃摇床上震荡培养36小时后，分别用氯仿萃取培养液，气相色谱测定培养基中各种农药的含量，结果列于表1中。空白对照中的有机磷农药均未消解，数据未列于表中。
从表所列的结果可以看出，此菌对于乙酰甲胺磷的消解效果最好，经过培养后乙酰甲胺磷已被消解87%。
表1不同农药与筛选菌株培养36小时后的农药残留量
注：消解率(%)=(培养前的农药量-培养后农药的剩余量)/培养前的农药量
实施例2
1、以乙酰甲胺磷为底物的降解菌株的筛选
1）降解菌的富集培养：称取5g长期受农药污染的活性污泥或土样于50ml富集培养基中，所述富集培养基中乙酰甲胺磷的浓度为100mg/L，培养条件为37℃，120r/min摇床培养9天。然后以培养液25wt%的接种量转接入新鲜富集培养基中，即转接量按质量百分比为新鲜富集培养液的25%，转接的富集培养基中的乙酰甲胺磷的浓度提高为200mg/L；以后每培养9天转接一次，每次转接的富集培养基中的乙酰甲胺磷的浓度以100mg/L的梯度递增，直至乙酰甲胺磷在培养液中的浓度达到500mg/L，每次转接后的菌体培养条件相同。
所述富集培养基的制备方法为：称取MgSO4·7H2O0.5g，K2HPO40.2g，(NH4)2SO40.2g，CaSO40.1g，FeSO4·7H2O0.005g，葡萄糖20g，蛋白胨10g，加去离子水至1000mL，调pH为8.0，于0.1MPa、121℃灭菌20min；待培养基冷却到60℃时，添加乙酰甲胺磷分别为100mg、200mg、300mg、400mg、500mg；获得乙酰甲胺磷浓度分别为100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L的富集培养基。2）降解菌的驯化培养：取步骤1)中培养的最终富集菌液，以25wt%的接种量转接到基础培养基中，培养条件为37℃，120r/min摇床培养9天。以上述相同培养条件，反复培养3次进行驯化。
所述基础培养基的制备方法为：称取MgSO4·7H2O0.5g，K2HPO40.5g，(NH4)2SO40.5g，CaSO40.1g，FeSO4·7H2O0.005g，酵母膏0.1g，加去离子水1L，调pH为8.0，于0.1MPa、121℃灭菌20min；待培养基冷却到60℃时，添加乙酰甲胺磷，使乙酰甲胺磷的浓度为500mg/L。3）降解菌平板培养：取步骤2)中培养的最终驯化菌液稀释104-105后，涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上，37℃恒温倒置培养7天，获得降解菌的菌落。
所述牛肉膏蛋白胨固体培养基的制备方法为：称取牛肉膏10g，胰蛋白胨20g，NaCl20g，加去离子水溶解后调pH为8.0，定容至1L，于0.1MPa、121℃灭菌20min。
4）降解菌平板划线分离单菌落：将步骤3)中涂布培养的菌落，划线培养于牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上，37℃恒温倒置培养7天，获得降解菌的单菌落（菌株）。
5）降解菌透明圈筛选：将步骤4)分离获得的单菌落（菌株），一部分划线培养于牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上以备保存菌株，另一部分点涂于透明圈筛选培养基，37℃恒温倒置培养7天，能够生长并有明显透明圈的菌株即为筛选的以乙酰甲胺磷为唯一碳源的降解菌株，命名为SWS-20011。
所述筛选培养基的制备方法为：称取葡萄糖20g，MgSO4·7H2O0.5g，KCl0.5g，MnSO4·H2O0.05g，(NH4)2·SO41g，NaCl0.5g，FeSO4·7H2O0.05g，CaCO310g，加去离子水至1000mL，调pH为8.0；加琼脂2.0%，包装好；于0.1MPa、121℃灭菌20min；乙酰甲胺磷添加量为500mg。
2、筛选菌株SWS-20011对有机磷农药降解能力的鉴定
将保存于斜面上的筛选菌株SWS-20011接种于含有0.5mg/mL乙酰甲胺磷的液体基础培养基中活化，将活化好的菌转接于50mL LB培养基中大量培养，将生长至对数生长期的菌离心收集菌体，去除培养基，并将菌用Burk无机盐培养基洗两次以彻底去除细菌表面上粘的LB完全培养基。用50mLBurk无机盐培养基将菌体悬起，取2%接种于5mL Burk液体无机盐培养基中，在此培养基中分别加有乙酰甲胺磷、对硫磷、甲基对硫磷、甲胺磷、氧化乐果、敌敌畏和毒死蜱，同时做对照，空白对照中的有机磷农药量与实验管相同，但未接种菌液，而是用Burk培养基代替。在32℃摇床上震荡培养36小时后，分别用氯仿萃取培养液，气相色谱测定培养基中各种农药的含量，结果列于表2中。空白对照中的有机磷农药均未消解，数据未列于表中。
从表所列的结果可以看出，此菌对于乙酰甲胺磷的消解效果最好，经过培养后乙酰甲胺磷已被消解91%。
表2不同农药与筛选菌株培养36小时后的农药残留量
注：消解率(%)=(培养前的农药量-培养后农药的剩余量)/培养前的农药量
实施例3
1、以乙酰甲胺磷为底物的降解菌株的筛选
1）降解菌的富集培养：称取5g长期受农药污染的活性污泥或土样于50ml富集培养基中，所述富集培养基中乙酰甲胺磷的浓度为100mg/L，培养条件为35℃，120r/min摇床培养7天。然后以培养液15wt%的接种量转接入新鲜富集培养基中，即转接量按质量百分比为新鲜富集培养液的15%，转接的富集培养基中的乙酰甲胺磷的浓度提高为200mg/L，以后每培养7天转接一次，每次转接的富集培养基中的乙酰甲胺磷的浓度以100mg/L的梯度递增，直至乙酰甲胺磷在培养液中的浓度达到500mg/L，每次转接后的菌体培养条件相同。
所述富集培养基的制备方法为：称取MgSO4·7H2O0.2g，K2HPO40.1g，(NH4)2SO40.1g，CaSO40.04g，FeSO4·7H2O0.001g，葡萄糖10.0g，蛋白胨5.0g，加去离子水至1000mL，调pH为7.0，于0.1MPa、121℃灭菌20min；待培养基冷却到55℃时，添加乙酰甲胺磷分别为100mg、200mg、300mg、400mg、500mg；获得乙酰甲胺磷浓度分别为100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L的富集培养基。
2）降解菌的驯化培养：取步骤1)中培养的最终富集菌液，以15wt%的接种量转接到基础培养基中，培养条件为35℃，120r/min摇床培养7天。以上述相同培养条件，反复培养3次进行驯化。
所述基础培养基的制备方法为：称取MgSO4·7H2O0.4g，K2HPO40.2g，(NH4)2SO40.2g，CaSO40.08g，FeSO4·7H2O0.002g，酵母膏0.05g，去离子水1L，调pH为7.0；于0.1MPa、121℃灭菌20min；待培养基冷却到55℃时，添加乙酰甲胺磷，使乙酰甲胺磷的浓度为500mg/L。
3）降解菌平板培养：取步骤2)中培养的最终驯化菌液稀释104-105后，涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上，30-35℃恒温倒置培养3-4天，获得降解菌的菌落。
所述牛肉膏蛋白胨固体培养基的制备方法为：称取牛肉膏5g，胰蛋白胨10g，NaCl10g，加去离子水溶解后调pH为7.0，定容至1L，于0.1MPa、121℃灭菌20min。
4）降解菌平板划线分离单菌落：将步骤3)中涂布培养的菌落，划线培养于牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上，30-35℃恒温倒置培养3-4天，获得降解菌的单菌落（菌株）。
5）降解菌透明圈筛选：将步骤4)分离获得的单菌落（菌株），一部分划线培养于牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上以备保存菌株，另一部分点涂于透明圈筛选培养基，30-35℃恒温倒置培养3-4天，能够生长并有明显透明圈的菌株即为筛选的以乙酰甲胺磷为唯一碳源的降解菌株，命名为SWS-30001。
所述筛选培养基的制备方法为：称取葡萄糖10g，MgSO4·7H2O0.3g，KCl0.3g，MnSO4·H2O0.03g，(NH4)2SO40.5g，NaCl0.3g，FeSO4·7H2O0.03g，CaCO35g，加去离子水至1000mL，调pH为7.0；加琼脂2.0%，包装好；于0.1MPa、121℃灭菌20min；乙酰甲胺磷添加量为100mg。
2、筛选菌株SWS-30001对有机磷农药降解能力的鉴定将保存于斜面上的筛选菌株SWS-30001接种于含有0.5mg/mL乙酰甲胺磷的液体基础培养基中活化，将活化好的菌转接于50mL LB培养基中大量培养，将生长至对数生长期的菌离心收集菌体，去除培养基，并将菌用Burk无机盐培养基洗两次以彻底去除细菌表面上粘的LB完全培养基。用50mL Burk无机盐培养基将菌体悬起，取2%接种于5mL Burk液体无机盐培养基中，在此培养基中分别加有乙酰甲胺磷、对硫磷、甲基对硫磷、甲胺磷、氧化乐果、敌敌畏和毒死蜱，同时做对照，空白对照中的有机磷农药量与实验管相同，但未接种菌液，而是用Burk培养基代替。在32℃摇床上震荡培养36小时后，分别用氯仿萃取培养液，气相色谱测定培养基中各种农药的含量，结果列于表3中。空白对照中的有机磷农药均未消解，数据未列于表中。
从表所列的结果可以看出，此菌对于乙酰甲胺磷的消解效果最好，经过培养后乙酰甲胺磷已被完全消解，未从培养液中检出。
表3不同农药与筛选菌株培养36小时后的农药残留量
注：消解率(%)=(培养前的农药量-培养后农药的剩余量)/培养前的农药量
将上述筛选的菌株降解乙酰甲胺磷水解圈的培养平板拍照分析，结果见图1。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
Claims (9)
1.一种以乙酰甲胺磷为底物的降解菌株的筛选方法，包括以下步骤：
1）降解菌的富集培养：称取长期受农药污染的活性污泥或土样于富集培养基中，培养条件为25-37℃，摇床培养5-9天，共转接4次，以培养液5-25wt%的接种量转接入含有乙酰甲胺磷浓度梯度递增的富集培养基中；
所述富集培养基的组份包括：MgSO4·7H2O0.1-0.5g/L，K2HPO40.05-0.2g/L，(NH4)2SO40.05-0.2g/L，CaSO40.01-0.1g/L，FeSO4·7H2O0.001-0.005g/L，葡萄糖5-20g/L，蛋白胨1-10g/L，pH为6.0-8.0；
2）降解菌的驯化培养：取步骤1)中培养的最终富集菌液，以5-25wt%的接种量转接到基础培养基中，添加乙酰甲胺磷进行驯化培养，培养条件为25-37℃，摇床培养5-9天，如此重复进行3次驯化；
所述基础培养基的组成包括：MgSO4·7H2O0.1-0.5g/L，K2HPO40.1-0.5g/L，(NH4)2SO40.1-0.5g/L，CaSO40.05-0.1g/L，FeSO4·7H2O0.001-0.005g/L，酵母膏0.01-0.1g/L，pH为6.0-8.0；
3）降解菌平板培养：取步骤2)中培养的最终驯化菌液稀释104-105后，涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上，25-37℃恒温倒置培养3-7天，获得降解菌的菌落；
所述牛肉膏蛋白胨固体培养基的组成包括：牛肉膏1-10g/L，胰蛋白胨5-20g/L，NaCl5-20g/L，pH为6.0-8.0；
4）降解菌平板划线分离单菌落：取步骤3)中涂布培养的菌落，划线培养于所述牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上，25-37℃恒温倒置培养3-7天，获得降解菌的单菌落；
5）降解菌筛选：取步骤4)分离获得的单菌落，点涂于添加有乙酰甲胺磷的筛选培养基中，25-37℃恒温倒置培养3-7天，挑选能够生长并有明显透明圈的菌株，作为筛选的以乙酰甲胺磷为唯一碳源的降解菌株；
所述筛选培养基的组成包括：葡萄糖5-20g/L，MgSO4·7H2O0.1-0.5g/L，KCl0.1-0.5g/L，MnSO4·H2O0.01-0.05g/L，(NH4)2·SO40.1-1g/L，NaCl0.1-0.5g/L，FeSO4·7H2O0.01-0.05g/L，CaCO31-10g/L，琼脂1.8%-2.0%，pH为6.0-8.0。
2.根据权利要求1所述的以乙酰甲胺磷为底物的降解菌株的筛选方法，其特征在于：所述步骤1）中的富集培养基中，降解菌首次培养时乙酰甲胺磷的浓度为100mg/L，在之后的转接过程中，富集培养基中的乙酰甲胺磷浓度以100mg/L的梯度递增。
3.根据权利要求1所述的以乙酰甲胺磷为底物的降解菌株的筛选方法，其特征在于：所述步骤2）中基础培养基中添加的乙酰甲胺磷浓度为500mg/L。
4.根据权利要求1所述的以乙酰甲胺磷为底物的降解菌株的筛选方法，其特征在于：所述步骤5）中筛选培养基中添加的乙酰甲胺磷浓度为50-500mg/L。
5.根据权利要求1所述的以乙酰甲胺磷为底物的降解菌株的筛选方法，其特征在于：所述步骤5）中筛选培养基中添加的乙酰甲胺磷浓度为100mg。
6.根据权利要求1所述的以乙酰甲胺磷为底物的降解菌株的筛选方法，其特征在于，所述步骤1）中所述富集培养基的组成包括：MgSO4·7H2O0.2g/L，K2HPO40.1g/L，(NH4)2SO40.1g/L，CaSO40.04g/L，FeSO4·7H2O0.001g/L，葡萄糖10.0g/L，蛋白胨5.0g/L，pH为7.0。
7.根据权利要求1所述的以乙酰甲胺磷为底物的降解菌株的筛选方法，其特征在于，所述步骤2）中所述基础培养基的组成包括：MgSO4·7H2O0.4g/L，K2HPO40.2g/L，(NH4)2SO40.2g/L，CaSO40.08g/L，FeSO4·7H2O0.002g/L，酵母膏0.05g/L，pH为7.0。
8.根据权利要求1所述的以乙酰甲胺磷为底物的降解菌株的筛选方法，其特征在于，所述牛肉膏蛋白胨固体培养基的组成包括：牛肉膏5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl10g/L，pH为7.0。
9.根据权利要求1所述的以乙酰甲胺磷为底物的降解菌株的筛选方法，其特征在于，所述步骤5）中所述筛选培养基的组成包括：葡萄糖10g/L，MgSO4·7H2O0.3g/L，KCl0.3g/L，MnSO4·H2O0.03g/L，(NH4)2·SO40.5g/L，NaCl0.3g/L，FeSO4·7H2O0.03g/L，CaCO35g/L，琼脂2.0%，pH为7.0。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310472888.4A CN103525703A (zh) | 2013-10-11 | 2013-10-11 | 一种以乙酰甲胺磷为底物的降解菌株的筛选方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310472888.4A CN103525703A (zh) | 2013-10-11 | 2013-10-11 | 一种以乙酰甲胺磷为底物的降解菌株的筛选方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103525703A true CN103525703A (zh) | 2014-01-22 |
Family
ID=49928057
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310472888.4A Pending CN103525703A (zh) | 2013-10-11 | 2013-10-11 | 一种以乙酰甲胺磷为底物的降解菌株的筛选方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103525703A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107457270A (zh) * | 2017-10-04 | 2017-12-12 | 李萍 | 一种利用生物技术修复有机磷农药污染土壤的方法 |
| CN107699498A (zh) * | 2017-10-04 | 2018-02-16 | 李萍 | 一种降解有机磷农药的复合微生物制剂及其制备方法 |
| CN114015637A (zh) * | 2021-11-29 | 2022-02-08 | 浙江海洋大学 | 一种苯甲酰二甲基铵类化合物降解菌团的筛选方法及其应用 |
-
2013
- 2013-10-11 CN CN201310472888.4A patent/CN103525703A/zh active Pending
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 于彩虹等: "2株乙酰甲胺磷降解菌的分离鉴定及降解特性研究", 《环境工程学报》 * |
| 解开治等: "乙酰甲胺磷降解菌株XP-3的分离鉴定及其生理特性研究", 《广东农业科学》 * |
| 龙家茹: "乙酰甲胺磷高效降解菌的筛选与鉴定", 《安徽农业科学》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107457270A (zh) * | 2017-10-04 | 2017-12-12 | 李萍 | 一种利用生物技术修复有机磷农药污染土壤的方法 |
| CN107699498A (zh) * | 2017-10-04 | 2018-02-16 | 李萍 | 一种降解有机磷农药的复合微生物制剂及其制备方法 |
| CN114015637A (zh) * | 2021-11-29 | 2022-02-08 | 浙江海洋大学 | 一种苯甲酰二甲基铵类化合物降解菌团的筛选方法及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kulshrestha et al. | Fungal degradation of chlorpyrifos by Acremonium sp. strain (GFRC-1) isolated from a laboratory-enriched red agricultural soil | |
| Ghanem et al. | Biodegradation of chlorphyrifos by Klebsiella sp. isolated from an activated sludge sample of waste water treatment plant in damascus | |
| CN102994404B (zh) | 一株降解多环芳烃的菌株及其与表面活性剂协同在土壤修复中的应用 | |
| Sharma et al. | Biodegradation of imidacloprid by consortium of two soil isolated Bacillus sp. | |
| Ma et al. | Co-metabolic transformation of the neonicotinoid insecticide imidacloprid by the new soil isolate Pseudoxanthomonas indica CGMCC 6648 | |
| CN104429211A (zh) | 一种土壤熏蒸消毒及活化的方法 | |
| CN102757896A (zh) | 高效微生物土壤修复剂 | |
| Cai et al. | Biodegradation of benazolin-ethyl by strain Methyloversatilis sp. cd-1 isolated from activated sludge | |
| CN102757915A (zh) | 一种氯代乙酰胺类除草剂降解菌及其生产的菌剂和应用 | |
| CN104630113A (zh) | 一种可降解有机磷农药的解淀粉芽孢杆菌及其在降解有机磷农药中的应用 | |
| CN101338284B (zh) | 一株可高效降解杀菌剂百菌清的降解菌及其应用 | |
| Zhang et al. | An ecological technology of coastal saline soil amelioration | |
| CN107541479B (zh) | 一种杀虫剂右旋苯醚菊酯降解菌株及其菌剂和降解工艺 | |
| CN103525703A (zh) | 一种以乙酰甲胺磷为底物的降解菌株的筛选方法 | |
| CN102154103A (zh) | 一种广谱降解有机磷杀虫剂的细菌复合菌剂及其制备方法 | |
| CN109651016A (zh) | 一种微生物有机肥及其制备方法 | |
| CN106434442A (zh) | 一种有机磷农药的降解修复剂的制备方法 | |
| CN102154111A (zh) | 一种广谱降解有机磷杀虫剂的真菌菌剂 | |
| CN103964928B (zh) | 微生物土壤修复剂的制备方法 | |
| WO2019058390A1 (en) | METHOD FOR ISOLATING AND CULTIVATION OF NON-CULTIVABLE ENDOPHYTES | |
| CN102533928A (zh) | 一种以多环芳烃为底物的降解菌的筛选方法 | |
| CN105062917A (zh) | 一种氯代乙酰胺类除草剂降解菌株及其生产的菌剂和应用 | |
| Mohapatra et al. | Enhancement of carbofuran degradation by soil enrichment cultures, bacterial cultures and by synergistic interaction among bacterial cultures | |
| CN102864086B (zh) | 一株降解多环芳烃的菌株及其在土壤修复中的应用 | |
| CN106754497A (zh) | 一种克雷氏肺炎杆菌及其菌剂和制备方法与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20140122 |