CN103409522A - 一种鉴别拟枝孢镰刀菌和木贼镰刀菌感染致木耳白毛菌病的方法 - Google Patents

Abstract

一种鉴别拟枝孢镰刀菌和木贼镰刀菌感染致木耳“白毛菌病”的方法，涉及一种鉴定木贼镰刀菌（Fusarium equiseti）和拟枝孢镰刀菌（Fusarium sporotrichioides）感染导致木耳“白毛菌病”的分子生物学方法。所述方法步骤如下：挑取黑木耳病变部位霉层或菌丝少许，加无菌蒸馏水煮沸后离心，取上清液作为模板，采用一对特异性引物，进行PCR反应，产物进行琼脂糖凝胶电泳40min，查看条带确定病原菌，若PCR产物大小为400bp，则为木贼镰刀菌；若PCR产物大小为332bp，则为拟枝孢镰刀菌。本发明利用一对特异性引物鉴别木耳白毛菌病的病原菌，方法快速，缩短鉴定时间，可以及时采取防治措施，减少病害造成的损失。

Description

一种鉴别拟枝孢镰刀菌和木贼镰刀菌感染致木耳白毛菌病的方法

技术领域

本发明涉及一种鉴定木贼镰刀菌（Fusarium equiseti）和拟枝孢镰刀菌（Fusarium sporotrichioides）感染导致木耳“白毛菌病”的分子生物学方法。 

背景技术

木耳[Auricularia auricula-judae(Bull.)Quél.]，又名黑木耳、光木耳，为著名的食用菌和药用菌，其质地滑嫩，清脆可口，营养丰富，有“素中之荤”的美誉。木耳有较高的药用价值，能补气血，凉血止血，润肺益胃，舒筋活络，轻身强志，还有降低血小板凝聚、防治心脑血管疾病的奇效。此外还可抑制癌细胞，增强人体免疫功能，成为公认的“天然保健食品”，越来越受到市场的青睐。木耳栽培起源于中国，作为世界木耳的主产国，2011年中国木耳产量超过300万吨，遍及全国二十多个省（区）。我国木耳主产区东北产区因气温低、昼夜温差大等独特的气候特点使所生产的木耳色黑肉厚，品质好，闻名遐迩。因此，木耳栽培生产范围也逐年扩大，配套栽培设施和技术逐渐完善，产量也不断提高，木耳产业已发展成为我国许多山区和林区的富农产业。然而，由于在木耳栽培生产中可发生多种病害或杂菌污染，导致木耳品质下降、产量降低，病害严重的甚至绝产，木耳产业的健康发展则受到了严重威胁。 

近年来，在东北产区春季木耳普遍发生了被木耳栽培农民称为“白毛菌”的病害，已给许多栽培农户造成了较大的经济损失。该病原菌在盛夏伏天侵染木耳的子实体，在耳片腹面生长一层白色网状霉菌，呈绒毛状，即使在木耳晒干后霉层依然存在，在严重发生时可导致耳片霉烂，严重影响木耳的产量及商品价值（见图1和2）。病害一旦发生，就会导致大面积蔓延，因此，对该病害病原菌进行及时准确的鉴定及采取针对性的有效防治措施十分必要。只有尽快鉴定病原菌种类，才能采取相应措施对该病害进行有效防治，防止病害迅速蔓延，将损失减少到最小，具有十分重要的意义。 

迄今为止，申请人于2011年报道了尚志地区的“白毛菌”病害，证明了引起木耳“白毛菌病”的病原菌为尖孢镰孢（F.oxysporum）和厚垣镰孢（F.chlamydosporum）。鉴定方法是通过形态鉴定和ITS序列分析，即通过提取病原菌DNA，用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增，获得的PCR产物进行测序 分析，将序列在NCBI中进行BLAST分析，通过与已知序列的高同源性并结合病原菌培养的菌丝及孢子形态来确定病原菌，方法繁琐、耗时长。 

发明内容

本发明的目的是提供一种更加快速而准确鉴定木贼镰刀菌（Fusarium equiseti）和拟枝孢镰刀菌（Fusarium sporotrichioides）感染导致木耳“白毛菌病”的分子生物学方法，利用一对特异性引物鉴别木耳白毛菌病的病原菌，方法快速，缩短鉴定时间，可以及时采取防治措施，减少病害造成的损失。 

本发明按照如下方法鉴别拟枝孢镰刀菌和木贼镰刀菌感染致木耳“白毛菌病”： 

挑取黑木耳病变部位霉层或菌丝少许，加无菌蒸馏水煮沸后离心，取上清液作为模板，采用一对特异性引物，进行PCR反应，产物进行琼脂糖凝胶电泳40min，查看条带确定病原菌，若PCR产物大小为400bp，则为木贼镰刀菌（F.equiseti）；若PCR产物大小为332bp，则为拟枝孢镰刀菌（F.sporotrichioides），具体步骤如下： 

1、用无菌接种针挑取黑木耳病变部位霉层或菌丝少许，置于含100～500μL无菌水的1.5ml离心管中，煮沸5～10min，5000～10000rpm/min离心1～10min，取上清液0.1～5.0μL作为模板。 

2、PCR反应的引物由TaKaRa公司合成。 

引物1： 

E-P1：TTACCAGTAACGAGGTGTATG； 

E-P2：CATACCTATACGTTGCCTCG； 

引物2： 

S-P1：AAAAGCCCAAATTGCTGATG； 

S-P2：TGGCATGTTCATTGTCACCT； 

3、鉴定由木贼镰刀菌（F.equiseti）感染致木耳白毛菌病的PCR反应体系：25～100μl，含2.5～10μl10×PCR-Buffer，2.5～10μl dNTPs(500μM)，0.5～5.0μl Taq DNA聚合酶，0.1～5.0μl上游引物E-P1(0.6～3.0μM)，0.1～5.0μl下游引物E-P2(0.6～3.0μM)，模版0.1～10.0μl，其余用无菌水补齐。 

PCR反应流程： 

94℃，3min；25～30个循环（94℃30s，61～63℃30s，72℃1min），最后72℃延伸10min。 

4、鉴定由拟枝孢镰刀菌（F.sporotrichioides）感染致木耳白毛菌病的PCR反应体系：25～100μl，含2.5～10μl10×PCR-Buffer，2.5～10μl dNTPs(500μM),0.5～5.0μl Taq DNA聚合酶，0.1～5.0μl上游引物S-P1(0.6～3.0μM)，0.1～5.0μl下游引物S-P2(0.6～3.0μM)，模版0.1～10.0μl，其余用无菌水补齐。 

PCR反应流程： 

94℃，3min；25～30个循环（94℃30s，62～65℃30s，72℃1min），最后72℃延伸10min。 

5、PCR扩增产物通过质量浓度为0.8～1.5%琼脂糖凝胶电泳分析40min。通过凝胶成像系统软件分析电泳条带分子量大小。通过特定引物扩增的PCR片段大小来确定病原菌是否是木贼镰刀菌（F.equiseti）（PCR产物大小为400bp）和拟枝孢镰刀菌（F.sporotrichioides）（PCR产物大小为332bp）。 

目前对于病原菌的鉴定通常采用ITS序列分析的方法，例如申请人本人于2011年报道的鉴定方法，该项鉴定方法需要对PCR产物片段进行测序，繁琐、耗时长、不能及时获得准确结果，会延误对该病的防治。而本方法只需要利用一对特异性引物对病原菌煮沸液进行PCR后观察条带大小就可以确定病原菌是否为木贼镰刀菌（F.equiseti）和拟枝孢镰刀菌（F.sporotrichioides），鉴定时间从原来ITS方法的一周左右缩短为仅为3-4小时，从而可以在病害发生的最短时间内采取有效防治措施，防止病害大面积快速蔓延，减少栽培农户的损失。 

附图说明

图1为感染白毛菌的鲜木耳病害症状； 

图2为感染白毛菌的干木耳病害症状； 

图3为特定引物鉴定木贼镰刀菌和拟枝孢镰刀菌，其中1：F.equiseti（PCR产物大小约为400bp），2：F.sporotrichioides（PCR产物大小约为332bp），Marker：100bp DNA Ladder Marker（N.o.D505A,TaKaRa）； 

图4为中国科学院菌种保藏中心标准菌株PCR扩增实验；其中1：F.sporotrichioides（PCR产物大小约为332bp），2：F.equiseti（PCR产物大 小约为400bp），Marker：100bp DNA Ladder Marker（N.o.D505A,TaKaRa）； 

图5为病原菌B3号致病性试验； 

图6为病原菌B4号致病性试验； 

图7为病原菌丝生长初期形态学鉴定病原菌为木贼镰刀菌（F.equiseti）； 

图8为病原菌丝生长后期形态学鉴定病原菌为木贼镰刀菌（F.equiseti）； 

图9为病原菌丝生长后期在平板背面形态学鉴定病原菌为木贼镰刀菌（F.equiseti）； 

图10为病原菌丝显微形态学鉴定病原菌为木贼镰刀菌（F.equiseti）； 

图11为病原菌孢子显微形态学鉴定病原菌为木贼镰刀菌（F.equiseti）； 

图12为病原菌丝生长初期形态学鉴定病原菌为木贼镰刀菌（F.sporotrichioides）； 

图13为病原菌丝生长后期形态学鉴定病原菌为拟枝孢镰刀菌（F.sporotrichioides）； 

图14为病原菌丝生长后期在平板背面形态学鉴定病原菌为拟枝孢镰刀菌（F.sporotrichioides）； 

图15为病原菌丝显微形态学鉴定病原菌为拟枝孢镰刀菌（F.sporotrichioides）； 

图16为病原菌孢子显微形态学鉴定病原菌为拟枝孢镰刀菌（F.sporotrichioides）； 

图17为基于rDNA ITS序列构建的系统发育树。 

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限如此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。 

本发明的鉴别拟枝孢镰刀菌和木贼镰刀菌感染致木耳“白毛菌病”的方法，具体步骤如下： 

1、用无菌接种针挑取黑木耳病变部位霉层或菌丝少许，置于含200μL无菌水的1.5ml离心管中，煮沸5min，5000rpm/min离心1min，取上清液1μL作为模板。 

2、PCR反应的引物由TaKaRa公司合成。 

引物1： 

E-P1：TTACCAGTAACGAGGTGTATG； 

E-P2：CATACCTATACGTTGCCTCG； 

引物2： 

S-P1：AAAAGCCCAAATTGCTGATG； 

S-P2：TGGCATGTTCATTGTCACCT； 

3、鉴定由木贼镰刀菌（F.equiseti）感染致木耳白毛菌病的PCR反应体系：25μl，含2.5μl10×PCR-Buffer，2.5μl dNTPs(500μM)，0.5μl Taq DNA聚合酶(Promega公司，德国)，1μl上游引物FE-F1(6μM)，1μl下游引物FE-R1(6μM)，模版1μl，16.5μl水。 

PCR反应流程： 

94℃，3min；38个循环（94℃30s，61℃30s，72℃1min），最后72℃延伸10min。 

4、鉴定由拟枝孢镰刀菌（F.sporotrichioides）感染致木耳白毛菌病的PCR反应体系：25μl，含2.5μl10×PCR-Buffer，2.5μl dNTPs(500μM),0.5μl TaqDNA聚合酶(Promega公司，德国)，1μl上游引物FS-F1(6μM)，1μl下游引物FS-R1(6μM)，模版1μl，16.5μl水。 

PCR反应流程： 

94℃，3min；25个循环（94℃30s，62℃30s，72℃1min），最后72℃延伸10min。 

5、PCR扩增产物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳分析40min。通过凝胶成像系统软件分析电泳条带分子量大小。通过特定引物扩增的PCR片段大小来确定病原菌是否是木贼镰刀菌（F.equiseti）（PCR产物大小为400bp）和拟枝孢镰刀菌（F.sporotrichioides）（PCR产物大小为332bp），见图3。 

6、若病原菌鉴定为木贼镰刀菌（F.equiseti），可通过0.05%（质量浓度）的百菌清进行有效防治。 

7、若病原菌鉴定为拟枝孢镰刀菌（F.sporotrichioides），可通过0.02%（质量浓度）的百菌清进行有效防治。 

上述发明通过以下试验验证： 

A、在中国科学院菌种保藏中心购买木贼镰刀菌（F.equiseti）和拟枝孢镰刀菌（F.sporotrichioides）标准菌株，进行同样PCR条件验证，结果见图4。 

B、从黑龙江省木耳主产区染白毛菌病害的木耳子实体上挑取病害霉层菌丝按照本发明方法进行验证，得到PCR产物为400bp（命名为B3）和332bp（命名为B4）的病原菌各1株，分离病原菌、纯化培养，采用传统方法进行形态学和ITS序列分析鉴定。其中培养和鉴定的培养基分别为如下培养基： 

①PDA培养基（Potato Dextrose Agar）：土豆200g，琼脂粉20g，葡萄糖20g，水1000mL。121℃灭菌15min，临用时每1000mL培养基中加1%链霉素0.3mL。平板直径90mm，用于观察菌落形态、颜色、生长速度。 

②将保藏菌株取0.2cm×0.2cm菌落接种到PDA斜面试管培养基中，25℃温箱中培养7d。病原菌对病原菌的菌丝及孢子进行显微观察和照相。 

③致病性测定 

接种材料：选择盛夏伏天木耳发育至开片期的子实体用于接种病原菌。 

接种方法：采用两种接种方法，一是菌落接种法，即将活化后的病原菌转接至平板上，25℃培养6d，从培养基上层挑取厚度为0.2cm的菌落琼脂块（0.3cm×0.3cm）贴于木耳耳片腹面；二是分生孢子喷雾接种法，分生孢子悬浮液(1×106孢子／mL)，喷湿木耳耳片和耳根部。接种后菌袋摆放稍密（25袋/m²），继续出耳管理，木耳经过3-5d发生了白毛菌病害，见图5-6。 

④形态鉴定 

木贼镰刀菌（F.equiseti）（B3）见图7-11；拟枝孢镰刀菌（F.sporotrichioides）（B4）鉴定见图12-16。 

⑤rDNA ITS区序列分析 

病原菌基因组DNA的提取：采用试剂盒方法提取2株病菌的基因组DNA。 

rDNA ITS区序列扩增和序列分析：采用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）进行rDNA ITS序列扩增。反应体系25μL，其中l0×buffer2.5μL，MgCl₂(25mmol／L)1.5mmol／L，dNTP(均为10mmol／L)各0.3mmol／L，引物ITS1和ITS4(20μmol／L)分别0.6μmol/L，DNA模板(50ng／μL)50ng，Taq聚合酶(5U／μL)0.5U。反应程序为：94℃预变性3min，进入循环（94℃变性l min，53℃退火50s，72℃延伸l min，30个循环），72℃延伸10min。PCR反应产物交上海生工公司测序。 

将测得ITS序列与GenBank中的序列进行BLAST分析，根据结果选取 相似度高的菌株，通过MAGE4.0软件构建系统发育树。采用BioEdit软件进行多序列匹配排列，采用邻接法(Neighbor-joining)构建系统发育树，重复次数为l000次。进化距离使用Kimura模型进行计算。 

上述B3和B4菌株获得rDNA ITS扩增产物，经测序分别为516bp和534bp，提交GenBank后分别获得序列号GU457416和HQ670631。将所得序列与GenBank中相关Fusarium Link种类的rDNA序列进行比对，构建了系统发育树（图17）。选择的菌株均为已公开发表的序列相似度高的菌株。分析结果表明，这两株病原菌分别为木贼镰刀菌（F.equiseti）和拟枝孢镰刀菌（F.sporotrichioides）。该形态鉴定和ITS序列分析结果进一步支持了这两株病原菌的分类地位，支持了本发明特异性引物鉴定的准确性。 

C、致病性 

按照科赫氏法则，将B3号和B4号菌株（木贼镰刀菌和拟枝孢镰刀菌）分别接种到品种“黑29”的木耳耳片上，在接种4-5d后观察发现，这两株真菌均对“黑29”耳片具有明显致病性，可观察到与自然条件下发病症状一致的典型症状，但对照没有出现病害症状。人工接种试验表明，这两株真菌均对木耳具有致病性。 

Claims (10)

1.一种鉴别拟枝孢镰刀菌和木贼镰刀菌感染致木耳白毛菌病的方法，其特征在于所述方法步骤如下： 

挑取黑木耳病变部位霉层或菌丝少许，加无菌蒸馏水煮沸后离心，取上清液作为模板，采用一对特异性引物，进行PCR反应，产物进行琼脂糖凝胶电泳40min，查看条带确定病原菌，若PCR产物大小为400bp，则为木贼镰刀菌；若PCR产物大小为332bp，则为拟枝孢镰刀菌。 

2.根据权利要求1所述的鉴别拟枝孢镰刀菌和木贼镰刀菌感染致木耳“白毛菌病”的方法，其特征在于鉴定由木贼镰刀菌感染致木耳白毛菌病的特异性引物为： 

E-P1：TTACCAGTAACGAGGTGTATG； 

E-P2：CATACCTATACGTTGCCTCG。 

3.根据权利要求1所述的鉴别拟枝孢镰刀菌和木贼镰刀菌感染致木耳“白毛菌病”的方法，其特征在于鉴定由拟枝孢镰刀菌感染致木耳白毛菌病的特异性引物为： 

S-P1：AAAAGCCCAAATTGCTGATG； 

S-P2：TGGCATGTTCATTGTCACCT。 

4.根据权利要求1或2所述的鉴别拟枝孢镰刀菌和木贼镰刀菌感染致木耳“白毛菌病”的方法，其特征在于鉴定由木贼镰刀菌感染致木耳白毛菌病的PCR反应体系：25～100μl，含2.5～10μl10×PCR-Buffer，2.5～10μl dNTPs(500μM)，0.5～5.0μl Taq DNA聚合酶，0.1～5.0μl上游引物E-P1，0.1～5.0μl下游引物E-P2，模版0.1～10.0μl，其余用无菌水补齐。 

5.根据权利要求4所述的鉴别拟枝孢镰刀菌和木贼镰刀菌感染致木耳“白毛菌病”的方法，其特征在于上游引物E-P1和下游引物E-P2的浓度均为0.6～3.0μM。 

6.根据权利要求4所述的鉴别拟枝孢镰刀菌和木贼镰刀菌感染致木耳“白毛菌病”的方法，其特征在于dNTPs的浓度为500μM。 

7.根据权利要求1或3所述的鉴别拟枝孢镰刀菌和木贼镰刀菌感染致木耳“白毛菌病”的方法，其特征在于鉴定由拟枝孢镰刀菌感染致木耳白毛菌病的PCR反应体系：25～100μl，含2.5～10μl10×PCR-Buffer，2.5～10μl dNTPs(500μM),0.5～5.0μl Taq DNA聚合酶，0.1～5.0μl，模版0.1～10.0μl，其余 用无菌水补齐。 

8.根据权利要求7所述的鉴别拟枝孢镰刀菌和木贼镰刀菌感染致木耳“白毛菌病”的方法，其特征在于上游引物S-P1和下游引物S-P2的浓度均为0.6～3.0μM。 

9.根据权利要求7所述的鉴别拟枝孢镰刀菌和木贼镰刀菌感染致木耳“白毛菌病”的方法，其特征在于dNTPs的浓度为500μM。 

10.根据权利要求1所述的鉴别拟枝孢镰刀菌和木贼镰刀菌感染致木耳“白毛菌病”的方法，其特征在于琼脂糖凝胶的质量浓度为0.8～1.5%。 

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