CN103386138B - 一种调节纤毛发育的microRNA及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种调节纤毛发育的microRNA及其应用。具体地，miR-129-3p，或经修饰的miR-129-3p衍生物，或miR-129-3p类似物，都具有能特异性地与CP110mRNA的3’UTR结合的核心元件，所述核心元件的核苷酸序列为5’-AGCCCU-3’；所述microRNA能够调控中心粒-基体的转变和纤毛的生长；在培养的细胞中抑制内源的miR-129-3p会抑制纤毛的发生过程；过表达miR-129-3p会在增殖的细胞中诱导纤毛的发生，且在饥饿的细胞中会导致纤毛异常延长；miR-129-3p通过同时下调CP110蛋白和4个调控微丝动态的蛋白（Arp2、Toca1、abLIM1和abLIM3）的表达水平来控制纤毛的发生；Arp2、Toca1、abLIM1和abLIM3均参与分枝状微丝聚合过程；miR-129-3p突变导致纤毛异常相关的疾病，miR-129-3p可以作为相关疾病的检测或治疗靶点。

Description

一种调节纤毛发育的microRNA及其应用

技术领域

本发明涉及遗传发育领域，具体地，本发明涉及一种调节纤毛发育的microRNA及其应用。

背景技术

纤毛(cilium)是广泛分布于动物组织中的一种突出于细胞表面的基于微管结构的毛状细胞器，几乎存在于人体的各种类型细胞的表面。它伸出细胞表面，发挥着拨动液流、感知胞外环境、信号传导和细胞运动等重要的作用。纤毛在结构上分为紧贴在细胞膜下的基体（basalbody），基体之上的转接区（transitionzone），突出于细胞表面的轴丝（axoneme），以及包围轴丝的质膜。轴丝是纤毛的结构核心，由微管构成。

根据运动性而言，纤毛可以大致分为两类：运动型纤毛（motilecilium）和非运动型纤毛（也称为初级纤毛或者感觉纤毛，non-motilecilium，primaryciliumorsensorycilia）。运动纤毛一般成簇的出现在细胞表面，以相同的频率振动，它们定位于气管上皮细胞、大脑室管膜细胞以及输卵管上皮细胞等；也有的单根存在，如精子的鞭毛。运动纤毛发生异常会导致很多人类疾病的发生。气管上皮细胞的纤毛同步发生振动，产生的波动帮助粘液的运输和气管的清洁，气管纤毛的异常会导致从鼻咽到支气管部位的多种疾病的发生。大脑室管膜纤毛同步的振动会使脑脊髓液在室管膜细胞表面产生一个层流，如果这里的纤毛发生异常，则会引起脑水肿。输卵管纤毛的活动参与了受精卵的运输。精子的鞭毛帮助精子游动，鞭毛异常会导致男性不育。对于非运动型纤毛的研究有相当长的时间都被忽视，直到近年多项研究发现初级纤毛相关基因的突变可导致Bardet-Biedl综合症、Meckel-Gruber综合症和Orofaciodigital综合症I等，这些遗传病的症状主要包括多囊肾、多指、失明、嗅觉丧失、肥胖、智力发育迟缓以及不育等。

纤毛的发生过程中，包括中心体向基体的转变和纤毛生长两个过程，位于细胞中央的中心体会迁移至细胞膜的下方并与细胞膜结合，此时一些相关的蛋白质结合到这个中心体上形成了基体。随后，微管开始在基体上组装，突出细胞膜形成转接区和轴丝。脂类、微管的组分与大量同感知与信号传导相关的蛋白质被鞭毛内运输复合物或者膜运输运送到轴丝以使纤毛能够生长并行使其功能。纤毛的长度也受到精细的控制，长度异常的纤毛通常会导致功能异常。

目前，关于纤毛相关的研究工作主要集中在以下几个方面：（1）纤毛相关蛋白质的鉴定；（2）纤毛病变相关蛋白质复合物的筛选、功能以及致病机理的研究；（3）纤毛与信号传导之间的关系的研究等。但是本领域目前为止关于纤毛形成的具体分子机理还不是太清楚，因此本领域迫切需要研究纤毛发生与发育相关机理。

发明内容

本发明的目的就是提供一种调节纤毛发生的microRNA—miR-129-3p，及其在调节纤毛发生中的应用。

在本发明的第一方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包括药学上可接受的载体和有效量的选自下组的一种或多种活性成分：

（a）miR-129-3p，或经修饰的miR-129-3p衍生物，或miR-129-3p类似物，所述的miR-129-3p，或经修饰的miR-129-3p衍生物，或miR-129-3p类似物具有特异的识别功能的核心元件，所述核心元件的核苷酸序列为：5’-AGCCCU-3’；

（b）前体miRNA，所述的前体miRNA能在宿主内加工成miR-129-3p；

（c）多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主转录形成（b）中所述的前体miRNA，并加工形成miR-129-3p；

（d）表达载体，所述的表达载体含有（a）中所述的miR-129-3p、或（b）中所述的前体miRNA、或（c）中所述的多核苷酸；

（e）（a）中所述的miR-129-3p的激动剂或拮抗剂。

在另一优选例中，miR-129-3p，或经修饰的miR-129-3p衍生物，或miR-129-3p类似物具有18-26个(优选地约19-22个)核苷酸。

在另一优选例中，所述的经修饰的miR-129-3p衍生物，或miR-129-3p类似物与miR-129-3p的同源性≥80％，较佳地≥90%，更佳地≥95%，最佳地≥99%。

在另一优选例中，所述的miR-129-3p来源于人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述的非人哺乳动物为大鼠、小鼠。

在另一优选例中，所述的宿主为：人或啮齿动物（如大鼠、小鼠）。

在另一优选例中，所述药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂（片剂、胶囊、口服液）、透皮剂、缓释剂。

在另一优选例中，所述的药学上可接受的载体包括（但不限于）：脂质体、纤维素、纳米凝胶。

在另一优选例中，所述的miR-129-3p，或经修饰的miR-129-3p衍生物，或miR-129-3p类似物的第2位-第7位为核心元件：5’-AGCCCU-3’。

在另一优选例中，所述的miR-129-3p，或经修饰的miR-129-3p衍生物，或miR-129-3p类似物的第1位和/或第8位核苷酸为A。

在另一优选例中，所述的miR-129-3p的核苷酸序列如SEQIDNO.:1(5’-aagcccuuaccccaaaaagcau-3’)所示。

在另一优选例中，（a）中所述经修饰的miRNA衍生物具有式I所示的结构：

(X)_n－Y式I

式I中，

X为序列如SEQIDNO.:1所示的核苷酸序列；

Y为甾醇或多肽；

n为任选自1-50的（较佳地1-20）正整数；

Y连接于X的左侧、右侧或中间。

在另一优选例中，n为1、2、3、4或5。

在另一优选例中，（c）中所述的多核苷酸具有式II所示的结构：

Seq_正向-X-Seq_反向

式II

式II中，

Seq_正向为能在宿主中被加工成miR-129-3p的核苷酸序列；

Seq_反向为与Seq_正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；

X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补；

并且式II所示的结构在转入宿主细胞后，形成式III所示的二级结构：

式III，

式III中，||表示在Seq_正向和Seq_反向之间形成的碱基互补配对关系，Seq_正向、Seq_反向和X的定义如上述。

在另一优选例中，所述miR-129-3p的激动剂选自下组：促进miR-129-3p表达的物质、提高miR-129-3p活性的物质；或所述miR-129-3p的拮抗剂选自下组：抑制miR-129-3p表达的物质、降低miR-129-3p活性的物质。

在另一优选例中，（d）中所述的表达载体包括：质粒、或病毒载体。

在另一优选例中，所述的病毒载体为腺病毒载体。

在另一优选例中，（b）中所述的前体miRNA的序列如SEQIDNO.:2（5’-ugcccuucgcgaaucuuuuugcggucugggcuugcuguacauaacucaauagccggaagcccuuaccccaaaaagcauuugcggagggcg-3’）所示。

在另一优选例中，所述的前体miRNA来源于人。

在本发明的第二方面，提供了一种活性成分的用途，其中，所述的活性成分选自下组的一种或多种：

（a）miR-129-3p，或经修饰的miR-129-3p衍生物，或miR-129-3p类似物，所述的miR-129-3p，或经修饰的miR-129-3p衍生物，或miR-129-3p类似物具有特异的识别功能的核心元件，所述核心元件的核苷酸序列为：5’-AGCCCU-3’；

（b）前体miRNA，所述的前体miRNA能在宿主内加工成miR-129-3p；

（c）多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主转录形成（b）中所述的前体miRNA，并加工形成miR-129-3p；

（d）表达载体，所述的表达载体含有（a）中所述的miR-129-3p、或（b）中所述的前体miRNA、或（c）中所述的多核苷酸；

（e）（a）中所述的miR-129-3p的激动剂或拮抗剂；

所述活性成分用于制备预防或治疗纤毛异常相关疾病的药物。

在另一优选例中，所述的纤毛异常相关疾病选自下组：多囊肿性肾病(polycystickidneydisease)、肾消耗病(nephronophthisis)、视网膜退化和失明(age-relatedblindness)、不育症(infertile)、嗅觉丧失(anosmia)、内脏倒位(situsinversus)、脑积水(hydrocephalus)、原发性纤毛运动不良综合征(primaryciliarydyskinesia)，或巴德-毕德氏综合征(Bardet-Biedlsyndrome)。

在本发明的第三方面，提供了一种预防或治疗纤毛异常相关疾病的方法，给需要的对象施用本发明第一方面所述的药物组合物。

在另一优选例中，所述的对象包括人。

在本发明的第四方面，提供了一种检测纤毛异常相关疾病的方法，包括步骤：

分别检测待测样本和阴性对照样本miR-129-3p的表达水平，如果与阴性对照样本相比，待测样本的miR-129-3p的表达水平存在异常的提高或降低，则是潜在的纤毛异常相关疾病患病样本。

在另一优选例中，所述的方法还包括步骤：分别检测待测样本和阴性对照样本多肽或其编码基因的表达水平，所述多肽选自下组：Arp2、Toca1、abLIM1、abLIM3，如果与阴性对照样本相比，任一所述多肽的表达水平存在与miR-129-3p成负相关的异常的提高或异常的降低，则是潜在的纤毛异常相关疾病患病样本。

在另一优选例中，所述异常的降低是指：与阴性对照样本相比，所述miRNA或多肽的表达水平的降低幅度≥10%，较佳地≥20%，较佳地≥50%，更佳地≥80%，最佳地≥100%。

在另一优选例中，所述异常的提高是指：与阴性对照样本相比，所述miRNA或多肽的表达水平的提高幅度≥10%，较佳地≥20%，较佳地≥50%，更佳地≥80%，最佳地≥100%。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示在哺乳动物CP110mRNA中miR-129-3p靶位点的保守性，其中，图1a显示利用TargetScan软件预测了CP110mRNA中miR-129-3p的靶位点，与miR-129-3p“seedsequence”互补的核苷酸用下划线标出，数字代表在3’UTR中的位点；图1b显示Luc-3’UTR报告实验的测试过程，如果3’UTR具有miR-129-3p的靶位点，则荧光素酶的合成下降；图1c显示miR-129-3p和control海绵（sponges）的设计，构建物表达GFP和6个拷贝的miR-129-3p-结合位点(SP-129)或control位点(SP-C)；SP-129的表达可以中和miR-129-3p；图1d显示人和鼠的CP110的3’UTR中的相应靶点能够被miR-129-3p所调控。

图2显示miR-129-3p部分通过抑制CP110的表达促进纤毛生成；其中，图2a显示过表达M129下调CP110；图2b和图2c显示，在RPE1细胞中，中和内源的miR-129-3p可以抑制纤毛发生；图2d和图2e显示，在RPE1细胞中过表达M129造成自发的纤毛发生；图2f和图2g显示，饥饿48小时的细胞，M129促进纤毛生长，**P<0.01;***P<0.001。

图3显示在IMCD3和ARPE19中，M129诱导自发的纤毛发生；其中，图3a和图3b显示，在ARPE19细胞中，M129或CP110i对CP110水平和自发性纤毛发生的影响；图3c和图3d显示在IMCD3细胞中，M129促进纤毛的自发发生，**P<0.01;***P<0.001。

图4显示了M129的剂量效应；其中，图4a显示转染了oligo的RPE1细胞在含有血清培养基中培养72h，统计长纤毛细胞的比例，基于结果，使用M129终浓度为30nM作为常规转染的浓度；图4b显示，M129转染前后miR-129-3p在细胞中的相对水平，**P<0.01;***P<0.001。

图5显示miR-129-3p不引起细胞周期的阻滞；其中，图5a、图5b显示M129对EdU阳性细胞的比例没有影响，转染M129后大约42.7%的EdU阳性的细胞长出了纤毛，而在对照组这一比例仅为约2.8%；图5c显示2D-FACS检测结果，转染M12924h或者48h后，与对照组相比细胞周期基本没有影响；图5d显示转染时间梯度结果，M129转染后24h或者48h即有约25.9%和41.8%的细胞在不饥饿的情况下长出了纤毛。

图6显示miR-129-3p能够同时抑制CP110的表达和微丝的聚合。其中，图6a,图6b显示单独过表达M129或者CD处理都能有效的使纤毛自发生长，前者比后者长纤毛的比例平均高出约9.4%；同时过表达M129和CD处理并不能使这一比例增加，而CP110RNAi之后再用CD处理长纤毛的比例会增加约29.2%，和只过表达M129的结果相当；图6c和图6d显示在血清饥饿的情况下，CD处理不会增加过表达M129之后纤毛的长度，但是会增加CP110RNAi之后纤毛的长度，使之与只过表达M129的结果相当（图6c,图6d）；图6e显示CD处理不影响CP110、Cep97和Kif24的蛋白表达水平。

图7显示M129抑制分枝状F-actin的组装，其中，图7a显示，M129使得胞内F-actin紊乱，图7b和图7c显示M129抑制片状伪足的形成；图7d和图7e显示M129抑制细胞的迁移，***P<0.001。

图8显示M129促进Rab11a在中心体附近的聚集，在M129转染48h后通过免疫荧光染色观察Rab11a的定位，发现约78.1%的细胞Rab11a在中心体/基体附近聚集，而转染了对照的细胞只有约21.8%的细胞出现所述现象。

图9显示miR-129-3p以纤毛形成和控制纤毛长度的多个微丝相关基因作为靶位点，其中，图9a显示将RPE1细胞转染72h，通过qRT-PCR对潜在的miR-129-3p靶基因的表达水平的检测结果，图9b显示相应基因的3’UTR的荧光素酶活性检测结果，图9c和图9d显示通过RNAi抑制相应基因的表达对于纤毛自发生生的效应。

图10显示miR-129-3p以纤毛形成和控制纤毛长度的多个微丝相关基因作为靶位点，其中，图10a和图10b显示通过RNAi抑制相应基因的表达对纤毛长度的效应，图10c和图10d显示了M129对相应蛋白表达水平的抑制效应，*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。

图11显示了siRNAoligo的抑制效率。

图12显示miR-129-3p直接作用于基因abLIM1、abLIM3、Toca1和Arp2的3’UTRs，其中，图12a显示TargetScan预测的靶点，标出了与miR-129-3p互补的核苷酸序列，数字显示了其在3’UTRs的位点；图12b显示荧光素酶的相对活性，**P<0.01;***P<0.001。

图13显示过表达靶蛋白抑制了miR-129-3p诱导纤毛形成的作用；其中，图13a显示Myc标签蛋白的表达以及不同Myc标签蛋白的相对水平；图13b显示典型的表达Myc标签蛋白的细胞；图13c和图13d显示过表达靶蛋白对于miR-129-3p诱导纤毛形成的回复作用；图13e显示回复实验中外源蛋白与相应的内源蛋白的相对剂量结果*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。

图14显示siRNAoligo对纤毛形成的叠加效应；其中，图14a显示siRNAoligo转染72h纤毛发生的结果；图14b显示相应oligo的RNAi效应，**P<0.01;***P<0.001。

图15显示abLIM1和abLIM3对于片状伪足的形成和细胞迁移具有重要作用；其中，图15a显示abLIM1和abLIM3在RPE1细胞中定位于片状伪足和应力纤维中；图15b和图15c显示RNAi的效应，箭头指示片状伪足；图15d和图15e显示敲除abLIM1和abLIM3抑制了细胞迁移。

图16显示Rac1CA抑制了纤毛形成；其中，图16a显示用GFP或GFP-Rac1CA转染48h后，再血清饥饿24h的细胞，用乙酰化的微管作为marker进行免疫染色，箭头指示纤毛或中心体；图16b显示长纤毛细胞的比例。

图17显示miR-129-3p在血清饥饿时下调其靶蛋白水平，**P<0.01;***P<0.001。

图18显示miR-129-3p在小鼠组织中的表达。

图19显示原位杂交检测miR-129-3p在小鼠组织中的表达定位结果，其中miR-129-3p在肾脏小管(renaltubule)和收集管(collectingduct)（图19a），大脑的VZ(ventricularzone)、SVZ(sub-ventricularzone)、CP(corticalplate)和Striatum区（图19c），以及视网膜上皮的GCL(gangalioncelllayer)区、部分NBL(neuroblasticlayer)区（图19e）等区域有表达，而且miR-129-3p有表达的区域都存在长纤毛的细胞（图19b、图19d、图19f）。

图20显示miR-129-3p的表达可能与多纤毛细胞的分化无关；其中，图20a显示分离小鼠气管上皮细胞，并通过建立气-液接触面来诱导分化，使逐渐长出多根的动纤毛；图20b显示定量PCR检测结果，mir-449a在分化过程中急剧上调，但是miR-129-3p的水平则没有显著的变化。

图21显示了斑马鱼miR-129-3p调控胚胎发育中纤毛的发生和功能，其中，图21a显示脊椎动物中miR-129-3p基因比对结果，seedsequences用下划线标出，图21b和图21c显示斑马鱼的同源物dre-miR-129*原位杂交结果。

图22显示了注射129morpholinos在斑马鱼发育中的效应，其中，用129-MO(图22a,图22b)或129-MO2封闭dre-miR-129*造成身体弯曲和心包水肿图22c、图22d。

图23显示注射129morpholinos对斑马鱼左右不对称性的影响；129-MO(图23a,图23b)或129-MO2(图23c,图23d)导致身体左右不对称性异常。

图24显示注射129-MO后对KV纤毛的影响，与对照相比，KV纤毛的平均数目减少了50.5%（8ng），而剩下的纤毛其平均长度减少了37.3%（8ng）（图24a-图24c）。另外，原肾管纤毛的密度和长度也有明显的减小（图24d-图24f）。

图25显示miR-129-3pmimic抑制129-MO造成的发育缺陷。

图26显示miR-129-3pmimic减弱129-MO所导致的身体左右不对称性异常。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，发现一类miRNA：miR-129-3p、经修饰的miR-129-3p衍生物、或miR-129-3p类似物，该类miRNA具有能特异性地与CP110mRNA的3’UTR结合的核心元件，所述核心元件的核苷酸序列为5’-AGCCCU-3’；所述miRNA能直接参与纤毛的发生，在培养的细胞中抑制内源的miR-129-3p会抑制纤毛的发生过程；过表达miR-129-3p会在增殖的细胞中诱导纤毛的发生，且在饥饿的细胞中会导致纤毛异常延长；miR-129-3p通过同时下调CP110蛋白和4个调控微丝动态的蛋白（Arp2、Toca1、abLIM1和abLIM3）的表达水平来控制纤毛的发生；Arp2、Toca1、abLIM1和abLIM3均参与分枝状微丝聚合过程；miR-129-3p突变可能导致纤毛异常相关的疾病，miR-129-3p可以作为相关疾病的检测或治疗靶点。在此基础上完成了本发明。

miRNA及其前体

本发明提供了一类涉及纤毛发育相关的miRNA。

如本文所用，所述的“miRNA”是指一种RNA分子，从可形成miRNA前体的转录物加工而来。成熟的miRNA通常具有18-26个核苷酸(nt)(优选地约19-22nt)，也不排除具有其它数目核苷酸的miRNA分子。miRNA通常可被Northern印迹检测到。

miRNA可被从细胞中分离。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

miRNA可从前体miRNA(PrecursormiRNA，Pre-miRNA)加工而来，所述的前体miRNA可折叠成一种稳定的茎环（发夹）结构，所述的茎环结构长度一般在50-100bp之间。所述的前体miRNA可折叠成稳定的茎环结构，茎环结构的茎部两侧包含基本上互补的两条序列。所述的前体miRNA可以是天然的或是人工合成的。

前体miRNA可被剪切生成miRNA，所述的miRNA可与编码基因的mRNA的至少一部分序列基本上互补。如本文所用，“基本上互补”是指核苷酸的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎环结构)。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70%的核苷酸是互补的；优选的，至少有80%的核苷酸是互补的；更优选的，至少有90%的核苷酸是互补的；进一步优选的，至少有95%的核苷酸是互补的；如98%、99%或100%。一般地，两条足够互补的分子之间可以具有最多40个不匹配的核苷酸；优选的，具有最多30个不匹配的核苷酸；更优选的，具有最多20个不匹配的核苷酸；进一步优选的，具有最多10个不匹配的核苷酸，如具有1、2、3、4、5、8、11个不匹配的核苷酸。

如本文所用，“茎环”结构也被称作“发夹”结构，是指一种核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。即使该核苷酸分子的两个区域不是完全互补的，核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如，插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构，然而，该两个区域仍可基本上互补，并在可预见的方式中发生相互作用，形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。

本发明所述的miRNA包括：miR-129-3p，或经修饰的miR-129-3p衍生物，或miR-129-3p类似物，且所述microRNA，或经修饰的miR-129-3p衍生物，或miR-129-3p类似物能特异性地与CP110mRNA的3’UTR结合的、核苷酸如SEQIDNO.:1所示的核心序列；

本领域的普通技术人员可以使用通用的方法对miR-129-3p进行修饰，修饰方式包括（但不限于）：烃基修饰、糖基化修饰、核酸化修饰、肽段修饰、脂类修饰、卤素修饰等。其中，糖基化的修饰基团包括：2-甲氧基-糖基、烃基-糖基、糖环基等。为了提高miRNA的稳定性或其它性质，还可在所述的miRNA的至少一端加上至少一个保护性碱基，如“TT”等，或在miR-129-3p序列的基础上改变1个到多个核苷酸而得到的miR-129-3p的类似物。

多核苷酸构建物

根据本发明所提供的miRNA序列，可设计出在被导入后可被加工成可影响相应的mRNA表达的miRNA的多核苷酸构建物，也即所述多核苷酸构建物能够在体内上调相应的miRNA的量。因此，本发明提供了一种分离的多核苷酸(构建物)，所述的多核苷酸(构建物)可被人细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA可被人细胞剪切且表达成所述的miRNA。

作为本发明的一种优选方式，所述的miR-129-3p多核苷酸构建物含有式II所示的结构：

Seq_正向-X-Seq_反向

式II

式II中，

Seq_正向为可在细胞中表达成所述的的核苷酸序列，Seq_反向为与Seq_正向基本上互补的核苷酸序列；或者，Seq_反向为可在细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq_正向为与Seq_正向基本上互补的核苷酸序列；

X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补；

式I所示的结构在转入细胞后，形成式III所示的二级结构：

式III

式III中，Seq_正向、Seq_反向和X的定义如上述；

||表示在Seq_正向和Seq_反向之间形成的碱基互补配对关系。

通常，所述的多核苷酸构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的miRNA，或所述的多核苷酸构建物。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。

药物组合物

本发明提供了一种药物组合物，包括药学上可接受的载体或有效量的选自下组的一种或多种活性成分：（a）miR-129-3p，或经修饰的miR-129-3p衍生物，或miR-129-3p类似物，所述microRNA，或经修饰的miR-129-3p衍生物，或miR-129-3p类似物具有特异识别功能的核心元件，所述核心元件的核苷酸序列为：5’-AGCCCU-3’；（b）前体miRNA，所述的前体miRNA能在宿主内加工成miR-129-3p；（c）多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主转录形成（b）中所述的前体miRNA，并加工形成miR-129-3p；（d）载体，所述载体含有（a）中所述的miR-129-3p、或（b）中所述的前体miRNA、或（c）中所述的多核苷酸；（e）（a）中所述的miRNA-23的激动剂或拮抗剂。

在本发明的另一优选例中，所述的药物组合物还包括CP110、Arp2、Toca1、abLIM1、abLIM3的拮抗剂或激动剂。

在本发明的另一优选例中，所述的miR-129-3p来源于人或非人哺乳动物。

在本发明的另一优选例中，（a）中所述的经修饰的miRNA衍生物具有式I所示的结构：

(X)_n－Y式I

式I中，

X、Y、和n的定义如上所述。

在本发明的另一优选例中，（c）中所述的多核苷酸具有式II所示的结构：

Seq_正向-X-Seq_反向

式II

式II中，Seq_正向为能在宿主中被加工成miR-129-3p的核苷酸序列；Seq_反向为与Seq_正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补；并且式II所示的结构在转入宿主细胞后，形成式III所示的二级结构：

式III，

式III中，Seq_正向、Seq_反向和X的定义如上述，||表示在Seq_正向和Seq_反向之间形成的碱基互补配对关系。

在本发明的另一优选例中，所述的前体miRNA的序列如SEQIDNO.:2所示。

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂（片剂、胶囊、口服液）、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。

本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的活性成分每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

本发明所述的药学上可接受的载体包括（但不限于）：脂质体、纤维素、纳米凝胶载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。

本发明还提供了所述药物组合物的用途，用于制备抑制自身免疫反应的抑制剂、制备预防或治疗自身免疫反应疾病的药物。所述的自身免疫反应疾病选自下组：风湿性关节炎、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、实验性变态反应性脑脊髓膜炎、胶原诱导的类风湿性关节炎等。

诊断方法

本发明还提供了一种检测纤毛相关疾病的方法，在一个优选例中，包括步骤：分别检测待测样本和阴性对照样本miR-129-3p的表达水平，如果与阴性对照样本相比，待测样本的miR-129-3p的表达水平存在异常的提高或降低，则是潜在的纤毛异常相关疾病患病样本。在另一优选例中，所述的方法还包括步骤：分别检测待测样本和阴性对照样本多肽或其编码基因的表达水平，所述多肽选自下组：CP110、Arp2、Toca1、abLIM1、abLIM3，如果与阴性对照样本相比，所述多肽的表达水平存在与miR-129-3p成负相关的异常的提高或异常的降低，则是潜在的纤毛异常相关疾病患病样本。

在另一优选例中，所述异常的降低是指：与阴性对照样本相比，所述miRNA或多肽的表达水平的降低幅度≥10%，较佳地≥20%，较佳地≥50%，更佳地≥80%，最佳地≥100%。在另一优选例中，所述异常的提高是指：与阴性对照样本相比，所述miRNA或多肽的表达水平的提高幅度≥10%，较佳地≥20%，较佳地≥50%，更佳地≥80%，最佳地≥100%。

本发明的主要优点：

（1）本发明揭示了miRNA介导的转录后调控机制同时调控了中心粒-基体转变过程和之后纤毛的生长过程，证明单个miRNA直接参与纤毛的发生，将miRNA和纤毛的发生直接联系在一起；

（2）在培养的细胞中抑制内源的miR-129-3p就会抑制纤毛的发生过程；过表达miR-129-3p会在增殖的细胞中诱导纤毛的发生，且在饥饿的细胞中会导致纤毛异常延长；

（3）miR-129-3p通过同时下调CP110蛋白和4个调控微丝动态的蛋白（Arp2、Toca1、abLIM1和abLIM3）的表达水平来控制纤毛的发生；Arp2、Toca1、abLIM1和abLIM3均参与分枝状微丝聚合过程；

（4）miR-129-3p在血清饥饿过程中下调相关蛋白的表达水平来控制纤毛发生；斑马鱼miR-129-3p调控胚胎发育中纤毛的发生和功能；

（5）miR-129-3p的突变可能导致纤毛异常相关的疾病，miR-129-3p可以作为相关疾病的检测或治疗靶点。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料与方法

所使用的细胞系均购自ATCC（AmericanTissueCultureCollection），

细胞系名称及培养基分别为：

hTERT-RPE1：DMEM/F12（Invitrogen）+10%胎牛血清（Invitrogen）+0.01mg/mlhygromycinB（Invitrogen）；

293T/17：DMEM（Invitrogen）+10%胎牛血清（Invitrogen）；

NIH3T3：DMEM+10%灭活新生牛血清（Invitrogen）；

IMCD3：DMEM/F12+10%胎牛血清；

另外培养基中均加入100μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素，细胞在37°C，5%CO₂的培养箱中培养。

市售斑马鱼（AB品系）按照标准的方法饲养、交配和产卵，发育阶段用受精后小时数指示。

小鼠品系为C57BL/6J，购自上海实验动物中心。

限制性内切酶、T4DNA连接酶购自Takara，碱性磷酸酶（CIP）购自NEB。

二甲基亚砜（DMSO）、三卡因（tricaine）、苯基硫脲（phenylthiourea）、多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）、酚红（PhenolRed）、蛋白酶K（ProteinaseK）、酵母RNA（YeasttRNA）、Heparinsodiumsalt、马来酸（maleicacid）、四咪唑均购自Sigma。

20×SSC、体外转录试剂盒mMessagemMachineSP6kit购自Ambion。

DIGRNAlabelingkit（SP6/T7）、Blockingreagent、BCIP/NBT购自Roche。

甲酰胺（formamide）购自AppliChem。

TRIzolreagent、SuperscriptIIIFirstStrandSynthesisSystemforRT-PCRKit购自Invitrogen。

PowerSYBRGreenPCRmasterMixkit购自AppliedBiosystems。

E2培养液：溶液1：17.5gNaCl，0.75gKCL，2.4gMgSO4，0.41gKH2PO4，0.30gNa2HPO4-12H2O定容至1L；溶液2：7.25gCaCl2定容至100ml；溶液3：3gNaHCO3定容至100ml。取50ml溶液1、2ml溶液2和2ml溶液3定容至1L配成E2培液。

Q-PCR所用引物见表1：

表1

克隆3’UTR所用引物见表2：

表2

3’UTR点突变所用引物见表3：

表3

克隆基因所用引物见表4：

表4

构建sponge克隆所用引物见表5：

表5

质粒构建

人CP110基因的cDNA购自OpenBiosystems，人的abLIM1、abLIM3和Arp2基因的cDNA通过PCR扩增自hTERT-RPE1细胞的RNA，这些基因的编码区（ORF）分别接入市售的pcDNA3.1-3×myc载体，获得N端带有3个myc-tag的融合表达质粒。所有的3’UTR序列都通过PCR扩增自hTERT-RPE1细胞的RNA，并接入市售的pGL3M载体，获得luciferase报告质粒。

miR-129-3psponge质粒按照常用方法构建，将合成的含有6个与miR-129-3p不完全配对序列的寡核苷酸片段退火，接入市售的pCAG-EGFP载体，对照sponge含有6个不与任何已知的miRNA配对的序列。

细胞转染

质粒DNA和合成的RNAoligo分别使用Lipofectamine2000和LipofectamineRNAiMAX转染，方法参照产品说明书（Invitrogen），对于6孔板的一个孔，转染剂量为4μg质粒或者4μl（20μM）oligo。为检测纤毛的长度，hTERT-RPE1细胞转染RNAoligo48小时后，去掉FBS饥饿48小时。为同时转染质粒和RNAoligo，hTERT-RPE1细胞先使用Lipofectamine2000转染质粒4小时，然后使用LipofectamineRNAiMAX转染RNAoligo24小时。合成的miR-129-3pmimic和Allstarsnegativecontrololigo购自Qiagen公司。所有的siRNAoligo购自GenePharma。

免疫荧光染色及拍照

细胞免疫荧光染色按照常用方法操作，为了更清晰的染纤毛，细胞在固定前先在冰上放置30min。免疫荧光图像使用LeicaTCSSP5MP激光共聚焦显微镜或者OlympusIX71荧光显微镜拍摄。斑马鱼全胚胎染色按照通用方法操作。染好的胚胎用1%低凝点琼脂糖包埋，使用配有63×NA1.2水镜的LeicaTCSSP5MP激光共聚焦显微镜拍照。

芯片实验

hTERT-RPE1细胞转染oligo72小时后，用TRIzolreagent（Invitrogen）裂解，样品送至博奥生物有限公司利用Affymetrix公司的HumanGenomeU133Plus2.0Array芯片检测基因表达谱。

双荧光报告实验（Dual-LuciferaseReporterAssay）

Sponge质粒、miRNAmimicRNA（20μM）、含有相应基因的3’UTR的fireflyluciferase报告质粒和Renillaluciferase质粒和的转染比例为4：2：1：0.1。HEK293T细胞转染24小时后使用Dual-LuciferaseReporterAssaySystem（Promega）测定fireflyluciferase强度，Renillaluciferase强度作为内参。

流式细胞术(Flowcytometry)

细胞在固定前用10μMEdU（Invitrogen）处理1h，胰酶消化，于1500rpm离心5min收集，用PBS洗涤两次，在冰上用70%的乙醇固定30min，并放置于-20°C保存。EdU染色使用Click-iTEdUimagingkit（Invitrogen），按照说明书操作，DNA使用7-AAD染色，最后使用Caliburfluorescence-activatedcellsorter（FACS,BectonDickinson）分析细胞周期。

反转录PCR（RT-PCR）和实时定量PCR（Real-timeQ-PCR）

细胞使用TRIzolreagent（Invitrogen）裂解，并按照说明书操作提取总RNA。每个样品取2μgRNA，使用SuperscriptIIIFirststrandsynthesissystemforRT-PCR试剂盒（Invitrogen，使用oligodT引物）反转录。实时定量PCR使用PowerSYBRGreenPCRmasterMix试剂盒（AppliedBiosystems），在AppliedBiosystems7500HTsequenceDetectionSystem上进行。反应体系为20μl，包含1μlRT-PCR产物、0.5μM引物和10μlPowerSYBRGreenPCRmastermix。反应条件为95°C-10min，（95°C-15sec，60°C-1min）×40。所有的反应重复3次，使用GAPDH作为内参。miR-129-3p的定量PCR使用Taqman探针（assayID001184，AppliedBiosystems），内参为U6snRNA（assayID001973）。

Westernblot免疫印迹

细胞转染72小时后，直接使用2×SDSloadingbuffer裂解，超声打散DNA，100°C煮5分钟，然后进行SDS-PAGE电泳。电泳后将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉或者BSA（溶于TBST）封闭1小时，随后与相应的一抗（稀释于1%BSA-TBST）在4°C孵育过夜。次日洗去多余的一抗，并与相应的二抗室温孵育1小时，先用TBST洗涤，再用水洗去TBST，使用ECL化学发光试剂盒（PerkinElmer）和X光胶片（Kodak）检测抗体信号。

斑马鱼显微注射

Morpholino寡核苷酸由GeneTools合成，MO1与成熟的dre-miR-129*（Accessionnumber：MIMAT0003158）序列互补，

MO1序列为：5’-ATGCTTTTTGGGGTAAGGGCTT-3’（SEQIDNO.:74）；MO2与前体dre-miR-129-2的loop及部分129*的序列互补，MO2序列为：5’-TAAGGGCTTCCCATTGATAGTTGAG-3’（SEQIDNO.:75）。

实验使用MorpholinoStandardControloligo作为对照。Morpholino溶解在无RNase的去离子水中（Ambion）。斑马鱼胚胎注射使用NarishigeIM300显微注射仪，注射至1-4细胞期胚胎的卵黄中，morpholino注射浓度为0.1-0.75mM，每个胚胎注射2-5nl（4-12ngmorpholino），同时注射液中加入0.02%酚红和10μg/ml的GFPmRNA示踪。

原位杂交

通过PCR扩增斑马鱼的cmlc2基因，接入pCDNA3.0载体，引物序列为：、

正向：5’-GGCTCTTCCAATGTCTTCTC-3’（SEQIDNO.:76）

反向：5’-TGCTGATGTGAATGTTGAACTG-3’（SEQIDNO.:77）

体外转录的RNA探针使用DIGRNAlabelingkit（Roche）标记上DIG。斑马鱼全胚胎原位杂交按照常规方法操作。杂交温度为65°C，DIG-UTP标记的cmlc2探针浓度为2μg/ml，Sheepanti-DIG-APFABfragments（Roche）稀释度为1：5000。胚胎用甘油包埋并用OlympusSZX16显微镜拍照。

斑马鱼miRNA的全胚胎原位杂交：杂交使用5’DIG标记的与成熟的miR-129-3p配对的LNA探针，对照为scrambledcontrol探针，于56°C杂交16小时。洗去多余探针后，胚胎与Sheepanti-DIG-APFABfragments于4°C孵育过夜，用NBT/BCIP于4°C显色过夜，胚胎用甘油包埋并用OlympusSZX16显微镜拍照。

小鼠组织切片miRNA原位杂交参照文献报道的方法(Penaetal.,2009)，仅做小的改动：探针终浓度为200nM，于56°C杂交16小时，Sheepanti-DIG-APFABfragments稀释度为1:1000，室温显色2-4h。

划伤实验及活细胞荧光显微术

将转染后的细胞消化分盘至玻璃皿底的35mm培养皿或者含盖玻片的培养皿中，培养至细胞完全长满，用200μl的枪头划伤单层细胞，更换成含血清的Leibovitz’sL15（GIBCO,Invitrogen）活体培养基进行活体观察，或者更换含血清的DMEM/F-12培养基培养2小时之后固定染色。用于固定染色的细胞于转染后72h划伤，用于活体拍摄的细胞于转染后60-65h划伤。活体拍摄使用配有20×/0.40LCPIanFI镜头、QImagingCCD和ImageProPlus成像系统的OlympusIX81宽场荧光/可见光显微镜，每8min拍摄一张，持续拍摄12h。

数据统计

本文统计数据为3次独立实验（各别指明的为2次独立实验）结果的平均值±S.D.，n值代表每个实验的事件总数，使用非配对t检验（unpairedStudent'st-test）或者Mann-Whitney检验（数据不符合正态分布时使用）来检测实验差别的显著性，*代表P<0.5，**代表P<0.01，***代表P<0.001。显著性检验和绘图使用Sigmaplot软件（SystatSoftware）。

实施例1miR-129-3p抑制CP110的表达

在本实施例中，利用软件TargetScan分析了人多种基因的3’UTR区，发现在CP110mRNA的3’UTR上有两个潜在的miR-129-3p作用位点，这两个位点在哺乳动物中是保守的（图1a）。

通过双荧光报告实验证明合成的miR-129-3p（SEQIDNO.:1，以下简称M129）可以显著抑制带有CP110的3’UTR的荧光素酶的表达；当把这两个位点突变之后荧光素酶的表达不再受到抑制；共表达含有6个miR-129-3p结合位点的sponge（SP-129）可以抵抗M129的抑制作用，对照sponge（SP-C）则没有作用，使用小鼠CP110的3’UTR也获得了同样的结果。

图1显示在哺乳动物CP110mRNA中miR-129-3p靶位点的保守性，其中，图1a显示利用TargetScan软件预测了CP110mRNA中miR-129-3p的靶位点，与miR-129-3p“seedsequence”互补的核苷酸用下划线标出，数字代表在3’UTR中的位点；图1b显示Luc-3’UTR报告实验的测试过程，如果3’UTR具有miR-129-3p的靶位点，则荧光素酶的合成下降；图1c显示miR-129-3p和control海绵（sponges）的设计，构建物表达GFP和6个拷贝的miR-129-3p-结合位点(SP-129)或control位点(SP-C)；SP-129的表达可以中和miR-129-3p；图1d显示miR-129-3p在人和鼠的CP110中具有靶点。上述结果表明CP110的这两个位点是miR-129-3p的直接作用位点（图1b、图1c、图1d）。

实施例2miR-129-3p促进纤毛发生

本实施例试图检验miR-129-3p是否与纤毛的发生相关。hTERT-RPE1细胞在血清饥饿过程中会逐渐长出纤毛，为抑制内源miR-129-3p的表达，发明人在细胞中过表达sponge（SP-129），于转染48h后再血清饥饿48h，通过免疫荧光染色发现SP-129转染阳性的细胞比对照SP-C转染阳性的细胞长纤毛的比例下降了约46.3%（图2b,图2c）。另一方面，过表达M129oligo可以显著抑制内源CP110的表达，同时诱导纤毛的自发发生，即在不血清饥饿的情况下使平均48.0±1.0%的细胞长出纤毛（图2a,图2d,图2e），而对照组的细胞该比例为8.2±1.6%。在IMCD3和ARPE19细胞中过表达M129也有相同的现象（图3）。

此外，CP110敲低会使自发生长纤毛的细胞比例增加2倍左右，为16.2±0.8%（图2e），对内源CP110的抑制效果好于M129，长纤毛的比例远低于M129过表达（图2a、图2e）。尽管在这种转染条件下M129是内源的8436倍，但是只过表达约78倍的M129仍能产生比CP110敲低更强的现象（图4）。另外，在血清饥饿的情况下，M129使纤毛的长度增加了1.8倍，而通过siRNA敲低CP110却没有增加纤毛长度（图2f、图2g），这表明除了CP110，miR-129-3p还有其它的靶基因。

图2显示通过CP110的靶向性作用，miR-129-3p可以刺激纤毛生成；其中，图2a显示过表达M129下调CP110；图2b和图2c显示，在RPE1细胞中，中和内源的miR-129-3p可以抑制纤毛发生；图2d和图2e显示，在RPE1细胞中过表达M129造成自发的纤毛发生；图2f和图2g显示，饥饿48小时的细胞，M129促进纤毛生长，**P<0.01;***P<0.001。

图3显示在IMCD3和ARPE19中，M129诱导自发的纤毛发生；其中，图3a和图3b显示，在ARPE19细胞中，M129或CP110i对CP110水平和自发性纤毛发生的影响；图3c和图3d显示在IMCD3细胞中，M129的纤毛发生效应，**P<0.01;***P<0.001。

图4显示了M129的剂量效应；其中，图4a显示转染了oligo的RPE1细胞在血清中培养72h，对纤毛发生水平进行评分，基于结果，使用M129终浓度为30nM作为常规转染的浓度；图4b显示，M129转染前后miR-129-3p的相对细胞水平，**P<0.01;***P<0.001。

实施例3miR-129-3p不引起细胞周期的阻滞

为了检验M129是否通过使细胞进入G0期来长出纤毛，发明人使用EdU（5-ethynyl-2’-deoxyuridine）掺入1h的方法来标记S期和G2早期的细胞。

通过染色，结果发现，M129对EdU阳性的比例没有影响，大约42.7%的EdU阳性的细胞长出了纤毛，而在对照组这一比例仅为约2.8%（图5a、图5b）。

通过2D-FACS检测，结果发现，转染M12924h或者48h后，与对照组相比细胞周期基本没有影响（图5c）。

而通过转染时间梯度实验（图5d）发现，M129转染后24h或者48h即有约25.9%和41.8%的细胞在不饥饿的情况下长出了纤毛，因此M129使增殖中的细胞长出了纤毛，直接调控了纤毛的发生，而不需要使细胞进入G0期。

实施例4miR-129-3p同时抑制CP110的表达和微丝的聚合

为了考察miR-129-3p除了抑制CP110的表达之外是否还调控了微丝的动态，发明人在转染M129、CP110siRNA及对照之后，再用0.5μM的CD处理90min，对照组只加等量的DMSO。结果发现，单独过表达M129或者CD处理都能非常有效的使纤毛自发生长，但是前者比后者长纤毛的比例平均高出约9.4%；同时过表达M129和CD处理并不能使这一比例增加，而CP110RNAi之后再用CD处理长纤毛的比例会增加约29.2%，和只过表达M129的结果相当（图6a,图6b）。同样地，在血清饥饿的情况下，CD处理不会增加过表达M129之后纤毛的长度，但是会增加CP110RNAi之后纤毛的长度，使之与只过表达M129的结果相当（图6c,图6d）。另一方面，我们在CD处理30-180m后通过免疫印迹发现CD处理并不影响CP110、Cep97和Kif24的蛋白水平（图6e）。因此过表达M129模拟了CP110RNAi和CD处理共同作用的结果。

接下来发明人试图检验过表达M129是否影响F-actin。免疫荧光染色显示，转染了对照的细胞F-actin沿细胞长轴呈现平行的、束状的应力纤维，而过表达M129的细胞F-actin则很紊乱，呈现很多斑点和聚集，应力纤维变得不明显（图7a）。为了更好地了解F-actin的变化，发明人进行伤口愈合实验，在单层细胞长满后划伤，细胞层呈现定向的迁移并把伤口愈合。划伤后2h，对照组细胞展示出典型的片状伪足结构，即富含分枝状的F-actin的细胞膜突起，F-actin在伤口方向呈现片状的染色（图7b，图7c），过表达M129的细胞含有应力纤维，但是没有形成片状伪足（图7b，图7c）。细胞的迁移也受到了明显的抑制，在12h的时间内迁移距离为57.8±15.3μm，而对照组这一数字为265.9±23.2μm（图7d，图7e）。M129选择性的抑制分枝状微丝的聚合过程，该过程是由Arp2/3复合物调控的。

为了解miR-129-3p是否促进并稳定了PPC结构，发明人用Rab11a作为marker，在M129转染48h后通过免疫荧光染色观察Rab11a的定位，发现约78.1%的细胞Rab11a在中心体/基体附近聚集，而转染了对照的细胞只有约21.8%的细胞出现这一现象（图8）。因此，M129在未血清饥饿的情况下促进了PPC结构的形成。

实施例5miR-129-3p的过表达引起多个纤毛相关的微丝调节因子下调

在本实施例中，发明人通过cDNA芯片比较转染了M129或对照72h的细胞的基因表达谱，从中选出杂交信号下调了至少20%的基因，并与TargetScan等软件预测的miR-129-3p可能的靶基因比对找出交集部分共99个基因，其中包括CP110。芯片结果上传至GeneExpressionOmnibus（GEO）数据库，检索号为GSE34846。使用MoleculeAnnotationSystemV3.0对这些基因做信号通路分析，按KEGG数据库中出现的pathway统计其关联的基因数，并对某一pathway中差异表达基因的数目与其它pathway是否不同进行显著性统计，给出相应的P值和Q值统计值。P值小于0.05的含义为此通路中差异表达基因的数目与其他通路显著不同，而Q值反映选择这个P值作为阈值进行筛选后得到的显著性通路的假阳性率。发现排在前2名的信号通路为轴突导向（Axonguidance）和微丝骨架调控（Regulationofactincytoskeleton）（表7），前者也与微丝骨架相关，即微丝相关基因是miR-129-3p的首要靶基因。

表7

接下来根据信号通路分析的结果对这些基因做相关性分析，这能反映基因之间可能存在的联系，分别统计在KEGG、BioCarta和GenMapp三个数据库中两个基因同时出现在一个通路上的次数，不同颜色的线代表不同的数据库。发现有多个与微丝调控相关的基因聚集在一起，即有更高的可能性在相同的通路下发挥功能（图9），这些基因为PARVA/Parvin、Ssh3、Pak2、Arpc5l、Actr2/Arp2、abLIM1、abLIM3、Capza1和WIPF1。另外，Toca1/Fnbp1l和Memo1并不在数据库中，但也与微丝调控相关，因此也被选了出来，包括CP110总共12个基因。

通过定量PCR检验发现，除了Wipf1外其他基因的mRNA在过表达M129后都有明显的下降（图9a），进一步克隆了这些基因的3’UTR，将其接在荧光素酶（Luciferase）基因的后面，通过双荧光报告系统实验检测发现，过表达M129后，除了Parvin，接了其他基因的3’UTR的荧光素酶活性都受到了不同程度的明显的抑制，即这些3’UTR受到了M129的调控（图9b）。接下来分别将这10个基因（包括CP110）敲低（抑制效率见图11），发现除了CP110，抑制另外4个基因也会导致21.6-53.9%不等的细胞在不饥饿的情况下发生纤毛的自发生长，它们是abLIM1、abLIM3、Arp2和Toca1（图9c，图9d）。图9显示miR-129-3p以多个纤毛发生过程中的关键蛋白作为靶点，其中，图9a显示将RPE1细胞转染72h，对潜在的miR-129-3p靶基因的qRT-PCR检测结果，图9b显示基因的3’UTR的荧光素酶活性检测结果，图9c和图9d显示RNAi对于纤毛自发生生的效应。

在血清饥饿的情况下，分别将这4个基因敲低，与对照组相比，均会使纤毛的长度平均增加1.5倍左右（图10a，图10b），Arp2与Arp3类似，是Arp2/3复合物的核心组份之一，Toca1则负责把Cdc42的激活信号传递给Arp2/3复合物，abLIM1和abLIM3是同源类似物，都是F-actin结合蛋白。与定量PCR的结果一致，在M129过表达的细胞中，这4个蛋白的表达水平被抑制了22.4-58.0%不等（图10c,图10d）。图10显示miR-129-3p以纤毛形成和控制纤毛长度的多个actin-相关基因作为靶位点，其中，图10a和图10b显示RNAi对纤毛生长的效应，图10c和图10d显示了M129对指示蛋白表达水平的效应，*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。

为了验证这4个基因是否是miR-129-3p的直接靶基因，将其3’UTR上相应的miR-129-3p结合位点由5’-AGGGCT-3’突变为5’-ACCCGT-3’，再进行双荧光报告系统实验。结果证明，SP-129能很好的减弱M129对野生型3’UTR的抑制作用，而突变后的3’UTR不受到M129的抑制（图12a，图12b）。因此，同CP110一样，这4个基因也是miR-129-3p的直接靶基因。图12显示miR-129-3p直接作用于基因abLIM1、abLIM3、Toca1和Arp2的3’UTRs，其中，图12a显示TargetScan预测的靶点，标出了与miR-129-3p互补的核苷酸序列，数字显示了其在3’UTRs的位点；图12b显示荧光素酶的相对活性，**P<0.01;***P<0.001。另外，尽管Parvin的mRNA水平明显下调，且Parvin对于纤毛的生长有重要作用，但是其蛋白水平或者连接了其3’UTR的荧光素酶活性并没有受到明显的抑制（图9b,图10c,图10d），因此它可能不是miR-129-3p的直接靶基因。

实施例6CP110和微丝对纤毛发生有叠加作用

在本实施例中，发明人试图了解miR-129-3p如何同时通过这几个基因发挥功能。首先构建了这5个基因的myc-tag的表达质粒，在过表达M129的同时分别表达这5个外源基因。免疫荧光染色结果显示myc-CP110定位在中心体上，myc-Arp2定位在细胞膜的边缘和胞质中，myc-Toca1定位在胞质中（图13b），myc-abLIM1、myc-abLIM3定位在应力纤维上，和abLIM2一样，除此之外它们在细胞前缘的伪足上也有定位（图15a）。统计结果发现，这5个外源基因分别表达均能不同程度的减弱（即回复作用）M129过表达导致的纤毛自发生长现象（图13c）。其中，myc-CP110的回复效果最强，这与CP110阻止纤毛生长的功能一致。当myc-CP110和myc-abLIM1或者myc-Arp2共同表达时回复效果更强，有一定的加和作用（图13d）。外源蛋白过量表达往往会导致一些现象，因此我们比较了回复实验中外源蛋白与相应的内源蛋白的相对剂量，发现我们并没有过量表达太多的外源蛋白（图13e），我们的回复实验是可靠的。另外，当CP110和Arp2、abLIM1二者之一同时敲低时对纤毛的发生也有加和作用（图14）。因此，CP110和这4个微丝相关基因对miR-129-3p导致的纤毛自发生长有截然不同的贡献，即是两个不同的途径。

实施例7敲低miR-129-3p的靶蛋白abLIM1或3抑制分枝状微丝的形成

已知Arp2与Arp3类似，是Arp2/3复合物的核心组份之一，参与分枝状F-actin的组装，Toca1则负责把Cdc42的激活信号传递给Arp2/3复合物；abLIM1和abLIM3是同源类似物，都是F-actin结合蛋白，但机制不详，因此有必要了解它们两个调节微丝的方式。

前面结果已经证明abLIM1和abLIM3除了定位在应力纤维上还在细胞前缘的片状伪足上有定位（图13,图15a），因此发明人在本实施例中也采用划伤伤口愈合实验，同过表达M129类似，abLIM1和abLIM3分别敲低均会破坏片状伪足的形成，延缓细胞的迁移（图15b-图15e）。因此，和Toca1、Arp2一样，abLIM1和abLIM3也参与了分枝状F-actin的聚合过程。

为进一步验证分枝状F-actin网络对纤毛的发生的抑制作用，发明人在细胞中过表达持续性激活形式的Rac1（Rac1CA），Rac1CA能够通过诱导分枝状微丝骨架的组装，诱导细胞形成片状伪足并导致细胞的铺展；然后再血清饥饿24h，检测长纤毛细胞的比例。与转染了GFP的对照相比，GFP-Rac1CA非常显著的抑制纤毛的发生（图16）。

这些结果表明，miR-129-3p同时通过下调CP110的表达和抑制分枝状F-actin的聚合两个过程发挥功能，促进纤毛的自发发生。

图15显示abLIM1和abLIM3对于片状伪足的形成和细胞迁移具有重要作用；其中，图15a显示abLIM1和abLIM3在RPE1细胞中定位于片状伪足和压力纤维中；图15b和图15c显示RNAi的效应，箭头指示片状伪足；图15d和图15e显示敲除abLIM1和abLIM3损害了细胞迁移。

图16显示Rac1CA抑制了纤毛形成；其中，图16a显示用GFP或GFP-Rac1CA转染细胞48h，然后血清饥饿24h，用乙酰-微管蛋白进行免疫染色，箭头指示纤毛或中心体；图16b显示纤毛细胞计数结果。

实施例8miR-129-3p通过下调其靶蛋白发挥生理功能

为了检测在血清饥饿后纤毛的发生过程中内源的miR-129-3p是否通过上述机制参与其中，发明人通过定量PCR和免疫印迹检测了血清饥饿48h过程中miR-129-3p及这5个蛋白的表达水平。

结果显示，miR-129-3p的表达在饥饿后12h内逐渐升高至1.6倍，然后缓慢下降（图17a）；CP110和abLIM3的表达持续下降；Toca1在12h降至最低（平均下降约65%，P<0.001）；abLIM1在12h降至最低（平均下降约35%，P<0.01）；Arp2在24h降至最低（平均下降约32%，P<0.05）（图17a,图17b）。这些蛋白的下调过程多能较好的匹配miR-129-3p的上调过程。

实施例9miR-129-3p在纤毛组织中高表达

为了解miR-129-3p在体内的功能，通过定量PCR检测了miR-129-3p在小鼠的不同组织中的相对表达水平，发现在脑、眼睛和睾丸中表达较高（图18），而这些组织均富含长纤毛的细胞。

进一步通过原位杂交检测miR-129-3p在小鼠组织中的表达定位（图19）。结果显示，miR-129-3p在肾脏小管(renaltubule)和收集管(collectingduct)（图19a），大脑的VZ(ventricularzone)、SVZ(sub-ventricularzone)、CP(corticalplate)和Striatum区（图19c），以及视网膜上皮的GCL(gangalioncelllayer)区、部分NBL(neuroblasticlayer)区（图19e）等区域有表达，而且miR-129-3p有表达的区域都存在长纤毛的细胞（图19b、图19d、图19f），这表明miR-129-3p在长纤毛细胞中高表达，参与体内纤毛的发生过程。

实施例10miR-129-3p的表达与多纤毛细胞的分化无关

纤毛根据数量可分为单纤毛（monocilia）和多纤毛（multicilia），为了解miR-129-3p是否在多纤毛发生过程中发挥功能，在本实施例中，发明人建立了体外培养小鼠气管上皮细胞（mousetrachealepithelialcells，MTECs）的系统，通过建立气-液接触面来诱导分化，使逐渐长出多根的动纤毛（图20a），通过定量PCR检测发现，mir-449a在分化过程中急剧上调，但是miR-129-3p的水平则没有显著的变化（图20b），即与多纤毛细胞的分化过程无关关。

因此，miR-129-3p不参与气管上皮多纤毛的发生过程。

实施例11斑马鱼miR-129-3p调控胚胎发育中纤毛的发生和功能

通过基因比对发现miR-129-3p在脊椎动物中完全保守（图21a），为更好地了解miR-129-3p的体内功能，选择斑马鱼作为研究对象。通过原位杂交发现，斑马鱼的同源物dre-miR-129*在Kupffer’svesicle（KV；2-somitestage）和原肾管（pronephricduct；48hpostfertilization，48hpf）这两个含纤毛的组织/器官中有明显的表达（图21b）。

斑马鱼胚胎或者幼鱼如果纤毛功能异常就会在形态上体现出身体弯曲（curvedbody）、心包水肿（pericardialoedema）和左右不对称异常（randomizedleft-rightpatterning）等现象(Kramer-Zuckeretal.,2005;WesselyandObara,2008)。通过注射morpholino抑制内源的dre-miR-129*来观察对斑马鱼发育的影响，选择了2条morpholino：129-MO与成熟的dre-miR-129*完全互补，129-MO2与pre-miR-129-2的环区（loop）及部分dre-miR-129*的序列互补。

注射后72hpf，129-MO和129-MO2均能不同程度的使斑马鱼发生身体弯曲和心包水肿现象，注射剂量越大现象越强，且129-MO的效果（4-8ng）强于129-MO2（4-12ng）（图22）。注射129-MO，约81.8%（4ng）-87.7%（8ng）的胚胎身体弯曲，约71.0%（4ng）-79.6%（8ng）心包水肿，而注射对照Ctrl-MO这两个比例均低于3%（图22a,图22b）。注射129-MO2，身体弯曲比例约为49.7%（4ng）、65.8%（8ng）和82.1%（12ng），心包水肿比例约为6.3%（4ng）、19.6%（8ng）和37.0%（12ng），相应的对照这两个比例分别约为15.0%和8.1%（图22c,图22d）。

在24-27hpf通过原位杂交标记cmlc2基因的表达可以展示心脏管腔的位置，正常情况下心脏位于身体的左侧。注射Ctrl-MO约94.2%（8ng）-96.9%（12ng）的胚胎心脏位于左侧，显示出身体左右不对称性正常（Fig.23）。而注射129-MO则有44.6%（4ng）-57.3%（8ng）的胚胎心脏位于身体右侧或者中间（图23a,图23b），注射129-MO2该比例为40%（12ng）（图23c,图23d），显示身体的左右不对称性被破坏了。

通过免疫荧光染色观察了注射129-MO后对KV纤毛的影响，与对照相比，KV纤毛的平均数目减少了50.5%（8ng），而剩下的纤毛其平均长度减少了37.3%（8ng）（图24a-图24c）。另外，原肾管纤毛的密度和长度也有明显的减少（图24d-图24f）。

接下来通过同时注射合成的M129oligo来弥补注射129-MO导致的缺陷。保持4ng129-MO的量不变，同时分别加入0.008pmol、0.016pmol和0.024pmol的M129，于72hpf观察胚胎形态，发现随着M129量的增加，正常胚胎的比例逐渐增加，身体弯曲的比例逐渐减少，且弯曲的幅度也在减小（图25）。cmlc2基因原位杂交实验结果也显示同时注射M129可以减弱129-MO所导致的身体左右不对称性异常现象（图26），这提示注射129-MO所导致的现象是通过抑制内源dre-miR-129*实现的。以上结果显示dre-miR-129*在斑马鱼纤毛发生和发挥功能过程中起重要作用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (8)

1.一种药物组合物在制备预防或治疗纤毛异常相关疾病的药物中的用途，其特征在于，所述的药物组合物包括药学上可接受的载体和有效量的选自下组的一种或多种活性成分：

(a)miR-129-3p，或经修饰的miR-129-3p衍生物，所述的miR-129-3p，或经修饰的miR-129-3p衍生物，具有特异的识别功能的核心元件，所述核心元件的核苷酸序列为：5’-AGCCCU-3’，

其中，(a)中所述经修饰的miR-129-3p衍生物具有式I所示的结构：

(X)_n－Y式I

式I中，

X为序列如SEQIDNO.:1所示的核苷酸序列；

Y为甾醇或多肽；

n为任选自1-50的正整数；

Y连接于X的左侧、或右侧；

(b)前体miRNA，所述的前体miRNA能在宿主内加工成miR-129-3p；

(c)多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主转录形成(b)中所述的前体miRNA，并加工形成miR-129-3p；

(d)表达载体，所述的表达载体含有(c)中所述的多核苷酸。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，n为任选自1-20的正整数。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的miR-129-3p的核苷酸序列如SEQIDNO.:1所示。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，(c)中所述的多核苷酸具有式II所示的结构：

Seq_正向-X-Seq_反向

式II

式II中，

Seq_正向为能在宿主中被加工成miR-129-3p的核苷酸序列；

Seq_反向为与Seq_正向互补的核苷酸序列；

X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补；

并且式II所示的结构在转入宿主细胞后，形成式III所示的二级结构：

式III中，||表示在Seq_正向和Seq_反向之间形成的碱基互补配对关系，Seq_正向、Seq_反向和X的定义如式II所述。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，(d)中所述的表达载体包括：质粒、或病毒载体。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，(b)中所述的前体miRNA的序列如SEQIDNO.:2所示。

7.一种活性成分的用途，其中，所述的活性成分选自下组的一种或多种：

(a)miR-129-3p，或经修饰的miR-129-3p衍生物，所述的miR-129-3p，或经修饰的miR-129-3p衍生物，具有特异的识别功能的核心元件，所述核心元件的核苷酸序列为：5’-AGCCCU-3’，

其中，(a)中所述经修饰的miRNA衍生物具有式I所示的结构：

(X)_n－Y式I

式I中，

X为序列如SEQIDNO.:1所示的核苷酸序列；

Y为甾醇或多肽；

n为任选自1-50的正整数；

Y连接于X的左侧、或右侧；

(b)前体miRNA，所述的前体miRNA能在宿主内加工成miR-129-3p；

(c)多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主转录形成(b)中所述的前体miRNA，并加工形成miR-129-3p；

(d)表达载体，所述的表达载体含有(c)中所述的多核苷酸；

其特征在于，所述活性成分用于制备预防或治疗纤毛异常相关疾病的药物。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，n为任选自1-20的正整数。