CN103424371A - 基于γ-Fe2O3纳米粒子间接富集免疫磁分离的致病菌检测方法 - Google Patents

Abstract

一种基于γ-Fe₂O₃纳米粒子间接富集免疫磁分离的致病菌检测方法，属于食品安全致病菌快速检测技术领域。本发明依赖于建立的可以用于食品液体样本中致病菌的检测方法。利用1抗特异性结合目标菌，利用γ-Fe₂O₃纳米粒子材料制备2抗免疫磁珠针对性地富集1抗标记的目标菌株，通过分离捕获了目标菌的纳米磁珠，再硝化反应使之转化为铁离子，检验铁离子从而间接检测出样本中是否含有目标致病菌。在一定条件下铁离子的量与目标菌显示出线性关系，在一定范围能够定量检测目标菌。该方法可以用于食品样本中有害致病菌的快速检测，从而可以作为大批待检样品的快速筛选。

Description

基于γ-Fe2O3纳米粒子间接富集免疫磁分离的致病菌检测方法

技术领域

本发明涉及一种基于γ-Fe₂O₃纳米粒子间接富集免疫磁分离的致病菌检测方法。

背景技术

基本原理：单克隆抗体或抗原分子与酶分子通过共价键结合，这种结合不会改变单克隆抗体、抗原和酶的免疫学特性及生物活性，特异性的单克隆抗体只会与特异性的抗原结合。其主要的原理步骤：1. 向待检样本中加入目标菌的第1抗体，若存在目标菌，则与1抗结合形成1抗复合物；2. 利用磁性γ-Fe₂O₃纳米粒子, 通过修饰抗体实现表面功能化,将1抗的抗体即2抗偶联在磁珠表面，形成特异性免疫磁珠，并将多余活性位点封闭。3. 将另一部分目标菌的特异性1抗单克隆抗体固定在固相载体表面，并将多余活性位点封闭。4. 将第2步制备的2抗特异性免疫磁珠加入到第1步的待检样本中，用于抓取富集目标菌，通过外加磁场将磁珠分离出来，此时，结合了目标菌的1抗复合物和没有结合目标菌的过量1抗都会与磁珠表面的2抗结合，还是混在一起。5. 将上述混在一起的磁珠，加到第2步的固相载体表面，则抓取了目标菌的磁珠将与固相载体表面1抗发生特异性结合，形成双抗夹心，用无菌的去离子水清洗可以将未结合目标菌的磁珠洗脱。6. 再采用洗脱剂将固定载体上的结合的特异性纳米免疫磁珠洗下来，磁分离清洗掉离子、溶剂。此部分磁珠如果存在，就是抓取了目标菌的磁珠。7.加入硝酸和硫酸（王水）进行硝化反应，这部分磁珠如果存在，则γ-Fe₂O₃转化为三价铁离子和二价铁离子。所有食品标准中致病菌都是不得检出的。通过检测是否存在铁离子就可以检测出样本中是否存在目标菌。通过加标，在一定范围内可以定量检测目标菌。该方法中γ-Fe₂O₃纳米磁珠既是分离富集的手段，同时也是定量检测的载体，起了一个信号放大的作用，在此，也称为纳米探针。该方法的主要优点就是快速、灵敏度相对较高。相对于致病菌的微生物培养2-3天甚至几天的时间。此方法主要取决于样品的预处理时间。因此，用该方法可做大规模待检样本的阳性筛选，检出的阳性样还需用微生物培养进行确证。目前，国内外还没有文献报道这种方法，但是采用免疫磁珠进行致病菌的富集、目标物的富集等的报道还是很多的，但没有采用检验铁离子的方法做进一步的检测。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种基于γ-Fe₂O₃纳米粒子间接富集免疫磁分离的致病菌检测方法，它具有快速高效检出食品中有害致病菌的优点。

本发明是这样实现的，它通过间接富集、分离捕获的免疫磁珠，使其转化为铁离子，提出铁离子与目标菌的相关性指标，通过检测铁离子来间接定量目标菌。不同的致病菌检出下限不同。

该方法依赖于建立的可用于食品样品中有害致病菌特征性免疫磁珠富集、分离。采用偶联了特异性单克隆抗体的免疫磁珠，可以将样品中的特异性致病菌进行富集；通过设计双抗夹心分离捕获到目标菌的磁珠，再将磁珠硝化反应转化为三价铁离子和二价铁离子。采用邻二氮菲吸光光度法或硫氰酸钾比色法等可以检测出铁离子的量，从而可以算出磁珠的量，通过加标定量磁珠而在一定程度间接定量出目标菌的量。通过定量分析捕获目标菌的磁珠含量，从而可以间接定量出食品样品中的有害致病菌含量。检测出的致病菌含量与磁珠含量线性相关，拟合度较好。最终以免疫磁珠与致病菌间的对应关系为纽带，确定食品样本中的致病菌菌落数。

所述检测方法包括以下步骤：

1）向待检样本中加入目标菌的第1抗体，若存在目标菌，则与1抗结合形成1抗复合物；

2）2抗即第1抗体的抗体免疫磁珠的制备；

3）将目标菌特异性1抗单克隆抗体固定在固相载体表面；

4）免疫磁珠富集目标菌株，并分离：将第2步制得的2抗免疫磁珠加入第1步的待检样品，充分混合震荡，抓取目标菌后通过施加外加磁场，则磁珠就汇集到磁场一边，吸走上清液则可以分离出磁珠。若待检样本中有目标菌，则被磁珠所富集，加少量无菌的去离子水则形成目标菌的磁珠悬浊液；此时，结合了目标菌的1抗复合物和没有结合目标菌的过量1抗都会与磁珠表面的2抗结合，还是混在一起。

5）将富集的磁珠悬浊液加到第3步制作的固定了1抗单克隆抗体的固相载体上，若存在目标菌则形成双抗夹心；用无菌的去离子水清洗，则没有抓取到目标菌的磁珠就被洗掉，若不存在目标菌，则所有磁珠都被洗掉；

6）之后，用洗脱剂将固定板上的双抗夹心的磁珠洗下来，用外加磁场分离磁珠的方法用无菌的去离子水清洗掉离子和溶剂，如果还存在磁珠，这部分就是抓到目标菌的磁珠；

7）加入硝酸和硫酸（王水）进行硝化反应，这部分磁珠如果存在，则被反应转化为三价铁离子和二价铁离子。所有食品标准，致病菌均不得检出，此时若检出了铁离子就间接检出了目标致病菌。将过量的酸中和后，采用常规的邻二氮菲吸光光度法、硫氰酸钾比色法等可以检测出铁离子的量，从而可以算出磁珠的量，通过加标定量磁珠而在一定程度间接定量出目标菌的量；

所述纳米免疫磁珠核材为γ-Fe₂O₃材料，纳米粒径小于1000纳米；

所述的目标菌最终检出量的评价是基于是否检出铁离子及铁离子的浓度。

本发明的技术效果是：本发明提供一种客观的快速检测出食品中的有害致病菌的方法，其特征是通过检验铁离子间接检出目标致病菌。该方法可以客观有效地对食品中有害致病菌进行检测，相比于致病菌的生物培养确认，该方法具有快速检测的优势，可以用于大规模样本的快速筛选。一定程度上可以定量检测。

具体实施方式

本发明是这样实现的，所述方法包括以下步骤：

1）将检测目标菌与目标菌的第1抗体结合形成1抗复合物；

2）检测目标菌的1抗抗体，即2抗特异性免疫磁珠的制备；

3）将目标菌1抗特异性单克隆抗体在固相载体上的固定；

4）免疫磁珠富集目标菌株，并分离：将第2步制得的2抗免疫磁珠加入到第1步结合了1抗的待检样品，充分混合震荡，抓取目标菌后通过施加外加磁场，则磁珠就汇集到磁场一边，吸走上清液则分离出磁珠，若待检样本中有目标菌，目标菌首先与1抗结合形成1抗复合物，在加入2抗磁珠后，通过2抗与1抗的相互作用，从而捕获1抗复合物，被磁珠所富集，加无菌的去离子水则形成目标菌的磁珠悬浊液。此时，待检样品中没有抓到目标菌的1抗或过量的1抗也会被2抗磁珠捕获。

5）将富集的磁珠悬浊液加到第3步固定了1抗的单克隆抗体的固相载体上，若存在目标菌则形成双抗夹心，用无菌的去离子水清洗，则没有抓取到目标菌的磁珠就被洗掉，若不存在目标菌，则所有磁珠都被洗掉；

6）之后，用洗脱剂将固定板上的双抗夹心的磁珠洗下来，用外加磁场分离磁珠的方法用无菌的去离子水清洗掉离子和溶剂，如果还存在磁珠就是抓到目标菌的磁珠；

7）这部分磁珠，加入分析纯的硝酸和硫酸进行硝化反应，使磁珠γ-Fe₂O₃转变为三价铁离子和二价铁离子，中和过量酸后通过检测方法检测出铁离子的量，从而可以算出磁珠的量，通过加标定量磁珠而在一定程度间接定量出目标菌的量；通过硝化反应，将捕获目标菌的磁珠转化成铁离子，通过检测出铁离子的量来定量磁珠量并间接定量目标菌；所述制作纳米探针的材料为γ-Fe₂O₃纳米粒子，纳米粒径小于1000纳米；目标菌的最终检出量的评价是通过分析捕获目标菌的磁珠γ-Fe₂O₃的量，间接计算目标菌的量；所述1抗指目标菌单克隆抗体，2抗指第1抗体的抗体，为单克或多克隆抗体；所述检测方法为邻二氮菲吸光光度法或硫氰酸钾比色法。

下面结合实施例对本发明做进一步阐述；

实施例1

检验食品样本中测定其是否含有有害致病菌——李斯特菌；

1、2抗免疫磁珠制备：1抗采用李斯特菌的兔抗IgG单克隆抗体，2抗为李斯特菌的羊抗兔IgG。2抗免疫磁珠制备：采用商品化的羧基化磁珠，或采用微乳液法自行制备γ-Fe₂O₃纳米微球，通过包被修饰成羧基化磁珠或氨基化磁珠。以羧基化磁珠为例，其与2抗偶联步骤：①清洗：分别取5mg羧基化磁珠于5mL离心管中，2mL PB（0.02M，pH=6.0）洗2次，洗涤后用2mL MES（0.05M，pH=6.0）重悬；②活化：超声使磁珠分散，再分别加入1mg EDC，1mg NHSS（用0.05M，pH=6.0 MES溶解），25℃活化2h，旋转仪15r/min保持悬浮状态；③偶联：磁分离，吸去上清，2mL PB（0.02M，pH=7.4）洗涤一次并转移至新的离心管，3mL PB（0.02M，pH=7.4）重悬，超声使磁珠分散。再分别将275μg第2抗体羊抗兔IgG加入到已活化磁珠中，25℃偶联3h，旋转仪15r/min保持悬浮状态；④封闭：磁分离，取出上清（上清中的蛋白含量待检），加入1mg/mL乙醇胺及1mg/mL BSA封闭（0.02M，pH=7.4的PB溶解，并调节pH至中性），25℃封闭2h，旋转仪15r/min保持悬浮状态；⑤保存：0.01M PBS洗涤磁珠2次，磁分离，去上清，用3mL pH7.4 PB（0.02M，0.02% NaN3，0.5%BSA）重悬，存于4℃。制备的免疫磁珠备用；

2、1抗单克隆抗体固定：可以采用常规的酶标板固定方法，也可以采用以下方法。用干净的盖玻片5×5mm2正方形，镀膜机先喷一层Cr (2–4 nm)用以帮助固定金。再用在表面溅射喷上一层纳米金，再采用200微升 2 mmol 二硫基-琥珀酰亚胺-丙酸酯（DSP）对纳米金进行修饰（DMSO，二甲基亚砜稀释DSP）。加入李斯特菌的兔抗IgG单克隆单抗，即将100 µL 100 µg/mL单克隆抗体通过共价偶联法固定在玻璃板上并37 ˚C孵育45 min。加入1%牛血清蛋白（BSA），22˚C，1小时，将板上剩余的活性位点进行封闭并干燥；

3、将食品样本进行预处理，必要时采用FDA增菌法，对样品进行过滤、增菌活化等预处理，得到待检样本。将待检样本中加入第1抗体，李斯特菌的兔抗IgG。若待检样本中存在李斯特菌，将与1抗形成1抗复合物。将第1步制得的第2抗体李斯特菌的羊抗兔IgG磁珠加入后进行充分震荡。上磁力架分离磁珠，加少量无菌的去离子水得到磁珠的悬浊液。此时，如果待检样本中有目标李斯特菌，则通过第2抗体与第1抗体的相互作用，从而捕获该复合物，达到了目标菌富集的目的。此时，结合了目标菌的1抗复合物和没有结合目标菌的过量1抗都会与磁珠表面的2抗结合，还是混在一起。将此富集的磁珠悬浊液加到第2步所制备的1抗固定板上，则磁珠乳液中结合了李斯特菌的磁珠会进一步与固定板上的单克隆抗体发生特异性结合，形成双抗夹心结构。此时用无菌的去离子水清洗，就可以将没有结合李斯特菌的磁珠洗去。在固定板上剩下的就只有结合了李斯特菌的磁珠；

4、用洗脱液（甲醇等）将固定板上的结合了李斯特菌的磁珠洗脱下来。上磁力架，分离磁珠并清洗1-2次，将离子、溶剂洗去。加入硝酸和硫酸进行硝化反应，如果存在磁珠，则反应使之转化为三价铁离子和二价铁离子。所有食品标准，致病菌均不得检出，检出了铁离子就间接检出了目标致病菌。中和反应到PH值为中性，加入还原剂盐酸羟胺使三价铁离子全部转化为二价铁离子，采用邻二氮菲吸光光度法可以检测出铁离子的量，从而可以算出磁珠的量，通过加标定量磁珠而在一定程度间接定量出目标菌的量。

实施例2

测定食品样品是否含有有害致病菌大肠杆菌O157：H7；

1．2抗免疫磁珠制备：1抗采用O157：H7的兔抗IgG单克隆抗体，2抗为O157：H7的羊抗兔IgG。2抗免疫磁珠制备：采用商品化的羧基化磁珠，或采用微乳液法自行制备γ-Fe₂O₃纳米微球，通过包被修饰成羧基化磁珠或氨基化磁珠。以羧基化磁珠为例，其与2抗偶联步骤：①清洗：分别取5mg羧基化磁珠于5mL离心管中，2mL PB（0.02M，pH=6.0）洗2次，洗涤后用2mL MES（0.05M，pH=6.0）重悬；②活化：超声使磁珠分散，再分别加入1mg EDC，1mg NHSS（用0.05M，pH=6.0 MES溶解），25℃活化2h，旋转仪15r/min保持悬浮状态；③偶联：磁分离，吸去上清，2mL PB（0.02M，pH=7.4）洗涤一次并转移至新的离心管，3mL PB（0.02M，pH=7.4）重悬，超声使磁珠分散。再分别将275μg第2抗体加入到已活化磁珠中，25℃偶联3h，旋转仪15r/min保持悬浮状态；④封闭：磁分离，取出上清（上清中的蛋白含量待检），加入1mg/mL乙醇胺及1mg/mL BSA封闭（0.02M，pH=7.4的PB溶解，并调节pH至中性），25℃封闭2h，旋转仪15r/min保持悬浮状态；⑤保存：0.01M PBS洗涤磁珠2次，磁分离，去上清，用3mL pH7.4 PB（0.02M，0.02% NaN3，0.5%BSA）重悬，存于4℃。制备的免疫磁珠备用；

2. 1抗单克隆抗体固定：可以采用常规的酶标板固定方法，也可以采用以下方法。用干净的盖玻片5×5mm²正方形，镀膜机先喷一层Cr (2–4 nm)用以帮助固定金。再用在表面溅射喷上一层纳米金，再采用200微升 2 mmol 二硫基-琥珀酰亚胺-丙酸酯（DSP）对纳米金进行修饰（DMSO，二甲基亚砜稀释DSP）。加入O157：H7兔抗IgG单克隆抗体，即将100 µL 100 µg/mL单克隆抗体通过共价偶联法固定在玻璃板上并37 ˚C孵育45 min。加入牛血清蛋白将板上剩余的活性位点进行封闭并干燥；

3.将食品样本进行预处理，对样品进行过滤、增菌活化等预处理，得到待检样本。将待检样本中加入第1抗体，O157：H7的兔抗IgG。若待检样本中存在O157：H7，将与1抗形成1抗复合物。将第1步制得的第2抗体O157：H7的羊抗兔IgG抗体磁珠加入后进行充分震荡。上磁力架分离磁珠，加少量水得到磁珠的乳液。此时，如果待检样本中有目标大肠杆菌O157：H7，则通过第2抗体与第1抗体的相互作用，从而捕获该复合物，达到了目标菌富集的目的。此时，结合了目标菌的1抗复合物和没有结合目标菌的过量1抗都会与磁珠表面的2抗结合，还是混在一起。将此富集的磁珠悬浊液加到第2步所制备的1抗固定板上，则磁珠悬浊液中结合了大肠杆菌O157：H7的磁珠会进一步与固定板上的单克隆抗体发生特异性结合，形成双抗夹心结构。此时用无菌的去离子水清洗，就可以将未结合大肠杆菌O157：H7的磁珠洗去。在固定板上剩下的就只有结合了大肠杆菌O157：H7的磁珠；

4.用洗脱液（甲醇等）将固定板上的结合了大肠杆菌O157：H7的磁珠洗脱下来。上磁力架，分离磁珠并清洗1-2次，将离子、溶剂洗去。加入硝酸和硫酸（王水）进行硝化反应，如果存在磁珠，则反应使之转化为三价铁离子和二价铁离子。所有食品标准，致病菌均不得检出，检出了铁离子就间接检出了目标致病菌。中和反应到PH值为中性，加入还原剂盐酸羟胺使三价铁离子全部转化为二价铁离子，采用邻二氮菲吸光光度法可以检测出铁离子的量，从而可以算出磁珠的量，通过加标定量磁珠而在一定程度间接定量出目标菌的量。

Claims (4)

1.一种基于γ-Fe₂O₃纳米粒子间接富集免疫磁分离的致病菌检测方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

1）将检测目标菌与目标菌的第1抗体结合形成1抗复合物；

2）检测目标菌的1抗抗体，即2抗特异性免疫磁珠的制备；目标菌先与1抗结合形成复合物，用2抗特异性免疫磁珠富集、分离，1抗起信号放大作用；在本方法中，特异性免疫磁珠采用纳米材料制备，即是富集分离的手段，也是信号放大的载体，因此，在此也称为纳米探针；

3）将目标菌1抗特异性单克隆抗体在固相载体上的固定；

4）免疫磁珠富集目标菌株，并分离：将第2步制得的2抗免疫磁珠加入到第1步结合了1抗的待检样品，充分混合震荡，抓取目标菌后通过施加外加磁场，则磁珠就汇集到磁场一边，吸走上清液则分离出磁珠，若待检样本中有目标菌，目标菌首先与1抗结合形成1抗复合物，在加入2抗磁珠后，通过2抗与1抗的相互作用，从而捕获1抗复合物，被磁珠所富集，加无菌的去离子水则形成目标菌的磁珠悬浊液；

5）将富集的磁珠悬浊液加到第3步固定了1抗的单克隆抗体的固相载体上，若待检样品中存在目标菌则形成双抗夹心，用无菌的去离子水清洗，则没有抓取到目标菌的磁珠就被洗掉，若不存在目标菌，则所有磁珠都被洗掉；

6）之后，用洗脱剂将固定板上的双抗夹心的磁珠洗下来，用外加磁场分离磁珠的方法用无菌的去离子水清洗掉离子和溶剂，如果还存在磁珠就是抓到目标菌的磁珠；

7）这部分磁珠，加入分析纯的硝酸和硫酸进行硝化反应，使磁珠γ-Fe₂O₃转变为三价铁离子和二价铁离子，中和过量酸后通过检测方法检测出铁离子的量，从而可以算出磁珠的量，通过加标定量磁珠而在一定程度间接定量出目标菌的量。

2.

如权利要求1所述的一种基于γ-Fe₂O₃纳米粒子间接富集免疫磁分离的致病菌检测方法，其特征在于制作所述纳米探针的核材为γ-Fe₂O₃纳米粒子，纳米粒径小于1000纳米。

3.如权利要求1所述的一种基于γ-Fe₂O₃纳米粒子间接富集免疫磁分离的致病菌检测方法，其特征在于所述1抗指目标菌单克隆抗体，2抗指第1抗体的抗体，为单克隆或多克隆抗体。

4.如权利要求1所述的一种基于γ-Fe₂O₃纳米粒子间接富集免疫磁分离的致病菌检测方法，其特征在于所述检测方法为邻二氮菲吸光光度法或硫氰酸钾比色法。