背景技术
G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor,GPCR)是人体内最大的膜受体蛋白家族,是一类具有七次跨膜螺旋的跨膜蛋白受体,它广泛参与人体内的生理和感官功能,在人类基因组中有800多个GPCR,相当于2-3%的人类基因。GPCR的结构特征和在信号传导中的重要作用决定了其可以作为很好的药物靶标。现在药物研发中约50%的目标蛋白是G蛋白偶联受体,100多种最畅销药物中,大约25%的药物靶标是这个蛋白家族的成员(Klabunde T,Hessler G.Drug design strategies fortargeting G-protein-coupled receptors.Chembiochem 2002;3:928-44)。通过对G蛋白偶联受体进行种族发育分析,它可以分为五类:Glutamate、Rhodopsin、Adhesion、Frizzled/Tas2和Secretin(Bjarnadottir TK,Fredriksson R,Schioth HB.Theadhesion GPCRs:a unique family of G protein-coupled receptors with important rolesin both central and peripheral tissues.Cell Mol Life Sci 2007;64:2104-19),这五类共同的特征是具有七次跨膜螺旋区域。大多数Glutamate、Secretin、Adhesion和Frizzled/Tas2家族的受体的N端很长并且包含许多功能域,然而只有少数Rhodopsin受体有这些功能域(Fredriksson R,Lagerstrom MC,Lundin LG,SchiothHB.The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families.Phylogenetic analysis,paralogon groups,and fingerprints.Mol Pharmacol 2003;63:1256-72)。
粘连G蛋白偶联受体在人类基因组一共有33个成员,由于一些特征,包括N端很长并且包含许多功能结构使其在GPCR家族处于独一无二的地位。它们结构域的代表性特征包括:七次跨膜的C端与Secretin GPCR同源;蛋白的N端包括一些只在细胞粘附蛋白中发现的蛋白功能域(Yona S,Lin HH,Siu WO,Gordon S,Stacey M.Adhesion-GPCRs:emerging roles for novel receptors.Trends Biochem Sci2008;33:491-500)。这些蛋白功能域是这个G蛋白偶联受体家族特有的结构,在其它家族是不存在的(Harmar AJ.Family-B G-protein-coupled receptors.GenomeBiol 2001;2:REVIEWS3013;Foord SM,Jupe S,Holbrook J.Bioinformatics and typeII G-protein-coupled receptors.Biochem Soc Trans 2002;30:473-9)。N端和C端可以自动催化地剪切,是通过一个靠近膜端的GPCR蛋白水解位点(GPS),这也是这个家族的特征(Lin HH,Chang GW,Davies JQ,Stacey M,Harris J,Gordon S.Autocatalytic cleavage of the EMR2 receptor occurs at a conserved G protein-coupledreceptor proteolytic site motif.The Journal of biological chemistry 2004;279:31823-32)。
大多数粘附G蛋白偶联受体仍然是孤儿受体,其配体,胞内信号途径和功能仍不清楚。越来越多的证据证明粘附G蛋白偶联受体在中枢神经系统、免疫系统和肿瘤发生中起作用。例如,CELSR1-3(Shima Y,Kengaku M,Hirano T,TakeichiM,Uemura T.Regulation of dendritic maintenance and growth by a mammalian 7-passtransmembrane cadherin.Dev Cell 2004;7:205-16;Curtin JA,Quint E,Tsipouri V,et al.Mutation of Celsr1 disrupts planar polarity of inner ear hair cells and causessevere neural tube defects in the mouse.Curr Biol 2003;13:1129-33;Tissir F,Qu Y,Montcouquiol M,et al.Lack of cadherins Celsr2 and Celsr3 impairs ependymalciliogenesis,leading to fatal hydrocephalus.Nat Neurosci 2010;13:700-7)和latrophilin1(Langenhan T,Promel S,Mestek L,et al.Latrophilin signaling linksanterior-posterior tissue polarity and oriented cell divisions in the C.elegans embryo.Dev Cell 2009;17:494-504)分别负责协调神经元发育和神经递质的释放。CD97(Wang T,Ward Y,Tian L,et al.CD97,an adhesion receptor on inflammatory cells,stimulates angiogenesis through binding integrin counterreceptors on endothelial cells.Blood 2005;105:2836-44;Wang T,Ward Y,Tian L,et al.CD97,an adhesionreceptor on inflammatory cells,stimulates angiogenesis through binding integrincounterreceptors on endothelial cells.Blood 2005;105:2836-44)和EMR1-3(Lin HH,Faunce DE,Stacey M,et al.The macrophage F4/80 receptor is required for theinduction of antigen-specific efferent regulatory T cells in peripheral tolerance.J ExpMed 2005;201:1615-25;Hamann J,Koning N,Pouwels W,et al.EMR1,the humanhomolog of F4/80,is an eosinophil-specifc receptor.Eur J Immunol 2007;37:2797-802;Yona S,Lin HH,Dri P,et al.Ligation of the adhesion-GPCR EMR2 regulateshuman neutrophil function.FASEB J 2008;22:741-51;Matmati M,Pouwels W,vanBruggen R,et al.The human EGF-TM7 receptor EMR3 is a marker for maturegranulocytes.J Leukoc Biol 2007;81:440-8)都参与了协调先天和后天免疫反应。GPR124(Vallon M,Essler M.Proteolytically processed soluble tumor endothelialmarker(TEM)5 mediates endothelial cell survival during angiogenesis by linkingintegrin alpha(v)beta3 to glycosaminoglycans.The Journal of biological chemistry2006;281:34179-88;Carson-Walter EB,Watkins DN,Nanda A,Vogelstein B,Kinzler KW,St Croix B.Cell surface tumor endothelial markers are conserved in miceand humans.Cancer Res 2001;61:6649-55)促进肿瘤血管生成。虽然对粘附G蛋白偶联受体的生理功能及其信号分子机制尚未达成共识,现有的数据表明,这种受体介导了基本的细胞与细胞和细胞与基质的相互作用(Yona S,Lin HH,Siu WO,Gordon S,Stacey M.Adhesion-GPCRs:emerging roles for novel receptors.TrendsBiochem Sci 2008;33:491-500;Waller-Evans H,Promel S,Langenhan T,et al.Theorphan adhesion-GPCR GPR126 is required for embryonic development in the mouse.PLoS One 2010;5:e14047)。
开展对体内功能未知基因的研究有许多方法,其中小鼠基因剔除技术为研究人类基因在整体中的功能提供了非常强有力的手段,通过分析获得的遗传修饰小鼠的表型变化,就能获得该基因的功能信息;这一研究方法的另一优点是可以将基因功能和疾病进行关联,从而在获得基因功能的同时也能获得该基因作为潜在药物或者药物靶点所能治疗的疾病信息和疾病动物模型。
综上所述,目前G蛋白偶联受体的生理功能仍未知,也没有相关的动物模型用于研究G蛋白偶联受体的生理功能。因此,本领域迫切需要能研究G蛋白偶联受体相关生物学功能,进而用于有关药物开发的合适动物模型。
发明内容
本发明的一个目的是提供非人哺乳动物的B淋巴细胞缺陷动物模型的制备方法。
本发明的另一个目的是提供非人哺乳动物的B淋巴细胞缺陷动物模型的用途。
本发明的再一个目的是提供筛选或鉴定能增加人或动物免疫系统中B淋巴细胞百分含量的物质的方法。
本发明的还有一个目的是提供G蛋白偶联受体97蛋白或其激动剂在制造用于增加免疫系统中B淋巴细胞百分含量的药物中的用途。
在第一方面,本发明提供了一种非人哺乳动物的B淋巴细胞缺陷动物模型的制备方法,该方法包括以下步骤:
(1)提供非人哺乳动物的细胞,将所述细胞中的Gpr97基因失活,得到Gpr97基因失活的细胞;(2)利用步骤(1)中得到的Gpr97基因失活的细胞,制备得到Gpr97基因失活的B淋巴细胞缺陷动物模型。
在一实施例中,上述制备方法中将Gpr97基因失活的步骤是采用基因剔除、基因中断或基因插入的方式来完成。在一优选例中,所述基因失活包括Gpr97基因不表达,或表达没有活性的Gpr97蛋白。
在另一实施例中,所述非人哺乳动物为啮齿动物或灵长目动物,较佳地包括小鼠、大鼠、猴。在另一优选例中,所述小鼠为C57BL/6小鼠。
在又一实施例中,上述制备方法包括:(1)利用DNA同源重组技术,将所述Gpr97基因中的外显子1和2剔除,并用筛选标记替换,得到Gpr97基因突变的非人哺乳动物细胞;(2)利用步骤(1)中得到的Gpr97基因突变的小鼠细胞制备得到嵌合非人哺乳动物;(3)将步骤(2)中得到的嵌合非人哺乳动物和正常野生型非人哺乳动物交配繁育,在后代中筛选获得Gpr97基因突变的杂合子非人哺乳动物;(4)通过将步骤(3)中得到的杂合子非人哺乳动物相互交配获得Gpr97基因突变的纯合子非人哺乳动物,从而得到Gpr97基因失活的非人哺乳动物模型。在一优选实施例中,所述筛选标记为neo基因。
在还一实施例中,所述步骤(2)中得到的Gpr97基因失活的非人哺乳动物模型中,与野生型对照小鼠相比,其免疫系统的B淋巴细胞在该模型的外周血、骨髓和/或脾脏组织中的百分含量下降。
在第二方面,本发明提供了根据上述方法制备的非人哺乳动物模型的用途,其中,该模型被用于研究人或动物中Gpr97基因的生物学功能。
在第三方面,本发明提供了根据上述方法制备的非人哺乳动物模型的用途,其中,该模型被用于筛选或鉴定能增加免疫系统中B淋巴细胞百分含量的物质。在一优选实施例中,该模型被用于筛选或鉴定能增加该模型的外周血、骨髓和/或脾脏组织中B淋巴细胞百分含量的物质。
在第四方面,本发明提供了一种筛选或鉴定B淋巴细胞缺陷治疗剂的方法,该方法包括以下步骤:a.将候选物质施用于第一方面所述方法制备的非人哺乳动物模型;和b.检测所述动物模型的外周血、骨髓和/或脾脏组织中B淋巴细胞的百分含量;其中,与对照相比,如果施用了候选物质的动物模型中所述B淋巴细胞的百分含量升高,则表明该候选物质是B淋巴细胞缺陷治疗剂。
在第五方面,本发明提供了一种G蛋白偶联受体97蛋白或其激动剂在制造用于增加免疫系统中B淋巴细胞百分含量的药物中的用途。
在一优选例中,所述蛋白质是下述(a)或(b)的蛋白质:
(a)由SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质;
(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且能增加免疫系统中B淋巴细胞百分含量的由(a)衍生的蛋白。
在另一优选例中,所述药物用于增加哺乳动物外周血、骨髓和/或脾脏组织中B淋巴细胞百分含量。
在另一优选例中,所述动物是Gpr97基因失活小鼠模型。
本发明的其它方面由于本文的公开内容,对本领域的技术人员而言是显而易见的。应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一赘述。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法和技术,通常按照所属领域的常规条件或按照制造厂商所建议的条件进行。
GPR97
GPR97是一个与功能了解的比较清楚的HE6(人附睾特异蛋白)和GPR56(人类大脑的特异蛋白)同源的孤儿G蛋白偶联受体。与HE6和GPR56一样,GPR97具有一个非常长的胞外区域,这个胞外区域具有细胞粘附蛋白的特点,且其胞内区域与其它G蛋白偶联受体相似(Fredriksson R,Lagerstrom MC,Hoglund PJ,SchiothHB.Novel human G protein-coupled receptors with long N-terminals containing GPSdomains and Ser/Thr-rich regions.FEBS Lett 2002;531:407-14;Shashidhar S,LorenteG,Nagavarapu U,et al.GPR56is a GPCR that is overexpressed in gliomas andfunctions in tumor cell adhesion.Oncogene 2005;24:1673-82)。Gpr97基因(GenBank:BC064508.1)是在搜索人基因组数据库时发现的(Fredriksson R,Lagerstrom MC,Hoglund PJ,Schioth HB.Novel human G protein-coupled receptors with long N-terminals containing GPS domains and Ser/Thr-rich regions.FEBS Lett 2002;531:407-14)。人类Gpr97基因与小鼠的Gpr97基因有高度同源性,同源性达到68%,小鼠的Gpr97基因(GenBank:BC064726.1)定位于小鼠8号染色体,长27.56kb,包含12个外显子,开放阅读框为2436bp,蛋白产物有542个氨基酸。目前,Gpr97基因的生理功能仍未知。
G蛋白偶联受体97蛋白或其激动剂
本文所用的术语“G蛋白偶联受体97蛋白的激动剂”具有本领域普通技术人员所理解的常规含义,即,能够对G蛋白偶联受体97蛋白的表达或活性起到促进、提高或改善作用的各种物质。
基因失活
对于功能未知基因的研究可采用许多方法,例如使有待研究的基因失活,分析所得的遗传修饰的表型变化,进而获得该基因的功能信息。这一研究方法的另一优点是可以将基因功能和疾病进行关联,从而在获得基因功能的同时也能获得该基因作为潜在药物或者药物靶点所能治疗的疾病信息和疾病动物模型。基因失活的方法可通过基因剔除、基因中断或基因插入的方式来完成。其中,基因剔除技术是研究人类基因在整体中的功能的非常强有力的手段。
本发明的主要优点
本发明方法能够获得Gpr97基因失活的动物模型,为研究Gpr97基因的功能,进而开发增加人或动物免疫系统中B淋巴细胞百分含量的药物提供了强有力的工具。
实施例1、人GPR97蛋白与小鼠GPR97蛋白的氨基酸序列同源性比较
人GPR97蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
小鼠GPR97蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
用NCBI的blastp软件对小鼠GPR97蛋白与人GPR97蛋白的上述氨基酸序列进行比对(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/),计算结果显示,小鼠的GPR97蛋白与人的GPR97蛋白在氨基酸序列上的同源性高达68%。具体比对数据如下:
HGPR97 SGQEKPTEGPRNTC--LGSNNMYDIFNLNDKALCFTKCRQSGSDSCNVENLQRYWLNYEA 76
+ E+ TE PRN C L + YD F+LND A CFTKC QS C+V NLQRYWLNYE+
MGPR97 TSDEETTEEPRNVCRRLQEGHEYDTFDLNDTAQCFTKCGQSEHSPCDVGNLQRYWLNYES 75
HGPR97 HLMKEGLTQKVNTPFLKALVQNLSTNTAEDFYFSLEPSQVPRQVMKDEDKPPDRVRLPKS 136
+L++ + + V+ PF+KAL+QN+ST+ +ED +SL SQ+PRQVM+ ED+P D VRLPKS
MGPR97 YLLENSM-ETVDMPFVKALIQNISTDVSEDLLYSLMLSQIPRQVMQGEDEPADGVRLPKS 134
HGPR97 LFRSLPGNRSVVRLAVTILDIGPGTLFKGPRLGLGDGSGVLNNRLVGLSVGQMHVTKLAE 196
LF +LPGNRS VRLA+T+LDIG G +FKGP+L GS VLNNR+VGLSVGQMH T L+E
MGPR97 LFGALPGNRSAVRLAITVLDIGAGNVFKGPKLLEDKGSSVLNNRMVGLSVGQMHATGLSE 194
HGPR97 PLEIVFSHQRPPPNMTLTCVFWDVTKGTTGDWSSEGCSTEVRPEGTVCCCDHLTFFALLL 256
P+EI FSH+R PPN+ LTCVFWD+ KG DW S GCST TVC CDHLTFFALLL
MGPR97 PVEITFSHERQPPNVILTCVFWDMAKG---DWDSHGCSTVPGDGRTVCRCDHLTFFALLL 251
HGPR97 RPTLDQSTVHILTRISQAGCGVSMIFLAFTIILYAFLRLSRERFKSEDAPKIHVALGGSL 316
RP LD +T LTRISQAG VSMIFLAFT++LY R S+RFKSEDAPKIH+AL SL
MGPR97 RPILDLATAQTLTRISQAGSAVSMIFLAFTMVLYVAFRFSLQRFKSEDAPKIHMALSISL 311
HGPR97 FLLNLAFLVNVGSGSKGSDAACWARGAVFHYFLLCAFTWMGLEAFHLYLLAVRVFNTYFG 376
FLLNL FL+NVGS S+G A+CW R A+FHYFLLC FTWMGLEAFHLYLLA+RVFNTYFG
MGPR97 FLLNLTFLINVGSSSQGPPASCWVRAAIFHYFLLCVFTWMGLEAFHLYLLAIRVFNTYFG 371
HGPR97 HYFLKLSLVGWGLPALMVIGTGSANSYGLYTIRDRENRTSLELCWFREGTTMYALYITVH 436
HYFLKLSL+ WGLP L+VIG GS+NSYG+YTIRD+ENRTSLELCWF++ ALY TVH
MGPR97 HYFLKLSLLAWGLPVLVVIGAGSSNSYGVYTIRDQENRTSLELCWFQKEP---ALYATVH 428
HGPR97 GYFLITFLFGMVVLALVVWKIFTLSRATAVKERGKNRKKVLTLLGLSSLVGVTWGLAIFT 496
GYFL+TFLFG VVLALV WKIFTL TA K +G K VLT+LGLSSLVG+TWGLA+ T
MGPR97 GYFLVTFLFGAVVLALVAWKIFTLPSVTAGKGQGPTWKSVLTVLGLSSLVGMTWGLAVLT 488
HGPR97 PLGLSTVYIFALFNSLQGVFICCWFTILYLPSQSTTVSSS-TARLDQAHSASQE 549
PLGLST+Y+F L NSLQG+FI CWF ILY P+QSTT SSS TARLDQAHS SQE
MGPR97 PLGLSTIYVFTLLNSLQGLFIFCWFIILYFPTQSTTASSSGTARLDQAHSVSQE 542
实施例2、Gpr97基因在RNA水平的组织表达谱
Gpr97在小鼠组织中的相对表达水平通过来自12个小鼠组织的cDNA样品进行检测,这些组织包括脑、胸腺、心脏、肺、肝、脾、肾、胃、睾丸、附睾、子宫、骨髓。RNA用Trizol试剂(Invitrogen)抽提,按照说明书进行操作。2μg总RNA用MMTV反转录酶(Promega,Madison,WI)反转录成cDNA。cDNA用特定的引物对进行扩增。反转录PCR中β-肌动蛋白和Gpr97的引物为:β-肌动蛋白(正向:5’-GCCTTCCTTCTTGGGTATG-3’SEQ ID NO.:3和反向:5’-ACGCAGCTCAGTAACAGTCC-3’SEQ ID NO.:4),Gpr97(正向:5’-CACCTTCGACTTGAATGACACTGCTC-3’SEQ ID NO.:5和反向:5’-TGCTGATGTTCTGGATCAATGCCTT-3’SEQ ID NO.:6)。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳分离和EB染色观察。实时定量PCR用双链DNA特异的荧光素SYBRGreen在
ep realplex(eppendorf)上进行。在实时定量PCR实验中β-肌动蛋白和Gpr97的引物序列为:β-肌动蛋白(正向:5’-TACCCAGGCATTGCTGACAGG-3’SEQ ID NO.:7和反向:5’-ACTTGCGGTGCACGATGGA-3’SEQ ID NO.:8),Gpr97引物同前。目标产物与非特异扩增产物的区分通过融解曲线分析实现。Gpr97的表达水平根据β-肌动蛋白的含量进行标准化处理。
实施例3、Gpr97基因失活小鼠的制备及鉴定
为使小鼠的Gpr97基因失活,本发明人设计了如图2所示的打靶策略,图2中显示了打靶载体(targeting vector)的设计。小鼠Gpr97基因共有12个外显子,应用生物信息学,本发明人剔除了Gpr97基因的外显子1(E1)和2(E2),共3368bp,并用neo基因替换。之所以剔除1号外显子是因为它包含了起始密码子(ATG)。其5′同源臂和3′同源臂的长度分别为6116bp和3485bp。
本发明的一具体实施例中,应用了ET克隆的方法来构建Gpr97基因打靶载体。具体过程如下:从含有Gpr97基因组序列的细菌人工染色体(BAC)中利用两对引物A1、A2和B1、B2分别扩增A、B同源臂。扩增使用的引物序列分别如下所示:
A 1:5’-CCGCTCGAGTCCTGTTCAACCTGGCTATGC-3’(SEQ ID NO.9)
A2:5’-TCTTCTGGTACCTGTGCTCATTTTGGACTGTG-3’(SEQ ID NO.10)
B1:5’-TTCCATGGTACCAGAAGAATGCTCCTCCTCTGG-3’(SEQ ID NO.11)
B2:5’-CGCGGATCC CCCTGCACATGACTGTCCTGA-3’(SEQ ID NO.12)
将上述PCR扩增获得的产物A和B分别用XhoI/KpnI和KpnI/BamHI酶切后,插入到pBR322-MK-MCS载体(含单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplexvirus-thymidine kinase)负选择元件,简称HSV-TK,上海南方模式生物研究中心提供)的XhoI/BamHI位点,获得套取载体pBR322-MK-MCS-AB。用XhoI线性化后,套取载体可以从BAC中套取含Gpr97的基因组DNA。利用引物C和D从PL452载体(图谱见图3)(该质粒由上海南方模式生物研究中心提供)上扩增PGK(phosphoglycerate kinase)-neo(neomycin)元件作为筛选标记。扩增使用的引物序列分别是:
C:5’-AAGAGGCCACAGGAAACAGTGGCCGCACGTCAGGGGGCAGGA-AGAAGGTCAGTTGGACAGGTCGACGAATTCCGAAGTTCCTATTCTC-3’(SEQID NO.13)
D:5’-GAACTTATGACAGTATGGCTTCCCAACAGGCCACTCCTCCCATTT-GCCCAGATTCCTCTCGGATCCACCTAATAACTTCG-3’(SEQ ID NO.14)
将PCR扩增得到的产物C-neo-D片段,敲入pBR322-MK-MCS-AB载体中获得所需的打靶载体。
将上述打靶载体质粒线性化之后,用电穿孔的方法将其导入到来源于C57BL/6(由上海南方模式生物研究中心提供)小鼠的胚胎干细胞(ES细胞)中。ES细胞在电穿孔24小时后换含有选择药物G418(终浓度为400mg/L)和Ganciclovoir(终浓度为2μmol/L)的培养液进行选择性培养。挑取双抗性细胞克隆转移至96孔培养板中培养,待细胞长满到60%-80%后取大部分细胞冻存,剩余细胞继续培养至长满100%后用于提取基因组DNA。在Gpr97基因同源重组臂外侧分别设计如P 1(5’-GGCCTCTTCAGTCTGGTGTTC-3’)(SEQ ID NO.15)和P4(5’-CAGGAATGGACCGTAAGAGCAC-3’)(SEQ ID NO.16)引物,在neo基因序列上设计P2(5’-GGCCTACCCGCTTCCATTGCTC-3’)(SEQ ID NO.17)和P3(5’-CCGTGCCTTCCTTGACCCTGG-3’)(SEQ ID NO.18)引物。用P1与P2引物配对,通过PCR扩增来鉴定5′臂同源重组;用P3和P4引物配对,通过PCR鉴定3′臂同源重组,片段长度分别为6.5kb和3.8kb,参见图4。可见,该克隆为所需的阳性ES细胞。
获得阳性ES细胞克隆后,将该细胞克隆注射到3.5天的小鼠囊胚腔中,获得了嵌合小鼠,将嵌合小鼠和正常野生型小鼠交配繁育,在后代中筛选获得了Gpr97基因突变的杂合子小鼠(Gpr97+/-),通过将杂合子小鼠相互交配获得Gpr97基因突变的纯合子小鼠(Gpr97-/-)。利用小鼠尾端组织提取DNA,并利用PCR扩增技术,可以区分不同基因型的小鼠。具体步骤为:在小鼠Gpr97基因3′同源重组臂设计引物P5,剔除区域设计引物P6,在neo基因序列上设计引物P7。引物序列分别是:P5(5’-GTTTCGCTGGGCAGAGACACCTAT-3’)(SEQ ID NO.19);P6(5’-GGGGCATGGAGACGGGAGCAC-3’)(SEQ ID NO.20);P7(5'-GAGCCCAGAAAGCGAAGGA-3′)(SEQ ID NO.21)。引物P5和P6用于扩增944bp的野生型片段,反应条件为:95℃ 5min变性后,94℃ 30s,60℃ 30s,72℃ 1min,进行35个循环后,72℃ 10min,引物P5和P7用于扩增突变条带,片段大小为730bp,反应条件为:95℃ 5min变性后,94℃ 30s,60℃ 30s,72℃ 35s,进行35个循环后,72℃ 10min。结果如图5所示,从图中可以看到,野生型小鼠(Gpr97+/+)对应的泳道中可见一条944bp的片段,杂合子小鼠(Gpr97+/-)对应的泳道中含有两条分别为944bp和730bp的片段,纯合子小鼠(Gpr97-/-)对应的泳道中含有一条730bp的片段。
分别将三种基因型小鼠的骨髓中的RNA用Trizol试剂(购自Invitrogen公司)抽提,具体按照该试剂说明书进行操作。从抽提出的RNA中取2μgRNA,用M-MLV反转录试剂盒(Promega)将其反转录成cDNA。以这些cDNA为模板,根据常规方法进行RT-PCR扩增。引物是:Gpr97-up(5′-AAGGCATTGATCCAGAACATCAGCA-3′)(SEQ ID NO.22)和Gpr97-down(5′-GTCTAGAACAGTTATGGCCAA-3′)(SEQ ID NO.23)。引物分别设计在3和4号外显子上,在剔除区域之外,因此不含该片段即可证明Gpr97基因的mRNA在Gpr97-/-小鼠的骨髓中是缺失的。将扩增后片段进行凝胶电泳。结果如图6所示,图中β-actin为内参。从图中可以看到,野生型小鼠9(Gpr97+/+)和杂合子小鼠(Gpr97+/-)对应的泳道中均可见一条192bp的片段,而纯合子小鼠(Gpr97-/-)对应的泳道中未发现该片段。该结果表明,Gpr97基因的mRNA在Gpr97-/-小鼠的骨髓中是缺失的。
分别从三种基因型小鼠的骨髓中抽提蛋白,将骨髓抽提蛋白经SDS聚丙烯凝胶电泳后转移到硝酸纤维素膜上。Western Blot按照常规方法进行。抗体为兔抗人GPR97多抗,购自Santa Cruz公司。杂交结果如图7所示,图中,GAPDH表示甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)。该结果表明,GPR97基因突变的纯合子小鼠中已检测不到GPR97蛋白的存在。
实施例4、Gpr97基因失活小鼠骨髓中各细胞系成分变化的研究
进一步的研究发现,Gpr97-/-小鼠能正常出生、发育和成熟,并能生育后代。纯合子小鼠的体重、骨密度、胸腺与体重的比率、脾脏与体重的比率和外周血中各种血细胞的数目与野生型对照相比均无明显异常,但是这类小鼠的B淋巴细胞在外周血、骨髓和脾脏组织中与同窝出生的野生型小鼠相比其百分含量都有明显下降。
为检测Gpr97基因失活小鼠及野生型同窝小鼠骨髓细胞中B细胞百分含量变化,进行了如下实验。
取12周龄的Gpr97基因失活小鼠及野生型同窝小鼠的股骨,骨髓细胞用含2%血清的PBS从小鼠的股骨冲出,计数,每个样品取1×106个细胞,加合适浓度的单抗(Anti-B220-FITC、anti-Gr-1-APC、anti-CD3-FITC、anti-Ter 119-PE、anti-CD41-PE),4℃孵育30min,用含1%血清0.1%Na2N3的PBS,洗涤三次。用200μl含1%血清0.1%Na2N3的PBS重悬细胞。流式细胞仪进行检测,结果用Cell Quest(BD Biosciences)软件进行分析。结果如图8所示,Gpr97基因失活小鼠骨髓中B细胞的百分数有所下降,并有统计学(用Student’s t-test进行统计学分析)差异。*:p<0.05。
实施例5、Gpr97基因失活小鼠脾脏、骨髓、外周血中B淋巴细胞百分含量的研究
为检测Gpr97基因失活小鼠及脾脏、骨髓、外周血中B淋巴细胞百分含量的变化,进行了如下实验。
取12周龄的Gpr97基因失活小鼠及野生型同窝小鼠,眼球采血获取外周血后用红细胞裂解液裂解,小鼠脱颈处死,取脾脏,用滤网将其碾磨挤出并用红细胞裂解液裂解,骨髓细胞用含2%血清的PBS从小鼠的股骨冲出,计数,每个样品取1×106个细胞,加合适浓度的单抗(Anti-B220-FITC,anti-Gr-1-APC,anti-CD3-PE),4C孵育30min,用含1%血清0.1%Na2N3的PBS,洗涤三次。用200μl含1%血清0.1%Na2N3的PBS重悬细胞。流式细胞仪进行检测,结果用Cell Quest(BD Biosciences)软件进行分析。结果如图9所示,Gpr97基因失活小鼠与同窝的野生型小鼠相比,其B细胞含量在骨髓、脾脏及外周血中下降,并且有统计学意义。图中从左至右分别代表脾脏、骨髓和外周血三种组织中对应的B细胞百分含量的变化情况(*:p<0.05;**:p<0.01)。
结论
以上实验结果表明,Gpr97基因功能的缺乏将影响B淋巴细胞的发育,由于小鼠的GPR97蛋白与人类GPR97蛋白具有高度同源性,两者在氨基酸上的同源性高达68%,这一发现的结果将为研究Gpr97基因在人类免疫系统中的作用,以及相关的药物开发方面提供了直接的实验证据,具有重要的应用价值。
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