CN103374612A - 针对福氏志贺菌质粒携带基因lpt-O的检测试剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及针对福氏志贺菌质粒携带基因lpt-O的检测试剂及其应用，具体是涉及针对福氏志贺菌质粒携带基因lpt-O的检测试剂在用于制备福氏志贺菌血清型检测剂中的应用；所述的检测剂用于检测福氏志贺菌血清型，或者用于检测包含福氏志贺菌的鉴别诊断用样品。本发明还涉及福氏志贺菌MASF IV-1表型检测用制剂，其包括针对福氏志贺菌质粒携带基因lpt-O的引物对SEQ ID No.2与SEQ ID No.3，还涉及利用所述的引物对检测福氏志贺菌MASF IV-1表型的方法，以及区分福氏志贺菌Xv血清型与X血清型、区分4a与4av血清型以及区分Y与Yv血清型的方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术检测福氏志贺菌血清型的领域，具体涉及针对福氏志贺菌质粒携带基因lpt-O(LPS phosphoethenolamine transferase for O-antigen，O抗脂多糖磷酸乙醇胺转移酶)的检测试剂及其应用，特别涉及针对福氏志贺菌质粒携带基因lpt-O的检测用引物及其用于鉴定福氏志贺菌MASF IV-1表型。
背景技术
福氏志贺菌(Shigella flexneri)是发展中国家细菌性痢疾的主要病原菌，据估计每年导致大约100多万人感染，引起许多人死亡，其中大多数是5岁以下的儿童(Kotloff et al.，1999)。
充分的证据表明，人体对痢疾感染的免疫是血清型特异的(Phalipon et al.，1995)。根据菌体表面脂多糖(LPS)O抗原的差异，福氏志贺菌进一步分为许多血清型，目前，共有16个血清型已经确认(Simmons&Romanowska，1987；Stagg et al.，2009；Sun et al.，2011；Ye et al.，2010)。福氏志贺菌除6型(F6)外，其它血清型的O抗原都具有由四糖重复单位构成的多糖骨架：→3)-β-DGlcNac-(1→2)-α-L-Rha-(1→2)-α-L-Rha-(1→3)-α-L-Rha-(1→(Simmons&Romanowska，1987)。其中Y血清型具有基本的骨架，在骨架的不同糖基上添加糖基和/或乙酰基导致型(如I，II，III，IV，V，IC)和群(如3，4；6；7，8)特异抗原的出现(Stagg et al.，2009)。乙酰化修饰只发生在第三个鼠李糖基，导致群抗原6或型抗原决定因子在血清型3a、3b、1b和4b菌株中出现(Clark et al.，1991；Verma et al.，1991)。糖基化修饰可以发生在任何糖基上。负责型抗原I，IC，II，IV，V和群抗原7，8的基因已经确认(Adams et al.，2001；Adhikari et al.，1999；Guan et al.，1999；Mavris et al.，1997；Stagg et al.，2009)，它们以基因簇的形式存在：gtrA、gtrB和gtr(型)(Allison&Verma，2000)；其中gtrA和gtrB是高度保守的，在不同噬菌体间可以互换；而第三个基因gtr(型)是噬菌体特异的，编码糖基转移酶，负责催化在四糖骨架上添加葡萄糖基(Allison&Verma，2000；Stagg et al.，2009)。到目前为止，所有的O抗修饰基因被认为是由7种血清型转换噬菌体(SfI，SfIC，SfII，Sf6，SfIV，SfV，SfX)携带，他们的基因组整合到宿主菌基因组的保守位点(Allison et al.，2002；Casjens et al.，2004；Clark et al.，1991；Guan et al.，1999；Mavris et al.，1997)。
血清型是目前福氏志贺菌研究的主要内容，对于痢疾感染的治疗、预防、流行控制及疫苗研制等方面具有重要的意义。最近，几种新血清型被不断报道。其中某些已经成为优势血清型(Talukder et al.，2003)。2001年，在中国河南出现一种新的血清型Xv，在随后的几年内(2002-2006)，它取代2a成为河南省优势血清型，分别占分离福氏志贺菌的14％，35％，47％，48％，和27％(Ye et al.，2010)。Xv血清型也在山两出现，分别占67％(2006)和33％(2007)。在甘肃、安徽和上海2007年的分离率分别是67％、54％和35％(Ye et al.，2010)。
血清型Xv能够与单克隆抗体MASFIV-1和群7，8抗血清凝集(Ye et al.，2010)，因此他最初被称为4c或4x(Carlin&Lindberg，1987；Pryamukhina&Khomenko，1988)。相对于X血清型，Xv血清型菌株在他的LPS上含有MASF IV-1(或称为E1037)抗原位点，这种抗原位点也在福氏志贺的其它血清型(4a，Y和6)菌株中发现(Carlin，N.I.，andA.A.Lindberg.1987.Monoclonal antibodies specific for Shigella flexnerilipopolysaccharides：clones binding to type IV，V，and VI antigens，group 3，4antigen，and anepitope common to all Shigella flexneri and Shigella dysenteriae type 1 stains.Infect Immun55：1412-1420；Carlin，N.I.，M.Rahman，D.A.Sack，A.Zaman，B.Kay，and A.A.Lindberg.1989.Use of monoclonal antibodies to type Shigella flexneri in Bangladesh.J ClinMicrobiol 27：1163-1166)。目前，群抗原7，8的决定因子已经明确，它存在于SfX噬菌体基因组上，整合在宿主菌基因组中(Ye et al.，2010)。但是，MASF IV-1抗原决定因子目前还没有被发现。寻找福氏志贺菌血清型的分子标识，发展基于PCR等分子生物学技术的鉴定方法，对于及时、准确鉴定病原菌血清型具有重要意义。
发明内容
本发明的首要目的在于寻找福氏志贺菌MASF IV-1抗原决定因子或者区分血清型Xv与X的分子标识，发展分子生物学技术鉴定福氏志贺菌血清型的方法。
本发明的进一步目的在于提供针对福氏志贺菌质粒携带基因lpt-O的检测试剂在用于制备福氏志贺菌血清型检测剂中的应用。
本发明的其他目的在于提供福氏志贺菌MASF IV-1表型检测用制剂，检测福氏志贺菌MASF IV-1表型的方法，以及区分福氏志贺菌Xv血清型与X血清型的方法。
本案发明人经过研究发现，一个质粒携带的基因lpt-O(其在基因库中的登记号为SFxv_5135，具体序列见SEQ ID No.1)介导了在福氏志贺菌O抗上添加PEtN基团导致了MASF IV-1表型的出现，并经实验验证了lpt-O基因是鉴别福氏志贺菌Xv血清型和X血清型的一个分子标识，且lpt-O基因不但是Xv血清型MASF IV-1表型所必需的，也是其它MASF IV-1+表型菌株所必需的。
据此，本发明提供了一种区分福氏志贺菌血清型Xv与X的分子标识，或者检测福氏志贺菌MASF IV-1表型的分子标识：lpt-O基因。该lpt-O基因同时也可作为区分福氏志贺菌4av血清型与4a血清型、或者区分福氏志贺菌Yv血清型与Y血清型的分子标识。
在此基础上，一方面，本发明提供了针对福氏志贺菌质粒携带基因lpt-O的检测试剂在用于制备福氏志贺菌血清型检测剂中的应用；所述的检测剂用于检测福氏志贺菌血清型，或者用于检测包含福氏志贺菌的的鉴别诊断用样品。
根据本发明的具体实施方案，上述针对福氏志贺菌质粒携带基因lpt-O的检测试剂在用于制备福氏志贺菌血清型检测剂中的应用中，所述检测剂是用于检测福氏志贺菌MASF IV-1表型。如检测到所测样品中福氏志贺菌lpt-O基因的存在，则可表明福氏志贺菌MASF IV-1阳性。
根据本发明的优选具体实施方案，本发明中，所述针对福氏志贺菌质粒携带基因lpt-O的检测试剂是采用生物技术例如PCR方法检测待测样品中lpt-O基因存在与否的试剂。更具体地，其包括本发明为检测lpt-O基因而专门设计的以下特异性引物：
SEQ ID No.2：ATCTAGTATTGTTGGCGTTA；以及
SEQ ID No.3：CCTTTTCTTGTGTTCTTATC。
另一方面，本发明还提供了一种福氏志贺菌MASF IV-1表型检测用制剂，其主要基于本发明的发现——lpt-O基因介导了在福氏志贺菌O抗上添加PEtN基团而导致MASFIV-1表型出现而提供的，具体地，该福氏志贺菌MASF IV-1表型检测用制剂为针对福氏志贺菌质粒携带基因lpt-O的检测试剂。
根据本发明的具体实施方案，本发明的福氏志贺菌MASF IV-1表型检测用制剂，其包括本发明为检测lpt-O基因而专门设计的以下引物：SEQ ID No.2；以及SEQ ID No.3。
另一方面，本发明还提供了一种福氏志贺菌MASF IV-1表型检测用试剂盒，该试剂盒包含引物对SEQ ID No.2与SEQ ID No.3。
另一方面，本发明还提供了一种检测福氏志贺菌MASF IV-1表型的方法，该方法包括利用引物对SEQ ID No.2与SEQ ID No.3进行扩增。如扩增结果阳性，则表明所测样品中福氏志贺菌MASF IV-1+表型。
另一方面，本发明还提供了一种区分福氏志贺菌Xv血清型与X血清型的方法，该方法包括利用引物对SEQ ID No.2与SEQ ID No.3进行扩增。如扩增结果阳性，则表明所测福氏志贺菌Xv血清型而非X血清型。
另一方面，本发明还提供了一种区分福氏志贺菌4av血清型与4a血清型的方法，该方法包括利用引物对SEQ ID No.2与SEQ ID No.3进行扩增。如扩增结果阳性，则表明所测福氏志贺菌4av血清型而非4a血清型。
另一方面，本发明还提供了一种区分福氏志贺菌Yv血清型与Y血清型的方法，该方法包括利用引物对SEQ ID No.2与SEQ ID No.3进行扩增。如扩增结果阳性，则表明所测福氏志贺菌Yv血清型而非Y血清型。
根据本发明的具体实施方案，本发明的检测福氏志贺菌MASF IV-1表型的方法，或是区分福氏志贺菌Xv血清型与X血清型、区分福氏志贺菌4av血清型与4a血清型、或者区分福氏志贺菌Yv血清型与Y血清型的方法中，所述扩增是基于引物与模板的特异结合产生特异扩增产物的酶促核酸体外扩增检测技术；具体地，所述扩增可选自：聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应、链置换扩增、核酸单碱基取代、转录介导扩增。在本发明中，更优选PCR反应。在PCR中，PCR系统是由耐热DNA聚合酶、引物、脱氧核苷酸、待扩增的DNA模板和缓冲液组成。本发明在选择优选引物的基础上，还对反应体系和条件进行了优化。优选的PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火50s，72℃延伸2min，共30个循环；最后72℃延伸5min。
根据本发明的具体实施方案，本发明的检测福氏志贺菌MASF IV-1表型的方法，或是区分福氏志贺菌Xv血清型与X血清型、区分福氏志贺菌4av血清型与4a血清型、或者区分福氏志贺菌Yv血清型与Y血清型的方法，可进一步包括在所述扩增之后进行定性分析。定性分析方法可以是本领域普通技术人员已知的，例如包括利用凝胶电泳显示所述扩增产物，本领域技术人员可根据扩增产物的大小，确定所用的凝胶和浓度。
根据本发明的具体实施方案，本发明中所述检测剂(检测用制剂)优选用于对分离的福氏志贺菌菌株进行检测。具体地，所述的检测剂可以是试剂盒。所述检测剂可用于检测福氏志贺菌或包含福氏志贺菌的鉴别诊断用样品。本发明所设计的引物具有较高的特异性，可应用于离体病人样品(例如排泄物、肠积液、呕吐物等)、可能混有福氏志贺菌的水样、土壤、食品、化妆品等样品的检测，这些样品可以经过或不经过任何富集。
根据本发明的更具体实施方案，本发明的检测福氏志贺菌MASF IV-1表型的方法，或是区分福氏志贺菌Xv血清型与X血清型、区分福氏志贺菌4av血清型与4a血清型、或者区分福氏志贺菌Yv血清型与Y血清型的方法包括：
从待测样品中提取模板DNA；
以所提取DNA为模板，利用引物对SEQ ID No.2与SEQ ID No.3进行扩增；
对扩增结果进行定性分析。
利用本发明的方法，所述引物具有较高的特异性，鉴定时只需要菌株或样品的DNA作为模板，不需要分离单菌落，根据扩增结果，可快速检测待测样品中lpt-O基因存在与否，从而进一步鉴别福氏志贺菌血清型(主要是用于鉴别福氏志贺菌MASF IV-1表型，或是鉴别福氏志贺菌为Xv血清型或X血清型、或者鉴别福氏志贺菌为4av血清型或4a血清型、或者鉴别福氏志贺菌为Yv血清型或Y血清型)。而且本发明的结果判定简易、客观，避免了传统血清免疫凝集反应中的主观性、不稳定性等问题。
为验证本发明上述技术方案的可实施性，在本发明的一具体实施例(实施例1)中，证明了克隆的lpt-O基因能够转换X血清型福氏志贺菌菌株51580成为血清型Xv，而且转换菌株的LPS谱与福氏志贺菌Xv血清型菌株2002017完全相同，进一步证明了lpt-O基因负责PEtN残基的添加，也是MASF IV-1抗原的决定因子。在该实施例中，还对其他MASF IV-1阳性表型的临床分离株Yv和4av等进行质粒图谱分析和杂交实验证实，这些菌株都含有与福氏志贺菌Xv血清型菌株2002017相同的质粒和lpt-O基因，进一步表明lpt-O基因不但是Xv血清型MASF IV-1表型所必需的，也是其它MASFIV-1+表型菌株所必需的。在本发明的另一具体实施例(实施例2)中，用所设计的引物对SEQ ID No.2与SEQ ID No.3对10株Xv血清型和5株X血清型福氏志贺菌菌株进行了检测，经多次反复检测，结果均显示只有Xv血清型菌株中检测到扩增产物的存在，而在5株X血清型菌株中没有发现。在本发明的另一具体实施例(实施例3)中，对MASF IV-1阳性表型的临床分离株Yv和4av进行了扩增检测，扩增结果阳性。
为了进一步评价本发明所述引物PCR扩增特异性，本发明还在一具体实施例(实施例4)中检测了一些非福氏志贺菌菌株，包括痢疾志贺(血清型1-12)、鲍氏志贺(血清型1-18)、宋内志贺(S)、宋内志贺(R)、EHEC(EDL933)，大肠杆菌(HB101)、大肠杆菌K12(MG1655)、单增李斯特菌(54003)等，这些菌扩增均为阴性，证明本发明的方法的特异性。
综上所述，本发明发现了福氏志贺菌MASF IV-1抗原决定因子：lpt-O基因，在此基础上提供了针对福氏志贺菌质粒携带基因lpt-O的检测试剂在用于制备福氏志贺菌血清型检测剂中的应用，还提供了福氏志贺菌MASF IV-1表型检测用制剂、检测福氏志贺菌MASF IV-1表型的方法，本发明的技术对于及时、准确鉴定病原菌血清型具有重要意义。
附图说明
图1显示福氏志贺菌X(a)，Xv(b)和lpt-O基因转化株51580-Xv(c)的O抗结构的13C NMR图谱。数字显示糖基上的质子数G，Glc；GN，GlcNAc；RI，RhaI；RII，RhaII；RIII，RhaIII。
图2显示福氏志贺菌血清型X(A)，Xv(B)，Yv(C)和4av(D)的O抗结构。
图3显示PCR检测血清型Xv和X菌株中lpt-O基因的扩增结果。其中，泳道1：血清型Xv菌株2002017作为对照；泳道2-5、11-15：血清型Xv菌株；泳道6-10：血清型X菌株。
图4显示lpt-O基因介导的血清型转化。图片A，使用MASFIV-1单克隆抗体(Reagensia AB)和单价抗体IV(Denka Seiken)鉴定转化子的血清型。图片B，脂多糖(LPS)谱分析转化子；脂多糖在15％胶上进行TSDS-PAGE电泳，银染后判断结果；箭头指示不同血清型(Xv和X)LPS谱差异的位置。
图5显示质粒pSFxv_2的基因组结构及在Xv and X血清型菌株中的存在情况。图片A，质粒pSFxv_2的基因组结构，粗箭头显示ORFs，编码蛋白根据基因库中的基因组注释(accession No.CP001385)，特殊的lpt-O基因以红色标识，扩增用引物以细箭头显示。图片B，不同血清型中质粒谱；2002017的质粒(1道)作为阳性对照；HindIII酶切的Lambda DNA(TaKaRa，Japan)作为marker。图片C，lpt-O基因的Southern杂交检测，从2002017扩增得到的lpt-O基因作为探针；血清型Xv(1-5道)，血清型X菌株(6-10道)。
图6显示杂交分析lpt-O基因在4av和Yv血清型菌株中的分布结果，其中，泳道1：菌株2002017，泳道2：X血清型菌株；泳道3-5：4av菌株；泳道6-21为Yv菌株。
图7显示18株Yv，19株Xv，21株X和2株Y lpt-O基因PCR扩增结果。其中4株PCR扩增阳性的X分别为HN059，HN060，HN066和HN378。
图8显示不同血清型菌株的lpt-O基因PCR扩增结果。
图9显示PCR扩增特异性检测结果。第一排的2-14分别是鲍氏志贺菌血清型B1-B13；第二排的2-6分别是B14、B15、B16、B17、B18，7-14分别是痢疾志贺血清型D1-D8；第三排2-12分别是D9、D10、D11、D12、宋内志贺SS和SR型、大肠杆菌K12(MG1655)、嗜水气单胞菌、单增李斯特菌(54003)、大肠杆菌K12(HB101)、UPEC(CFT073)、EHEC(EDL933)。各排1道为阳性对照菌株2002017。
具体实施方式
为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照制造商所建议的条件。
菌株来源：
下列实施例中所用福氏志贺菌菌株中，菌株NCTC 9726(4b)，NCTC 9725(4a)，NCTC 8296(4av)，NCTC5(1b)，NCTC4(2b)，NCTC8521(4a)，NCTC7885(4a)，NCTC8522(4b)，NCTC8598(4b)，NCTC8336(4b)，NCTC8523(5a)，NCTC9728(5a)，NCTC8524(5a)购自英国标准菌株国家保藏中心(National Collection of TypeCultures，NCTC)。菌株51577(4b)，51580(Y)，51247(5a)购自中国生物制品药品检定所；
菌株2002017为2002年在中国河南分离，中国疾病预防控制中心传染病预防控制所微生物室收藏保存；
检测分析的福氏志贺菌为1997～2011年间在中国临床分离株，中国疾病预防控制中心传染病预防控制所微生物室保存；
用于特异性分析的菌株为商购标准菌株，中国疾病预防控制中心传染病预防控制所微生物室收藏保存；
主要试剂及材料：
Tag DNA聚合酶、PfuDNA聚合酶购自TaKaLa公司；
DNA回收纯化试剂盒为QIGEN公司产品；
染色体DNA提取试剂盒购自上海生工公司；
福氏志贺菌群抗原和型抗原单价抗血清购自日本生研公司；
福氏志贺菌群抗原和型抗原单克隆抗体购自瑞典Reagensia AB公司；
LPS提取试剂盒为LPS Extraction Kit(Intron，USA)；
质粒提取试剂盒为plasmid purification kit(Qiagen，Germany)；
核酸杂交和检测试剂盒为ECLTM Direct Nucleic Aicd Labelling and Detection System(Amersham)；
DNA分子量标准(DL2000)(100～2,000)为宝生物工程有限公司产品；
其它试剂均为分析纯。
实施例1、lpt-O基因特异性检测引物的设计
本实施例中，采用二维(two-dimensional)1H，1H和1H，13C NMR技术(Duus et al.，2000)，对Xv血清型菌株2002017的LPS结构进行了解析，它的1H NMR和13C NMR谱见图1中b，其具有典型的X血清型O抗结构(Kenne et al.，1977)(图2中B)，另外，在Xv菌株的NMR谱中发现一个PEtN基团的信号(表1)，该PEtN基团添加在RhaII(图2中B)，而且这是与X血清型(图2中A)的唯一区别。考虑到两者之间的血清型差异，可以判断PEtN修饰是MASF IV-1+表型出现的原因。
表1 1H and13C NMR化学位移s(δ，ppm)
本发明中，进一步通过基因组比较，在菌株2002017的一个质粒中(pSFxv_2，accession No.CP001385)，发现一个基因SFxv_5135与PEtN转移酶蛋白Lpt3(N.meningitides)，LptA(N.meningitides)，Lpt6(N.meningitides)，CptA(S.Typhimurium)，PmrC(S.Typhimurium)和EptB(E.coli)(Reynolds，C.M.，S.R.Kalb，R.J.Cotter，andC.R.Raetz.2005.A phosphoethanolamine transferase specific for the outer3-deoxy-D-manno-octulosonic acid residue of Escherichia coli lipopolysaccharide.Identification of the eptB gene and Ca2+hypersensitivity of an eptB deletion mutant.J BiolChem 280：21202-21211；Tamayo，R.，B.Choudhury，A.Septer，M.Merighi，R.Carlson，and J.S.Gunn.2005.Identification of cptA，a PmrA-regulated locus required forphosphoethanolamine modification of the Salnonella enterica serovar typhimuriumlipopolysaccharide core.J Bacteriol 187：3391-3399；Wenzel，C.Q.，F.St Michael，J.Stupak，J.Li，A.D.Cox，and J.C.Richards.2009.Functional characterization of Lpt3 and Lpt6，theinner-core lipooligosaccharide phosphoethanolamine transferases from Neisseria meningitidis.J Bacteriol 192：208-216)有一定的同源性(22-99％一致性，39-99％相似性)。此种蛋白负责在LPS或LOS上添加PEtN基团。而且SFxv_5135只是出现在Xv血清型测序菌株2002017基因组中，而在其它测序的MASFI V-1-福氏志贺菌sf301、2457t和8401中没有被发现，提示这个基因可能与Xv血清型菌株中的PEtN修饰有关。
本实施例中，还克隆了lpt-O基因的全序列(1521bp，参见SEQ ID No.1)和其上下游的533bp片段(上游252bp，下游281bp，包含可能的启动子和终止子序列)到pMD20T(TaKaRa，Japan)构建质粒pSQZ，转化到X血清型菌株51580中，其转化子51580-Xv血清型为Xv；其血清型特征与野生Xv血清型菌株2002017完全一致(图4中A)。LPS谱分析发现，转化子51580-Xv的LPS谱与2002017的完全相同(图4中B)。1H，1H和1H，13C NMR分析转化子51580-Xv发现，转化子具有与野生Xv血清型菌株2002017一样的谱(图1中c)。本实施例中进一步将pSQZ转化到4a血清型菌株NCTC9725中，转化子9725-4av能够与MASF IV-1发生凝集，血清型与现有技术中报道的4a血清型菌株G1668(在RhaII结合了PEtN基团，图2中D)完全一致(图4中A)(Perepelov，A.V.，L.L′Vov V，B.Liu，S.N.Senchenkova，M.E.Shekht，A.S.Shashkov，L.Feng，P.G.Aparin，L.Wang，and Y.A.Knirel.2009.A new ethanolamine phosphate-containing variantof the O-antigen of Shigella flexneri type 4a.Carbohydr Res 344：1588-1591)(关于现有技术中报道的4a血清型菌株G1668，为非典型性4a血清型菌株，其与其他典型性4a血清型菌株的差异在于能够与MASF IV-1发生凝集，本发明中将该菌株G1668的血清型鉴定为4av)。模块分析发现SFxv_5135基因编码蛋白的羧基端含有一个硫酯酶(sulfatase)功能域。而已知的具有PEtN转移酶活性的蛋白中(Lpt3，Lpt6，LptA，CptA，EptC，EptB，PmrC，Hp0022)(Cullen，T.W.，J.A.Madsen，P.L.Ivanov，J.S.Brodbelt，and M.S.Trent.2011.Characterization of unique modification of flagellar rod protein FlgG by Campylobacterjejuni lipid A phosphoethanolamine transferase，linking bacterial locomotion andantimicrobial peptide resistance.J Biol Chem 287：3326-3336；Kanipes，M.I.，S.Lin，R.J.Cotter，and C.R.Raetz.2001.Ca2+-induced phosphoethanolamine transfer to the outer3-deoxy-D-manno-octulosonic acid moiety of Escherichia coli lipopolysaccharide.A novelmembrane enzyme dependent upon phosphatidylethanolamine.J Biol Chem 276：1156-1163；Mackinnon，F.G.，A.D.Cox，J.S.Plested，C.M.Tang，K.Makepeace，P.A.Coull，J.C.Wright，R.Chalmers，D.W.Hood，J.C.Richards，and E.R.Moxon.2002.Identificationof a gene(lpt-3)required for the addition of phosphoethanolamine to the lipopolysaccharideinner core of Neisseria meningitidis and its role in mediating susceptibility to bactericidalkilling and opsonophagocytosis.Mol Microbiol 43：93l-943；Reynolds，C.M.，S.R.Kalb，R.J.Cotter，and C.R.Raetz.2005.A phosphoethanolamine transferase specific for the outer3-deoxy-D-manno-octulosonic acid residue of Escherichia coli lipopolysaccharide.Identification of the eptB gene and Ca2+hypersensitivity of an eptB deletion mutant.J BiolChem 280：21202-21211；Tamayo，R.，B.Choudhury，A.Septer，M.Merighi，R.Carlson，and J.S.Gunn.2005.Identification of cptA，a PmrA-regulated locus required forphosphoethanolamine modification of the Salnonella enterica serovar typhimuriumlipopolysaccharide core.J Bacteriol 187：3391-3399；Tran，A.X.，M.J.Karbarz，X.Wang，C.R.Raetz，S.C.McGrath，R.J.Cotter，and M.S.Trent.2004.Periplasmic cleavage andmodification of the 1-phosphate group of Helicobacter pylori lipid A.J Biol Chem279：55780-55791；Wenzel，C.Q.，F.St Michael，J.Stupak，J.Li，A.D.Cox，and J.C.Richards.2009.Functional characterization of Lpt3 and Lpt6，the inner-corelipooligosaccharide phosphoethanolamine transferases from Neisseria meningitidis.JBacteriol 192：208-216；Wright，J.C.，D.W.Hood，G.A.Randle，K.Makepeace，A.D.Cox，J.Li，R.Chalmers，J.C.Richards，and E.R.Moxon.2004.lpt6，a gene required foraddition of phosphoethanolamine to inner-core lipopolysaccharide of Neisseria meningitidisand Haemophilus influenzae.J Bacteriol 186：6970-6982)，均含有硫酯酶功能域，因此，SFxv_5135基因编码蛋白可能具有PEtN转移酶活性，因此，本发明中将其命名为lpt-O(LPS phosphoethenolamine transferase for O-antigen)。
质粒图谱分析发现，同标准菌株2002017一样，所有的Xv都含有一个特殊的pSFxv_2样的质粒(图5中A)，而杂交显示lpt-O基因都在这个质粒上(图5中B)。
以前的研究证实血清型4av菌株G1668在O抗的RhaIII位置含有一个PEtN基团(Perepelov，A.V.，L.L′Vov V，B.Liu，S.N.Senchenkova，M.E.Shekht，A.S.Shashkov，L.Feng，P.G.Aparin，L.Wang，and Y.A.Knirel.2009.A new ethanolaminephosphate-containing variant of the O-antigen of Shigella flexneri type 4a.Carbohydr Res344：1588-1591.)。本发明对一株Yv菌株(MASF IV-1+)O抗结构分析发现，在O抗的RhaIII位置同样含有一个PEtN基团(图2中C)。本发明还进一步对其他MASF IV-1+表型的临床分离株如Yv和4av等的质粒图谱和杂交分析发现，这些菌株都含有这样的质粒和基因(图6)，证实lpt-O基因不但是Xv血清型MASF IV-1表型所必需的，也是其它MASF IV-1+表型菌株所必需的。
针对lpt-O基因，本发明设计了特异性的检测用引物对lpt-O-2：
lpt-O-2U(SEQ ID No.2)：ATCTAGTATTGTTGGCGTTA(nt 1721-1740，complementary to pSFxv-2序列)
lpt-O-2L(SEQ ID No.3)：CCTTTTCTTGTGTTCTTATC(nt 2799-2818)。
实施例2、PCR扩增检测鉴别Xv与X血清型菌株
本实施例中，用所设计的引物对lpt-O-2检测了10株福氏志贺菌Xv血清型菌株和5株X血清型菌株。
PCR扩增：
引物对委托Sangon Biotech(Shanghai)合成。PCR扩增采用TaKaRa公司的PCR扩增试剂盒(KakaRa，Japan)。每个PCR反应混合物包含：1×PCR缓冲液，0.2μM of引物，3μl of模板DNA，2.5U DNA聚合酶和0.4mM dNTP，总量50μl。PCR扩增利用PCR仪SensoQuest LabCycler(Germany)进行，具体条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火50s，72℃延伸2min，共30个循环；最后72℃延伸5min。
扩增产物经电泳，结果参见图3，其中，泳道1：血清型Xv菌株2002017作为对照；泳道2-5、11-15：血清型Xv菌株；泳道6-10：血清型X菌株。结果显示，只有Xv菌株中检测到相应的扩增产物，而在5个X血清型菌株中没有发现。
实施例3、PCR扩增检测MASF IV-1表型
本实施例中，按照实施例2记载的扩增方法，对表2中所列333株包含15个血清型菌株进行PCR扩增检测，结果只在MASF IV-1阳性菌株(26Xv，1株4av和25株Yv)和4株X、1株4b中出现，经测序证实，在这4株X和1株4b中的lpt-O基因发生单个碱基缺失突变(表2)(图7，图8)。
表2lpt-O基因在福氏志贺菌中的携带情况
1+和-/+指示lpt-O基因存在情况.阳性菌株数显示在括号内。
24av血清型菌株(2002091和NCTC 8296)与4a血清型菌株差异在MASF IV-1凝集。
3Yv血清型菌株与Y血清型菌株的血清型差异在于MASF IV-1和单价抗血清IV凝集。
实施例4、特异性检测
为检测本发明所述引物PCR扩增特异性，本实施例中，分别提取菌株S.dysenteriae(1-18)、S.boydii(1-12)、S.Sonnie(S)、S.Sonnie(R)、EHEC(EDL933)，大肠杆菌K12(HB101)、大肠杆菌K12(MG1655)、UPEC(CFT073)、单增李斯特菌(54003)、嗜水气单胞菌(表3)的DNA模板，按照实施例2记载的方法，进行PCR扩增，结果参见图9，图中，第一排的2-14分别是鲍氏志贺菌血清型B1-B13；第二排的2-6分别是B14、B15、B16、B17、B18，7-14分别是痢疾志贺血清型D1-D8；第三排2-12分别是D9、D10、D11、D12、宋内志贺SS和SR型、大肠杆菌K12(MG1655)、嗜水气单胞菌、单增李斯特菌(54003)、大肠杆菌K12(HB101)、UPEC(CFT073)、EHEC(EDL933)；各排1道为阳性对照菌株2002017。从图中可以看出，表3中所列各菌株均没有扩增到阳性片段。
表3用于特异性分析的菌株及PCR扩增结果
| 菌株/血清型 | 菌株数 | 特异基因PCR反应结果 |
| S.Sonnie(S) | 1 | - |
| S.Sonnie(R) | 1 | - |
| S.dysenteriae(1-18) | 各1 | - |
| S.boydii(1-12) | 各1 | - |
| EHEC(EDL933) | 1 | - |
| UPEC(CFT073) | 1 | - |
| 大肠杆菌K12(HB101) | 1 | - |
| 大肠杆菌K12(MG1655) | 1 | - |
| 单增李斯特菌(54003) | 1 | - |
| 嗜水气单胞菌 | 1 | - |
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Claims (10)
1.针对福氏志贺菌质粒携带基因lpt-O的检测试剂在用于制备福氏志贺菌血清型检测剂中的应用；所述的检测剂用于检测福氏志贺菌血清型，或者用于检测包含福氏志贺菌的的鉴别诊断用样品。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述检测剂是用于检测福氏志贺菌MASF IV-1表型。
3.根据权利要求1所述的应用，其中，所述针对福氏志贺菌质粒携带基因lpt-O的检测试剂包括以下引物：
SEQ ID No.2；以及
SEQ ID No.3。
4.根据权利要求1所述的应用，所述的检测剂是用于对分离的福氏志贺菌菌株进行检测，或是对排泄物、肠积液、呕吐物、土壤、水样、食品或化妆品进行检测。
5.福氏志贺菌MASF IV-1表型检测用制剂，其包括针对福氏志贺菌质粒携带基因lpt-O的检测试剂。
6.根据权利要求5所述的福氏志贺菌MASF IV-1表型检测用制剂，其包括以下引物：
SEQ ID No.2；以及
SEQ ID No.3。
7.一种检测福氏志贺菌MASF IV-1表型的方法，该方法包括利用引物对SEQ ID No.2与SEQ ID No.3进行扩增；优选所述扩增为聚合酶链式反应。
8.一种区分福氏志贺菌Xv血清型与X血清型、区分福氏志贺菌4av血清型与4a血清型或者区分福氏志贺菌Yv血清型与Y血清型的方法，该方法包括利用引物对SEQID No.2与SEQ ID No.3进行扩增；优选所述扩增为聚合酶链式反应。
9.根据权利要求7或8所述的方法，该方法进一步包括在所述扩增之后进行定性分析；优选所述的定性分析包括用凝胶电泳显示所述扩增的产物。
10.一种福氏志贺菌MASF IV-1表型检测用试剂盒，该试剂盒包含引物对SEQ ID No.2与SEQ ID No.3。
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