CN103424386B - 一种单分子荧光装置及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种单分子荧光装置及其使用方法，所述单分子荧光装置包括：镜头式全内反射荧光显微镜系统、图像采集及处理系统、可控磁镊系统和流体池系统，流体池系统包括流体池固定台、流体池及电动液流泵，所述流体池固定台的一面固定在所述镜头式全内反射荧光显微镜系统的倒置显微镜样品台上，所述流体池固定台的另一面上固定有所述流体池；所述电动液流泵与流体池相连；所述流体池的底面上设置有一列以上的DNA固定点。本发明由于在流体池中制作出了成列的DNA固定点，因此可以实现大量DNA的可控固定。再借由横向磁镊装置，即可实现对大量DNA分子的可控拉伸，并在不对DNA分子进行染色的情况下实现对蛋白质荧光信号的高精度观测。

Description

一种单分子荧光装置及其使用方法

技术领域

本发明涉及荧光装置，特别涉及一种单分子荧光装置及其使用方法。

背景技术

为了观察到单个蛋白质分子与单个DNA分子互相作用的过程，目前已发展出各种技术手段。其核心思想有两点，第一点是将蛋白质分子进行荧光标记后，使用全内反射荧光技术在样品表面产生隐失波场，将荧光激发范围缩小，在观察蛋白质分子时形成较好的信号/背景噪声比，从而实现单个蛋白质分子的检测。第二点是将单个DNA分子固定在全内反射产生的隐失波场内，并尽量减少其空间位置的涨落，从而实现较高的空间精度。

产生隐失波场从技术上实现方法主要有两种，即棱镜式全内反射与镜头式全内反射：使用棱镜式全内反射，激发光将从镜头另一侧通过棱镜导入样品，在介质表面实现全内反射，反射光将远离成像系统；使用镜头式全内反射，激发光将通过镜头射向样品，反射光则将通过镜头返回成像系统。这两种荧光照明方式从原理到实现方式都已研究得较为透彻。

将DNA固定在隐失波场内的方法各异，主要有：磁镊、光镊、液流拉伸及DNA双头连接4种方法。使用传统的磁镊装置要求使用至少直径为1μm的超顺磁性小球连接在DNA一端，将DNA另一端固定在表面上，因此很难将DNA全部横在穿透深度只有100nm左右的隐失波场内。目前较多的应用是结合纵向磁镊观察垂直于连接表面的一小段DNA的情况，如2006年，Carlos Bustmante就使用纵向磁镊观察到了靠近表面的DNA附近的荧光现象，确认了DNA的旋转过程。光镊基于类似的要求，DNA分子也很难全部处于表面的隐失波场内。1999年，Yoshie Harada发明了一种在观察表面进行光刻的方法，使DNA分子在光镊拉伸的情况下也能够处在隐失波场内，但缺点是仪器较为复杂，且观察区域内仅有一个样品，实验效率低下。液流拉伸则是通过施加液流的方式，将一端固定在表面的DNA分子进行拉伸，从而使其全部位于隐失波场内。如2006年，Eric C.Greene就是用该方法观察到了Rad51蛋白与DNA结合的过程。这个方法虽可以将DNA分子整个横在隐失波场内，但沿水流方向下游的DNA分子末端涨落非常大，是该方法相较以上两种方法，空间精度受到限制的一个极大原因。第四种方法也较为常见，即将DNA分子的两端都进行标记，使其都能够固定在表面上，连接时反复施加液流，使DNA在被拉伸的状态下被固定在表面上。2007年，Eric C.Greene使用了类似的方法观察了Msh2-Msh6蛋白的功能。此方法的弊端与液流拉伸类似，也是只能使DNA处于张力较小的状态，造成其空间位置的涨落非常大，严重限制了荧光实验的空间精度。

鉴于以上各种研究方法的限制，现在还没有一种方法，能够简单地控制大量DNA的拉伸，并且同时高精度地观测蛋白荧光信号。

发明内容

本发明要解决的技术问题，就是提出一种高精度的单分子荧光装置及其使用方法，解决传统方法无法实现大量DNA的可控拉伸并同时高精度地观察荧光信号的问题。

为了解决上述问题，本发明提供一种单分子荧光装置，包括：镜头式全内反射荧光显微镜系统、图像采集及处理系统、可控磁镊系统和流体池系统，所述流体池系统包括流体池固定台、流体池及电动液流泵，其中，所述流体池固定台的一面固定在所述镜头式全内反射荧光显微镜系统的倒置显微镜样品台上，所述流体池固定台的另一面上固定有所述流体池；所述电动液流泵与所述流体池相连；所述流体池的底面上设置有一列以上的DNA固定点。

优选地，上述单分子荧光装置还具有以下特点：

所述流体池的底面平行地刻有1组以上的槽，每组槽包括一个第一类型槽和一个第二类型槽，其中，每组槽中：所述第一类型槽用于全内反射形成隐失波场，对DNA分子附近的荧光标记蛋白进行照明；所述第二类型槽位于第一类型槽靠近可控磁镊系统的一侧，并紧贴所述第一类型槽，比第一类型的槽窄且深，用于提供超顺磁性小球的活动空间。

优选地，上述单分子荧光装置还具有以下特点：

所述流体池的底面上第一类型槽远离可控磁镊系统的一侧设置有凸起，作为DNA固定点，用于固定DNA分子。

优选地，上述单分子荧光装置还具有以下特点：

所述流体池底面用于固定DNA分子的凸起部分镀有金膜，用于固定一端带有巯基标记的DNA分子。

优选地，上述单分子荧光装置还具有以下特点：

所述第一类型的槽的宽度为13-15μm，深度为20-50nm；所述第二类型的槽的宽度为2-5μm，深度为2-5μm。

为了解决上述问题，本发明提供一种使用所述单分子荧光装置的方法，包括：

步骤1，将一个以上的一端标记有超顺磁性小球的DNA分子固定在流体池的底面上的DNA固定点上；

步骤2，通过可控磁镊系统使得DNA分子拉直并置于全内反射产生的隐失波场；

步骤3，在流体池中加入带有荧光标记的蛋白质分子，使用图像采集及处理系统进行图像采集和/或图像处理。

优选地，所述步骤1包括：

将一个以上的DNA分子在缓冲液中连接好超顺磁性小球，将所述缓冲液与流体池的进样管相连，使用电动液流泵对流体池的进样管处的样品施加抽取动作，使所述样品沿进样管流入流体池；当样品充满流体池后，关闭电动液流泵并将流体池静置在倒置显微镜样品台上，使得DNA分子固定在流体池的底面上的DNA固定点上。

优选地，所述步骤2包括：

调整可控磁镊系统的电动三维平台的高度，使可控磁镊系统的磁镊系统达到与流体池同样的高度；

调整所述电动三维平台，使磁镊系统的永磁铁在水平位置靠近流体池，从而使流体池内的DNA分子被拉直。

优选地，所述步骤3包括：

将带有荧光标记的蛋白质分子作为流体池的进样端的样品，使用电动液流泵对流体池的进样管处的样品施加抽取动作，使带有荧光标记的蛋白质分子流入流体池；

打开镜头式全内反射荧光显微镜系统的照明光路，通过图像采集及处理系统的电子增益电荷耦合器件记录荧光信号，打开图像采集及处理系统的计算机及图像处理软件，进行图像采集和/或图像处理。

本发明提供一种借助横向磁镊实现的可用于观测蛋白质分子与单个DNA分子相互作用的高精度荧光装置及其使用方法，具有如下有益效果：

1、本发明可实现对大量DNA分子的可控拉伸，平均每次试验可以同时观测到20个以上被拉伸的DNA分子。

2、本发明可在实现上述效果的同时，实现对蛋白质荧光信号的高精度观测。由于DNA同时处在全内反射产生的隐失波场内，且空间位置涨落较小，可实现高空间分辨率的荧光信号测量，在对DNA分子施加力较大的情况下，与DNA结合的蛋白质的荧光信号定位精度高于10nm。

3、本发明可在不对DNA分子进行染色的情况下，确定DNA分子位置，避免DNA分子结构被破坏，造成蛋白质的结合特性受到影响。

4、本发明相比光镊具有仪器构造简单、成本低的特点，便于快速开展应用。

附图说明

图1为本发明实施例的单分子荧光装置的示意图；

图2A为流体池的示意图；

图2B为流体池俯视图；

图2C为图2B中光刻槽部分的局部放大图；

图3为磁镊系统与流体池的位置示意图；

图4A为磁镊的观察录像截图；

图4B荧光标记的蛋白质分子的观察录像截图。

具体实施方式

下文中将结合附图对本发明的实施例进行详细说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。

本发明实施例提供的一种高精度单分子荧光装置，包括：镜头式全内反射荧光显微镜系统、图像采集及处理系统、可控磁镊系统和流体池系统。

如图1所示，镜头式全内反射荧光显微镜系统包括激光照明光路17和倒置显微镜系统13；图像采集及处理系统包括电子增益电荷耦合器件（EMCCD）18和计算机及图像处理软件19；可控磁镊系统包括由两块磁极组成的磁镊系统15和电动三维平移台16；流体池系统包括流体池11、流体池固定台12及电动液流泵14。

镜头式全内反射荧光显微镜系统包括激光照明光路17和倒置显微镜系统13：激光器发出的激光通过倒置显微镜的落射荧光灯室接口，沿与镜头同轴的方向射入显微镜内，并通过全内反射镜头在样品表面形成隐失波场。回射的激发光在通过成像光路的二色镜组时被阻挡掉，从而在成像系统中仅形成较低的背景噪声。

图像采集及处理系统包括EMCCD18和计算机及图像处理软件19。其中CCD为高敏感的增益CCD，接在倒置显微镜系统13的CCD接口。连接后CCD的行像素方向与成像后DNA分子的拉伸方向平行。计算机与CCD相连，并装有CCD的驱动软件和图像处理软件。

可控磁镊系统包括由两块磁极组成的磁镊系统15、电动三维平移台16。磁镊系统由两块尺寸5mmx5mmx5mm的钕铁硼永磁铁组成，两块磁铁按照磁通反向平行的方向摆放，间距为1mm，并通过固定杆固定在电动三维平台16上。电动三维平台16的操作平面与固定在倒置显微镜系统13上的流体池11同一高度，并能够以亚毫米的精度进行移动。

所述流体池系统包括流体池固定台12、流体池11及电动液流泵14，其中，所述流体池固定台12的一面固定在倒置显微镜系统13的倒置显微镜样品台上，所述流体池固定台12的另一面上固定有所述流体池11；所述电动液流泵14与所述流体池11相连；所述流体池11的底面上设置有一列以上的DNA固定点。

所述流体池的底面平行地刻有1组以上的槽，每组槽包括一个第一类型槽和一个第二类型槽，其中，每组槽中：所述第一类型槽用于全内反射形成隐失波场，对DNA分子附近的荧光标记蛋白进行照明；所述第二类型槽位于第一类型槽靠近可控磁镊系统的一侧，并紧贴所述第一类型槽，比第一类型的槽窄且深，用于提供超顺磁性小球（该超顺磁性小球的直径通常为2.8μm）的活动空间。所述流体池的底面上第一类型槽远离可控磁镊系统的一侧设置有凸起，作为DNA固定点，用于固定DNA分子。所述流体池底面用于固定DNA分子的凸起部分镀有金膜，用于固定一端带有巯基标记的DNA分子。

如图2A~2C所示，流体池包括盖玻片201、载玻片203、双面胶隔层202、环氧胶（图中未示出）及进样管204和出样管205，其中，进样管204和出样管205为无菌玻璃微针。盖玻片201用光蚀刻的方法刻出2N（N为大于等于1的整数）列纵向的槽，所有的槽在距离盖玻片长边1mm处平行蚀刻。其中第一类型槽宽度为15μm，深度为30nm，每两个槽之间间隔为5.1μm。第二类型槽紧贴第一类型槽，宽度为5μm，深度为5μm。在每两个槽之间100nm的间隔上镀20nm厚的金膜。盖玻片201与载玻片203之间以厚度为100μm的双面胶作为支撑，并使用环氧胶在流体池的四边密封。在短边靠近光刻槽的位置留有两个孔，通过两根无菌玻璃微针作为样品管分别连接样品和电动液流泵，进行样品更换。

将盖玻片201具有光刻槽的一面向上作为流体池底面，在没有光刻槽的部分粘双面胶202作为隔层，再在双面胶上方粘载玻片203作为流体池顶层。载玻片203的尺寸与盖玻片201相同。将两根玻璃微针（即进样管204和出样管205）分别放置在盖玻片201两个短边靠近光刻槽206的位置，使用环氧胶将流体池四边剩余的部分及进样管204/出样管205与流体池11接触的位置进行密封，并将电动液流泵14连接在流体池11的出样管25上。制作好的流体池11俯视图如图2B所示。

如图1所示，将连接好电动液流泵的流体池11固定在流体池固定台12上，并将流体池固定台固定在倒置显微镜系统13的样品台上，从而实现倒置显微镜对流体池样品区域的观察。

本发明实施例的单分子荧光装置的使用方法可包括如下步骤：

步骤1，将一个以上的一端标记有超顺磁性小球的DNA分子固定在流体池的底面上的DNA固定点上；

步骤2，通过可控磁镊系统使得DNA分子拉直并置于全内反射产生的隐失波场；

步骤3，在流体池中加入带有荧光标记的蛋白质分子，使用图像采集及处理系统进行图像采集和/或图像处理。

图2C所示为图2B中光刻槽部分的局部放大图，DNA分子207一端带有生物素标记，可与表面铺被有链霉亲和素蛋白的超顺磁性小球208相连；另一端带有巯基标记，可与20nm厚的金膜209表面相连。

首先将DNA207在缓冲液中连接好超顺磁性小球（简称磁球）208，并将该溶液与图2A中流体池11的进样管204相连，使用电动液流泵14对流体池进样管204处的样品施加抽取动作，使样品沿进样管204流入流体池11。当样品充满流体池后，关闭电动液流泵14并将流体池11静置在倒置显微镜样品台上一段时间。流体池下表面有很多列突起的金膜209，静置一段时间可令DNA分子207连接在这些突起的金膜209表面上。通过磁场在横向拉伸磁球208，可令DNA分子207平行于但不接触第一光刻槽210（第一类型槽），同时另磁球208处于但不接触第二光刻槽211（第二类型槽）。其中第一光刻槽210长度为15μm，深度30nm；第二光刻槽211长度为5μm，深度5μm。

调整图3所示的可控磁镊系统，通过调整电动三维平台31的高度，使磁镊系统达到与流体池11同样的高度。进一步通过调整电动三维平台31，使磁镊系统的永磁铁32在水平位置靠近流体池11，最终使磁镊系统到达如图3所示的与流体池11的相对位置，从而使流体池11内的DNA分子207被拉直，如图2C所示。打开倒置显微镜系统13的明场照明，可观测到磁球208的图像，并进而确定DNA分子207所在的位置，如图4A所示。

关闭明场照明系统，将流体池11进样端的样品更换为荧光标记的蛋白质分子，使用电动液流泵14对流体池11进样管处的样品施加抽取动作，使带有荧光标记的蛋白质分子流入流体池。打开镜头式全内反射荧光系统的照明光路17，通过EMCCD18记录荧光信号，打开计算机及图像处理软件19，进一步对图像信号进行分析。记录的信号如图4B所示。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种单分子荧光装置，包括：镜头式全内反射荧光显微镜系统、图像采集及处理系统和可控磁镊系统，其特征在于，所述单分子荧光装置还包括流体池系统，所述流体池系统包括流体池固定台、流体池及电动液流泵，其中，所述流体池固定台的一面固定在所述镜头式全内反射荧光显微镜系统的倒置显微镜样品台上，所述流体池固定台的另一面上固定有所述流体池；所述电动液流泵与所述流体池相连；所述流体池的底面上设置有一列以上的DNA固定点；

所述流体池的底面平行地刻有1组以上的槽，每组槽包括一个第一类型槽和一个第二类型槽，其中，每组槽中：所述第一类型槽用于全内反射形成隐失波场，对DNA分子附近的荧光标记蛋白进行照明；所述第二类型槽位于第一类型槽靠近可控磁镊系统的一侧，并紧贴所述第一类型槽，比第一类型的槽窄且深，用于提供超顺磁性小球的活动空间。

2.如权利要求1所述的单分子荧光装置，其特征在于，

所述流体池的底面上第一类型槽远离可控磁镊系统的一侧设置有凸起，作为DNA固定点，用于固定DNA分子。

3.如权利要求2所述的单分子荧光装置，其特征在于，

所述流体池底面用于固定DNA分子的凸起部分镀有金膜，用于固定一端带有巯基标记的DNA分子。

4.如权利要求1～3中任意一项所述的单分子荧光装置，其特征在于，

所述第一类型的槽的宽度为13-15μm，深度为20-50nm；所述第二类型的槽的宽度为2-5μm，深度为2-5μm。

5.一种使用如权利要求1所述单分子荧光装置的方法，包括：

步骤1，将一个以上的一端标记有超顺磁性小球的DNA分子固定在流体池的底面上的DNA固定点上；

步骤2，通过可控磁镊系统使得DNA分子拉直平行于底面并置于全内反射产生的隐失波场；

步骤3，在流体池中加入带有荧光标记的蛋白质分子，使用图像采集及处理系统进行图像采集和/或图像处理。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，

所述步骤2包括：

调整可控磁镊系统的电动三维平台的高度，使可控磁镊系统的磁镊系统达到与流体池同样的高度；

调整所述电动三维平台，使磁镊系统的永磁铁在水平位置靠近流体池，从而使流体池内的DNA分子被拉直。