CN103451279B - 一种基于solid测序技术的基因snp位点检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种基于SOLiD测序的SNP位点检测方法。其具体步骤如下：（1）通过SOLiD测序获得待测基因样本的颜色序列；（2）预备参考序的颜色序列；（3）制备颜色编码参考序的索引表以备快速定位样本序；（4）将SOLID测序样本序和颜色编码参考序进行比对，找出样本序在参考序中的最佳匹配位置；比对样本序与参考序，获取颜色编码匹配信息；（5）根据颜色编码的匹配信息，分析SOLiD样本序与颜色编码的参考序的碱基匹配信息，确定不确定变异点；（6）统计获得的不确定变异点，去除噪声和测序错误导致的不确定变异点，从而获得样本SNP位点。采用本发明的SNP检测方法，既保持了SOLID数据在比对过程中定位准确度高的特性，又提高了分析SNP方法的准确度。

Description

一种基于SOLID测序技术的基因SNP位点检测方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，尤其涉及SNP位点的检测方法。 

背景技术

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)，即指由于单个核苷酸碱基的改变而导致的核酸序列的多态性。在不同个体的同一条染色体或同一位点的核苷酸序列中，绝大多数核苷酸序列一致而只有一个碱基不同的现象，就是SNP。由于SNP 在人类基因组中数量较多，发生频率较高，因此被认为是继微卫星之后的新一代遗传学标记，在医学遗传学、药物遗传学、疾病遗传学、疾病诊断学、以及人类进化等研究领域都有很高的研究价值和应用前景。 

SOLiD全称为supported oligo ligation detetion，它的独特之处在于以四色荧光标记寡核苷酸的连续连接合成为基础，取代了传统的聚合酶连接反应，可对单拷贝DNA片段进行大规模扩增和高通量并行测序。其无以伦比的准确性、系统可靠性和可扩展性更让它从其他新一代测序平台中脱颖而出。SOLiD流程获得的严密的DNA片段范围，使研究人员可以鉴别出很宽范围内的插入和缺失片段，结构重排也能很容易鉴别出来。这个平台的超高通量使研究人员可轻而易举地获得高度基因组覆盖率的数据，精确鉴定个体基因组中存在的数百万个单碱基多态性SNP，揭示大量此前未知、具有潜在医学价值的遗传变异，从而促进我们对正常/疾病状态下DNA结构变异的了解，以及在更高的分辨率下对结构变异进行深入分析，解释个体之间的易感性差异和对疾病治疗应答的差异，最终实现个性化医疗。 

随着SOLiD测序技术的发展，相应的SNP检测方法也有了很好的发展，然而，由于新测序技术产生的测序片段与以往相比有显著的差异，目前基于SOLiD测序技术的SNP检测方法经常产生大量的假阳性SNP位点，因此现有的SNP检测方法难以满足高通量测序技术的要求。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于SOLiD测序的SNP检测方法，旨在解决现有的SNP位点检测方法难以满足高通量测序技术的要求并且产生大量假阳性SNP位点的技术问题。 

为解决上述技术问题， 本发明的一个目的是提供一种基于SOLiD测序的SNP位点检测方法，具体步骤如下： 

（1）通过SOLiD测序获得待测基因样本的颜色序列；

（2）预备参考序的颜色序列，按照“双碱基编码矩阵”，将碱基参考序编码为颜色编码序；

（3）制备颜色编码参考序的索引表以备快速定位样本序；

（4）将SOLID测序样本序和颜色编码参考序进行比对，找出样本序在参考序中的最佳匹配位置；比对样本序与参考序，获取颜色编码匹配信息；

（5）根据颜色编码的匹配信息，分析SOLiD样本序与颜色编码的参考序的碱基匹配信息，确定不确定变异点； 

（6）统计获得的不确定变异点，去除噪声和测序错误导致的不确定变异点，从而获得样本SNP位点。

在本发明的一个实施方案中，在步骤（3）中，所述索引表采用bowtie变换来预制颜色编码参考序的bowtie索引表，或采用hash表预制颜色编码参考序的索引表。 

在本发明的另一个实施方案中，在步骤（5）中，为避免所述分析SOLiD样本序与颜色编码的参考序的碱基匹配信息中出现的碱基转换错误，采用如下方法降低由测序错误引起的碱基转换错误（流程图见附图2）： 

当样本序在位置p出现颜色编码与参考序颜色不一致时,连续检查其后的三个颜色编码是否出现与参考序的不匹配，若三个连续编码范围之内出现不匹配的情况则继续向后检查，直至在位置p+n,p+n+1,p+n+2出现三个与参考序完全一致的颜色编码，将样本序在位置p至位置p+n之间的颜色编码{c1,c2…cn}作为局部颜色编码序列，从参考序中取出位置p的碱基b，根据转换矩阵将{c1,c2…cn}转换为碱基序{b1,b2…bn}，与参考序位置p至p+n的碱基序{r1,r2…rn}比较，进而得出碱基匹配信息；若样本序在p+n处的碱基bn与对应的参考序碱基rn不一致，将p至p+n标注为不确定变异点。所述三个编码范围之内出现不一致的情况为三个连续颜色编码中任一编码出现与参考序颜色编码不一致即认定三个编码范围之内出现不匹配的情况。

SOLiD测序完成后，获得了由颜色编码组成的SOLiD原始序列。理论上来说，按照“颜色转换矩阵”（表1），只要知道所测DNA序列中任何一个位置的碱基类型，就可以将SOLiD原始颜色序列“解码”成碱基序列。但由于双碱基编码规则中双碱基与颜色信息的兼并特性（一种颜色对应4种碱基对），前面碱基的颜色编码直接影响紧跟其后碱基的解码，所以一个错误颜色编码就会引起“连锁解码错误”。 

SOLID样本序文件以0，1，2，3代表蓝，绿，黄，红四种颜色编码，已知某颜色编码序列为0102定位在参考序位置p处，假设参考序在位置p的碱基为A，转换后得出0102对应的碱基序列为ACCT，即为样本在p至p+4区域的碱基序。 

表1：颜色转换矩阵 

如上述例子中的颜色编码序0102的在位置p处的颜色编码出现出现错误编码变异为1102后，转换后对应的碱基序列为CAAG,与ACCT比较，从p之后至p+4区域内的所有碱基均发生了改变，因一个颜色编码错误而导致的其后所有碱基均发生错配的情况称之为碱基转换错误。

一般情况下，在SOLID测序中，一个位点p处的碱基变化必将引起位置p-1和p两个颜色编码的错误。位置p至p+n-1连续n个碱基的变化可能引起p至p+n区域n+1个颜色编码的改变，但是并不能保证n+1个颜色编码全部不匹配，除去最左和最右的颜色编码必定出现不匹配的情况，中间n-1个编码有可能出现颜色编码与参考序匹配。 

颜色编码匹配信息中有两种不完全匹配情况：“单颜色不匹配”和“连续颜色不匹配”。当位置p出现单颜色不匹配时，向后寻找p+n位置处出现其后三个连续颜色编码均与参考序颜色一致，根据上述转换方法转换得出碱基序，若在p+n处样本序碱基与参考序碱基不一致将位置p和p+n处的颜色编码标注为不确定的变异点。 

当位置p和p+1出现连续两个颜色编码不匹配时，根据转换矩阵得出的在位置p+2处碱基均出现错配，从而将此颜色编码标注为不确定的变异点。 

本发明的附图3-5充分说明了SOLID测序中出现颜色编码不匹配的情况。 

附图3中给出单个颜色编码不匹配，而相邻两个颜色编码匹配，但是其后第三个颜色编码出现不匹配，由此可确定连续三个碱基不匹配的例子。 

附图4中的例子给出单颜色编码不匹配，其后未出现颜色编码不匹配，根据颜色转换矩阵得出的碱基均出现错配的情况，从而将此颜色编码标注为不确定的变异点。 

附图5中的例子为连续两个颜色编码不匹配，但是根据转换矩阵得出的碱基均出现错配的情况，从而将此颜色编码标注为不确定的变异点。 

在本发明进一步的实施方案中，在步骤（6）中，所述去除噪声和测序错误导致的不确定变异点通过分析下列指标实现，具体指标如下： 

评估位置为p，变异碱基为X的不确定变异点为SNP位点的可信度通过以下参数进行评估：

（1）Mutation Percentage，变异百分比，其公式为：

k=在位置p发生变异的样本数/覆盖位置p的所有样本数×100%；

（2）Allel Percentage，Allel碱基百分比，其公式为：

l=在位置p碱基为X的样本数/覆盖位置p的所有样本数×100%；

（3）Forward Reverse Balance Score，正反向平衡分，其公式为：

m=覆盖位置p的正向样本数/覆盖位置p的反向样本数×100%；

（4）Allel Forward Reverse Balance Score，Allel正反向平衡分，其公式为：

n=在位置p碱基为X的正向样本数/在位置p碱基为X的反向样本数×100%，所述正向样本为在方向与参考序方向相同的样本，反向样本为样本经过反向互补之后与参考序一致的样本。经过上述参数的过滤，进一步确定步骤五中标注的不确定变异点是否为true positve SNP.

当评估位置p的k值≥20%，l值≥5%，m值≥20%和n值≥80%时，即认定位置为p的不确定变异点为SNP位点，当评估位置p的k值<20%，l值<5%，m值<20%或n值<80%时，即认定位置为p的不确定变异点为假阳性SNP位点。

根据测序样本的覆盖深度和正反向比例设置以上参数，本文将在随后的具体实施案例中以人类基因为例，具体讲述以上参数的设置。 

SOLiD 3单次运行可产生50GB的序列数据，相当于17倍人类基因组覆盖度，由仪器随机噪声带来的测序错误率为0.06%，随着测序深度的增加，随机噪声带来的测序错误在同一点的影响随之减弱，但是这还会导致SOLiD测序分析的SNP位点中存在大量假阳性的SNP位点。 

采用本发明的SNP检测方法，既保持了SOLID数据在比对过程中定位准确度高的特性，同时对SOLID测序过程中的噪声有着较高的抗噪特性，避免由个别噪声导致的大量假阳性SNP位点，提高了分析SNP方法的准确度。 

附图说明

图1：本发明SNP检测方法的流程图 

图2：本发明处理测序错误引起的碱基错误方法的流程图

图3：本发明颜色编码不匹配情况示例（连续三个碱基不匹配）

图4：本发明颜色编码不匹配情况示例（单颜色编码不匹配）

图5：本发明颜色编码不匹配情况示例（连续两个颜色编码不匹配）

图6：实施例1采用本发明步骤（5）处理方法的样本序碱基匹配情况

图7：本发明步骤（5）处理方法的样本碱基序的匹配情况（A）与常规方法分析时同一数据在同一位置的样本碱基序匹配情况（B）的结果对比

图8：本发明实施例1的检测结果图

图9：本发明实施例1的SNP检测结果图

具体实施方式：

下面将结合附图以及进一步的详细说明来举例说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。

实施例1

HLA基因为人类白细胞抗原基因，是一个由一系列紧密连锁的基因座位所组成的具有高度多态性的复合体。为使本发明的目的、技术方案和优点更为清楚，本文以用于骨髓移植配型的HLA I型基因 HLA-A基因为例，进行数据分析：

1. 该数据从EBI下载（http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/dictionary.html）。包括HLA-A的GeneBank格式数据（HLA-A.gbk），以及HLA-A 各亚型的fasta序列数据

(HLA-A_dictionary.fasta)。

2. 提取HLA-A 01:01:01:01亚型作为标准序（HLA-A_01010101.fasta）。 

3. 比较该序列与HLA-A.gbk参考序列，得到确定的SNP位点共45个，记录为阳性SNP位点 

4. 对HLA-A 01:01:01:01序列进行数据模拟，随机添加 5%噪声点，构建出长度80bp的2824条Solid序列，作为测试样本序列（HLA-A_01010101_simulate.fasta）。 由于添加的噪声点频率只有5%，而且随机产生，因此如果在非确定的45个位点之外检测到SNP，则认为是假阳性SNP位点（False positive SNP）。如果确定的45个没有被正确检出的位点，可认为是假阴性SNP位点（False negative SNP）。 

5. 制备hash索引表参考序（HLA-A.gbk）。 

6．比对测试样本HLA-A_01010101_simulate.fasta与参考序，匹配各条样本序在参考序中的最佳匹配位置。 

7．依据发明内容中的步骤5分析各条样本序的碱基错配信息。未采用本文中步骤5时，由于测序噪声而导致样本序的碱基转换错误，按照发明内容中步骤5所述的转换方法初步排除由测序错误或者系统误差造成的编码转换错误而带来的假阳性碱基错配信息。图6为采用本发明后同一数据在同一位置的样本序碱基匹配情况。图7为常规方法分析是在某位置的样本碱基序错配情况，样本序在参考序位置82出发生一个颜色编码与参考序不一致，参考序在此处的颜色编码为蓝色，样本序为绿色，常规分析方法（图7）将导致从位置82至位置90的一系列的碱基转换，本案例经由步骤5处理后，将碱基转换错误限制在位置82处，在此位置用符号？标记此次为一个不确定的C至A的碱基错配。 

8．统计各位点的碱基错配信息，根据发明内容中步骤6的几个参数确定是否为噪声还是确定的变异。 

9．匹配过程中要求样本序列与参考序的相似度百分比为80%，经由步骤3后得出所有样本序在参考序上的位置。 

10．结果显示：如附图8，9所示，参数见表一方案2。 

11．结果评价： 

       在所述步骤5中，单条样本颜色序列在得出最佳匹配位置后，需要使用颜色编码矩阵得出碱基不匹配点。采用本发明所述的降噪措施排除单条样本序

在所述步骤6中，分析样本SNP点是有用到四个参数来过滤false positive SNP位点： Mutation Percentage，Coverage，Allel Percentage, Forward/Balance Percentage。

本实施例例分别使用了两套方案统计SNP位点，参数见表2。SNP点检测结果见表3。 

表2 过滤false positive SNP点的参数设置 

表3 SNP位点检测结果

通过SNP检测结果可以看出，通过设置过滤参数，尽管匹配的reads数和碱基数有所降低，但可以大幅度的过滤噪声点，检出的false positive SNP位点由1458降至2个。可见该滤噪方法行之有效。

附 中英文对照表 

本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。

Claims (1)

1.一种基于SOLiD测序的SNP位点检测方法，其特征在于，具体步骤如下：

（1）通过SOLiD测序获得待测基因样本的颜色序列；

（2）预备参考序的颜色序列，按照“双碱基编码矩阵”，将碱基参考序编码为颜色编码序；

（3）采用hash表预制颜色编码参考序索引表以备快速定位样本序；

（4）将SOLID测序样本序和颜色编码参考序进行比对，找出样本序在参考序中的最佳匹配位置；比对样本序与参考序，获取颜色编码匹配信息；

（5）根据颜色编码的匹配信息，分析SOLiD样本序与颜色编码的参考序的碱基匹配信息，确定不确定变异点；为避免所述分析SOLiD样本序与颜色编码的参考序的碱基匹配信息中出现的碱基转换错误，采用如下方法降低由测序错误引起的碱基转换错误：

当样本序在位置p出现颜色编码与参考序颜色不一致时,连续检查其后的三个颜色编码是否出现与参考序的不匹配，若三个连续编码范围之内出现不匹配的情况则继续向后检查，直至在位置p+n,p+n+1,p+n+2出现三个与参考序完全一致的颜色编码，将样本序在位置p至位置p+n之间的颜色编码{c1,c2…cn}作为局部颜色编码序列，从参考序中取出位置p的碱基b，根据转换矩阵将{c1,c2…cn}转换为碱基序{b1,b2…bn}，与参考序位置p至p+n的碱基序{r1,r2…rn}比较，进而得出碱基匹配信息；若样本序在p+n处的碱基bn与对应的参考序碱基rn不一致，将p至p+n标注为不确定变异点；

（6）统计获得的不确定变异点，去除噪声和测序错误导致的不确定变异点，从而获得样本SNP位点，所述去除噪声和测序错误导致的不确定变异点通过分析下列指标实现，具体指标如下：

评估位置为p，变异碱基为X的不确定变异点为SNP位点的可信度通过以下参数进行评估：

（1）Mutation Percentage，变异百分比，其公式为：

k=在位置p发生变异的样本数/覆盖位置p的所有样本数×100%；

（2）Allel Percentage，Allel碱基百分比，其公式为：

l=在位置p碱基为X的样本数/覆盖位置p的所有样本数×100%；

（3）Forward Reverse Balance Score，正反向平衡分，其公式为：

m=覆盖位置p的正向样本数/覆盖位置p的反向样本数×100%；

（4）Allel Forward Reverse Balance Score，Allel正反向平衡分，其公式为：

n=在位置p碱基为X的正向样本数/在位置p碱基为X的反向样本数×100%，

当评估位置p的k值≥20%，l值≥5%，m值≥20%及n值≥80%时，即认定位置为p的不确定变异点为SNP位点，当评估位置p的k值<20%，l值<5%，m值<20%或n值<80%时，即认定位置为p的不确定变异点为假阳性SNP位点。