CN103411934B - 一种荧光显微高光谱成像系统 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种荧光显微高光谱成像系统，将高光谱成像技术拓展到荧光显微成像领域。该系统是显微成像技术和高光谱成像技术在硬件上有机集成，具体包括倒置荧光显微镜、平移微调组合镜头、成像光谱仪和片上倍增增益相机（EMCCD）。其特点是设计一套平移微调组合镜头结合狭缝代替传统移动载物台，实现被检测目标和相机的相对移动完成高光谱扫帚式成像，获取荧光显微观测领域且图谱合一的高光谱图像。这种荧光显微高光谱成像系统可广泛应用于食品科学、生物学和医学等学科领域。

Description

一种荧光显微高光谱成像系统

技术领域

本发明涉及一种光学应用领域中的荧光显微高光谱成像技术，通过平移微调组合镜头结合狭缝代替移动载物台完成样品的“扫帚式”成像。

背景技术

高光谱成像技术是集图像分析技术和光谱分析技术于一身：图像分析技术由于计算机技术的飞速发展，图像分析技术得到了很好的应用发展，已经应用在工业、检测、遥感、计算机、军事等技术中；光谱分析技术近年来也有迅速的发展，特别是近红外光谱仪器相继在很多领域得到广泛应用。高光谱成像技术是近二十年发展起来的基于非常多窄波段的影像数据技术，是传统的二维成像技术和光谱技术的有机结合。

在宏观方面，高光谱成像技术已经为有效的检测手段，通过高光谱成像系统，获取三维高光谱数据，利用相关数据处理方法对原始数据进行滤噪和降维，并提取相应的光谱信息和图像信息，再结合化学计量学方法，构建相关模型对被检测对象进行定性和定量分析。近年来，高光谱成像技术广泛应用于食品科学、生物学、医学等领域，特别是在食品、农产品无损检测领域上，已有相关发明专利“高光谱图像技术的农畜产品无损检测方法及装置”（ZL200610097857.5）。

由于科学研究和实际检测的需要，被检查目标对象不再仅局限于宏观成像水平，有必要深入到微观成像水平（如细胞结构检测）。近年来，国际上开始出现一种将显微成像技术与高光谱成像技术相互结合新技术，即显微高光谱成像技术。它是在普通的显微成像技术的基础上引入目前发展迅速的高光谱成像光谱理论而得到的一种新型的光学检测技术。虽然显微高光谱成像光技术的研究工作是最近几年才刚刚兴起，尚处于探索性研究阶段，但它在很多领域已显示出潜在的应用前景。例如：在生命科学领域，它可以实现染色体识别、癌症诊断、皮肤病检查、细胞功能研究、蛋白质相互作用研究等，还可以与多荧光探针标记分析技术相融合，得到试样更加丰富的信息；此外，在材料科学和石油化工等领域，该技术都显示了很强的应用前景。

如何高光谱成像技术拓展到显微领域，开展显微高光谱成像技术研究，首先就是要在硬件上实现高光谱成像与显微成像的有机集成。为此，本发明设计一种基于平移微调镜头扫帚式成像的荧光显微高光谱成像系统，该装置与传统显微高光谱成像系统（ZL200410017031.4）在成像机理上存在很大差异。传统显微高光谱成像机理如下：处于显微镜载物台上的样品被柯勒照明系统照明,瞬时视场内的样品条带通过显微镜物镜和C-Mount接口镜头成像于分光计的狭缝处,再经过光谱分光组件后，在垂直样品条带方向按光谱色散，最后成像于CCD像面。CCD光敏面平行于狭缝的一维称为空间维，垂直于狭缝的一维称为光谱维,空间维每一行光敏元上得到的是样品条带一个光谱波段的像，这样面阵CCD相机每帧图像便对应于一个样品条带的高光谱图像。通过步进电机控制载物台的移动，使载物台上样本与相机之间发生相对位移，从而实现高光谱扫帚式成像，就得到整个样品的三维数据（2维空间维和1维光谱维）。由于显微成像区域过小，载物台移动速度要求很低，步进电机在控制载物台移动速度的均匀性上会产生一定的误差，造成图像的空间失真。本发明另辟蹊径，设计一套平移微调组合镜头，结合狭缝来代替传统移动载物台，实现数据采集过程中载物台上的物体和相机的相对运动，最终高光谱扫帚式成像。具体原理如下：瞬时视场内的样品条带通过显微镜物镜和C-Mount接口镜头成像于分光计的狭缝处，通过平移微调组合镜头的相对移动，可改瞬时视场内的样品条带相对位置，就相当于移动载物台移动，以实现样品与相机之间相对运动，从而完成整个样品的扫帚式成像。本发明可以克服现有显微高光谱成像技术存在的不足，同时将高光谱成像技术从宏观领域的应用拓展到微观领域的应用，为食品科学、生物学、医学、生命科学等科学研究领域提供一种新的技术支撑。

发明内容

将高光谱成像技术拓展到显微领域，开展显微高光谱成像技术的研究，碰到的首要问题是说如何在硬件上完成高光谱成像和显微成像的有机集成。为此，本发明设计一种基于平移微调组合镜头结合狭缝实现高光谱成像技术在显微尺度下的扫帚式成像，使高光谱成像系统和荧光显微成像系统有机结合。利用显微镜物镜和C-Mount接口成像于狭缝处，再经过核心部件平移微调镜头，通过步进电机作微米级别的平移使由样品条带漫反射产生的光线通过不同的狭缝，经过光谱仪分光组件后，成像于片上倍增增益相机(EMCCD)，得到显微高光谱成像数据。

本发明的技术解决方案如下：

一种荧光显微高光谱成像系统，包括倒置荧光显微镜、平移微调组合镜头、成像光谱仪和EMCCD。

本发明的荧光显微高光谱成像系统，具体包括四个核心部件：倒置荧光显微镜，平移微调组合镜头，成像光谱仪和片上倍增增益相机（EMCCD）。所述的倒置荧光显微镜，除了常用的部件外，还包含柯勒照明系统（采用100W超高气压汞灯作为光源）和C-Mount接口；所述的成像光谱仪，能与荧光显微镜成光学耦合，含有变焦镜头、狭缝、聚光镜、光谱色散元件；所述的平移微调组合镜头在成像光谱仪和C-Mount接口之间设计了一个平移的微调镜头，通过镜头上下平移导致载物台上样本的成像位置产生相应平移，再结合狭缝，可实现传统意义上的扫帚式的成像，最后经过会聚镜后成像于面阵EMCCD，最终得到一个三维数据块。

所述平移的微调镜头由步进电机控制作微米级别的移动，结合狭缝实现高光谱成像技术在显微尺度下完成对目标物的扫帚式成像。

本发明不仅在硬件上完成了荧光显微镜、高光谱成像仪和移动微调组合镜头等相关部件的有机结合。此外，在软件上实现所有部件相关参数的自动调整、自动匹配。

附图说明

图1：荧光显微高光谱成像系统示意图；1为倒置荧光显微镜，2为C-Mount接口，3为平移微调组合镜头，4为成像光谱仪，5为EMCCD。

图2：显微高光谱成像原理示意图。

具体实施方式

在本实施例中，倒置荧光显微镜1采用NikonTi-SR倒置荧光显微镜，该显微镜包括有物镜转换器（10×、20×和40×等物镜），T-DH100W照明立柱，ELWD聚光镜；荧光激发块和光源。本实施例中的成像光谱仪4为ImSpectorV10E成像光谱仪，扫描波长范围为400-1000nm，光谱分辨率为2.8nm。平移微调组合镜头3为本实施例中的核心部件，使视场内的样品条带产生的漫反射光线通过显微镜物镜和C-Mount接口2成像于狭缝处，通过狭缝结合平移微调组合镜头3完成载物台样品的扫帚式成像，由狭缝得到线性扫描区域，由一个步进电机驱动平移微调镜头作微米级别的移动，改变载物台上的线扫描的相对位置，就相当于载物台上的样品与相机之间相对运动，从而完成整个样品的扫帚式成像，最后经过会聚镜后成像于面阵EMCCD（5），最终得到一个三维数据块（如图2所示）。该平移微调组合镜头是由两个透镜组合而成，由步进电机控制微调镜头做微米级别平移。本实施例中EMCCD（5）选用AndorLucaRR604电子扩增CCD。为高分辨率、高速帧转移面阵CCD。其像元数为：1004×1002，面阵尺寸8.00mm(像空间)×8.00mm(谱空间)，所能检测到的光谱范围为400-1000nm。

系统控制软件是用VisualC++开发的应用程序，分为两部分，一部分安装在上位机上，一部分安装在嵌入式计算机上，上位机与嵌入式计算机间可通过RS232或无线数据链路通信。上位机程序提供人机交互界面，可设置波长、曝光档位、拍摄次数和拍摄间隔等参数，管理嵌入式计算机程序运行状态和相机电源。采用数据兼容ENVI分析软件对采集的显微高光谱图像进行图像光谱信息分析，利用模式识别进行光谱信息的筛选，提取特征光谱信息完成对研究目标的定性或定量分析。

Claims (2)

1.一种荧光显微高光谱成像系统，其特征在于，包括倒置荧光显微镜(1)、平移微调组合镜头（3）、成像光谱仪（4）和片上倍增增益相机（5）；

所述倒置荧光显微镜（1），包含柯勒照明系统，采用100W超高气压汞灯作为光源，并且提供一个与高光谱成像系统相连接的C-Mount接口（2）；

所述成像光谱仪（4），包含镜头、狭缝、聚光镜、和光谱色散元件；

所述的平移微调组合镜头（3）在成像光谱仪（4）和C-Mount接口（2）之间设计了一个平移的微调镜头，通过镜头上下平移导致载物台上样本的成像位置产生相应平移，再结合狭缝，可实现传统意义上的扫帚式的成像，最后经过会聚镜后成像于面阵片上倍增增益相机（5），最终得到一个三维数据块。

2.根据权利要求1所述的荧光显微高光谱成像系统，其特征在于，所述平移的微调镜头（3）由步进电机控制作微米级别的移动，结合狭缝实现高光谱成像技术在显微尺度下完成对目标物的扫帚式成像。