CN103340281B - 生物转化马铃薯茎叶和向日葵饼粕制备饲料用复合酶兼益生菌制剂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生物转化马铃薯茎叶和向日葵饼粕制备饲料用复合酶兼益生菌制剂的方法，包括：将经渥堆发酵的普洱熟茶、香菇菌棒、茶树菇菌棒、第一马铃薯茎叶、第一向日葵饼粕、第一麦麸、第一苹果渣和第一水充分混合，经驯化培养后形成发酵剂；将发酵剂、第二马铃薯茎叶、第二向日葵饼粕、第二麦麸、第二苹果渣和第二水充分混合，经发酵后，得到饲料用复合酶兼益生菌制剂。本发明中，利用微生态稳定的食品级安全菌群来发酵马铃薯茎叶和向日葵饼粕制备各项性能指标较好的饲料用复合酶兼益生菌制剂，实现马铃薯茎叶和向日葵饼粕的低成本高效生物转化。同时，本发明方法，微生物易生长，酶活力高，发酵过程粗放，易于工业化大规模生产。

Description

生物转化马铃薯茎叶和向日葵饼粕制备饲料用复合酶兼益生菌制剂的方法

技术领域

本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种采用微生态稳定的食品级安全菌群发酵马铃薯茎叶和向日葵饼粕，制备饲料用复合酶兼益生菌制剂的方法。

背景技术

我国是一个耕地极度紧张的人口大国，饲料原料特别是能量饲料和蛋白饲料的需求均存在巨大缺口。

木质纤维素是地球上最丰富、最廉价的可再生资源。农产品与食品的生产加工过程也产生大量木质纤维素类副产物。木质纤维素种类繁多，例如各种农作物秸秆、城市纤维质垃圾、农产品加工副产物如玉米芯、蔬菜茎叶、果蔬渣等，木质纤维素的成分主要包括纤维素、半纤维素、木质素和果胶等，因其大宗廉价而成为自然界中具有重大应用价值的复杂底物，但由于木质纤维素的组成与结构复杂，因而难以被单胃动物消化。实现木质纤维素等非粮物质高效低成本生物转化，使其替代玉米等谷物作为能量饲料，将是饲料产业发展的重要增长点。

饼粕是一类富含蛋白质的大宗农业副产物。随着养殖产业的快速发展，对蛋白资源需求量也越来越大，而且动物性优质蛋白资源（如鱼粉）来源有限，价格近年来一直在快速上涨，因此，以饼粕为蛋白饲料，将大大缓解饲料蛋白资源紧张局面，且能够降低饲料成本。饼粕种类繁多，包括大豆饼粕、棉籽（仁）饼粕、油菜籽饼粕、花生（仁）饼粕、向日葵（仁）饼粕、茶籽饼粕、芝麻饼粕等，但饼粕中含有非常多样的毒性物质和抗营养物质。例如硫苷在有水情况下经芥子酶分解出异硫氰酸酯和腈等有毒物质，使动物甲状腺肿大，新陈代谢紊乱，甚至造成皮下出血，还影响肾上腺皮质、脑垂体和肝等器官的功能。抗营养物质alpha-半乳糖苷化合物则使动物肠道胀气从而影响消化功能。而且饼粕在富含蛋白质的同时也含相当高的植物纤维成分，单胃动物消化不易。如果能够高效低成本地消除饼粕中的毒性和抗营养物质并进行生物转化，则各类饼粕将被充分地开发为蛋白饲料原料并替代鱼粉等高价动物性饲料蛋白，成为未来饲料产业发展的又一个重要增长点。

微生物发酵是实现木质纤维素和饼粕类农业副产物低成本高效生物转化的有效途径。木质纤维素基本上是碳水化合物，饼粕富含蛋白质，两者组合可为微生物提供营养丰富、比例恰当的发酵基质，而系统生物学理论则为通过微生物发酵实现木质纤维素和饼粕的低成本高效生物转化提供了新策略。根据系统生物学理论，微生物群落与其酶系以及其所处底物环境是一个不可分割的完整系统，其形成是长期自然进化和平衡的结果。在此系统中，不同微生物所产酶的种类和活力各有不同，只有共存于同一系统中并且共享系统所提供的环境因素，才能有效转化底物。在自然界中普遍存在由诸多种属不同微生物构成的微生态稳定平衡的野生微生物群落，例如瘤胃微生物群落、沼气微生物群落、堆肥微生物群落、饲料青贮微生物群落、高等动物肠道微生物群落、植物内生菌群落、白腐真菌群落、食木性昆虫肠道内生菌群落等。这些野生微生物群落在其所处特定野生环境中可进行稳定混合发酵，并且由于其所产酶系的多样性，可以对复杂底物进行生物转化。因此，根据系统生物学理论，通过在天然菌群的基础上，构建一个产酶与发酵能力强大而又适合木质纤维素和饼粕基质环境的微生态稳定菌群，可望实现木质纤维素和饼粕类的低成本高效生物转化。

普洱茶是一种发酵茶，其在渥堆发酵过程中形成了菌相复杂但微生态稳定的菌群，即普洱茶渥堆菌群，该菌群包括曲霉属(Aspergiltus)、根霉属(Rhizopus)、青霉属(Penicillium)、木霉属(Trichoderma)、近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)、无名假丝酵母(C.famata)、西弗假丝酵母(C.cifferrii)、克鲁费酵母(Saccharomyces kluyoerii)、罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)、担子菌（Basidiomycetes）、乳杆菌属(Lactobacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、短杆菌属(Brevibaterium)、球菌属(Staphylococcus)、线菌属(Actinoplanes)、链霉菌属(Streptomyces)等，其中包括丝状真菌、酵母和细菌，既有产酶微生物又有益生菌，具备了丰富而强大的产酶能力、发酵转化能力和益生功效，可望应用于木质纤维素和饼粕类农业副产物的生物转化。

食用菌是一大类以木质纤维素为基质进行生长繁殖的食品级安全大型真菌，重要食用菌种类包括平菇(Pleurotus ostreatus)、扇形侧耳(Pieurotusflabellatus)、肺形侧耳(Pleurotus pulmonarius)、凤尾菇(Pleurotus sajor-caju)、香菇(Lentinus edobes)、虎皮香菇(Lentinus tiginus)、金针菇(Flamulinavelutipes)、灵芝(Gannodema lucidum)、裂褶菌(Schizophyllum commune)、脉射菌(Phlebia radiata)、云芝(Coriolus versicolor)、榆黄蘑(Plearotuscitrinopileatus)、姬菇(Plearotus cornucopiae)、杏鲍菇(Pleurotus eryngii)、木耳(Auricularia auricular)、羊肚菌(Morchella esculenta)、茶树菇(Agrocybecylindracea)、黄伞(Pholiota adipose)、双孢蘑菇(Agaricus bisporus)、斑玉蕈(Hypsizigus marmoreus)、猴头菌(Hercicium erinaceum)、姬松茸(Agaricusblazei)、滑菇(Pholiota nameko)等。由于食用菌在生长繁殖过程中向基质中分泌大量木质纤维素酶类，故其基质对农业副产物特别是木质纤维素类农业副产物具有很强的生物转化能力。

发明内容

本发明提供了一种生物转化马铃薯茎叶和向日葵饼粕制备饲料用复合酶兼益生菌制剂的方法，采用微生态稳定的食品级安全菌群来发酵马铃薯茎叶和向日葵饼粕制备饲料用复合酶兼益生菌制剂，实现马铃薯茎叶和向日葵饼粕的低成本高效生物转化。

一种生物转化马铃薯茎叶和向日葵饼粕制备饲料用复合酶兼益生菌制剂的方法，包括以下步骤：

1）将经渥堆发酵的普洱熟茶、香菇菌棒、茶树菇菌棒、第一马铃薯茎叶、第一向日葵饼粕、第一麦麸、第一苹果渣和第一水充分混合，经驯化培养后形成发酵剂；

2）将步骤1）中的发酵剂、第二马铃薯茎叶、第二向日葵饼粕、第二麦麸、第二苹果渣和第二水充分混合，经发酵后，得到饲料用复合酶兼益生菌制剂。

普洱茶是一种历史悠久、公认安全的饮品，经渥堆发酵的普洱熟茶内形成的普洱茶渥堆菌群是食品级安全菌群，香菇和茶树菇是日常食用的食品级安全大型真菌，其菌棒中含有丰富的木质纤维素酶类。马铃薯茎叶和向日葵饼粕是两种大宗农业副产物。将经渥堆发酵的普洱熟茶、香菇菌棒、茶树菇菌棒与第一马铃薯茎叶、第一向日葵饼粕、第一麦麸、第一苹果渣和第一水等基质混合后，通过驯化培养，使普洱茶渥堆菌群与基质中的天然菌群融合形成微生态稳定的食品级安全菌群，该菌群既拥有普洱茶渥堆菌群的丰富而强大的产酶能力、发酵转化能力和益生功效，又适应基质环境，同时，基质环境中含有丰富的来源于香菇菌棒和茶树菇菌棒的木质纤维素酶类，可对马铃薯茎叶（即第一马铃薯茎叶和第二马铃薯茎叶）和向日葵饼粕（即第一向日葵饼粕和第二向日葵饼粕）进行低成本高效生物转化。因此，得到的发酵剂性能较好。

用发酵剂内微生态稳定的食品级安全菌群对马铃薯茎叶和向日葵饼粕进行发酵，将马铃薯茎叶和向日葵饼粕转化为饲料用复合酶兼益生菌制剂，得到的饲料用复合酶兼益生菌制剂的各项性能指标较好。

在发酵剂制备与发酵过程中，马铃薯茎叶作为主要碳源，向日葵饼粕作为主要氮源，构成了发酵基质中的基本成分。麦麸（即第一麦麸和第二麦麸）富含维生素和矿质元素，苹果渣（即第一苹果渣和第二苹果渣）富含维生素和微生物可快速利用的可发酵性糖，添加麦麸和苹果渣可为微生物发酵过程提供充分的生长因子（如有关酶的辅助因子）和快速利用碳源。

步骤1）中，作为优选，所述的经渥堆发酵的普洱熟茶、香菇菌棒、茶树菇菌棒、第一马铃薯茎叶、第一向日葵饼粕、第一麦麸、第一苹果渣和第一水的质量比为10：1～10：1～10：5～15：2～8：1～4：0.5～2：10～30，在上述质量比的原料下，有利于普洱茶渥堆菌群与天然菌群融合形成微生态稳定的食品级安全菌群，得到发酵性能更好的发酵剂。进一步优选，所述的经渥堆发酵的普洱熟茶、香菇菌棒、茶树菇菌棒、第一马铃薯茎叶、第一向日葵饼粕、第一麦麸、第一苹果渣和第一水的质量比为10：5：5：10：5：2：1：22～25，该质量比的原料下制成的发酵剂，其发酵性能最优异。

作为优选，所述的驯化培养的条件为在30℃～45℃驯化培养24～60小时，该驯化培养的条件有利于普洱茶渥堆菌群与基质中的天然菌群融合形成微生态稳定的食品级安全菌群，制备发酵性能更好的发酵剂。进一步优选，所述的驯化培养的条件为在35℃～40℃驯化培养36～48小时，该驯化培养的条件能够制备发酵性能最优异的发酵剂。

步骤2）中，作为优选，所述的发酵剂、第二马铃薯茎叶、第二向日葵饼粕、第二麦麸、第二苹果渣和第二水的质量比为10：100～800：50～500：10～100：5～60：100～1500，上述质量比的原料下，经发酵后，有利于得到各项性能指标更好的饲料用复合酶兼益生菌制剂。进一步优选，所述的发酵剂、第二马铃薯茎叶、第二向日葵饼粕、第二麦麸、第二苹果渣和第二水的质量比为10：300～600：150～300：30～60：15～30：400～1000，有利于得到各项性能指标最好的饲料用复合酶兼益生菌制剂。

作为优选，所述的发酵采用固态发酵，微生物易生长，酶活力高，并且制备简单，有利于工业化推广利用。更进一步优选，所述的固态发酵的条件为：料厚度为5cm～20cm，自然通风，在30℃～45℃发酵2～7天。该固态发酵条件有利于得到各项性能指标更为优异的饲料用复合酶兼益生菌制剂。进一步优选，所述的固态发酵的条件为：固态发酵的料厚度为10cm～15cm，自然通风，在35℃～40℃发酵4～5天，该固态发酵条件有利于得到各项性能指标最优异的饲料用复合酶兼益生菌制剂。

饲料中的营养成分按照化学组成划分主要是碳水化合物（如淀粉、纤维素、半纤维素、果胶质）、蛋白质、杂环类及非典型糖等化合物（如木质素、alpha-糖苷类、植酸、单宁等）。在饲料中添加对这些化合物进行预消化或转化的酶，对于提高畜禽生产性能具有显著效应。目前，纤维素酶、半纤维素酶如木聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶、alpha-半乳糖苷酶、植酸酶等都作为饲料用酶制剂在饲料生产中广泛使用，并且在使用中通常组合多种酶成为复合酶制剂进行添加。复合酶制剂中所包含的酶种越多，对饲料进行预消化或转化的效力越高。本发明采用的菌群为普洱茶渥堆菌群与发酵基质中的天然菌群融合形成的微生态稳定的食品级安全菌群，微生物种类丰富，能够发酵生产出种类非常丰富的饲料用复合酶，对其功效的评价通过对各有关酶活力的测定进行。

益生菌通过调理肠道功能对提升动物健康水平具有显著功效。乳酸菌是最主要的益生菌。本发明采用的菌群中，最主要的来源是普洱茶渥堆菌群，其中含有大量乳酸菌，这些乳酸菌经过固态发酵大量增殖，成为益生菌制剂，对其功效的评价通过对乳酸菌数量的测定进行。

通过各有关酶活力的测定结果和乳酸菌数量的测定结果，可知，本发明制备的产物非常适合作为饲料用复合酶兼益生菌制剂。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明中，生物转化马铃薯茎叶和向日葵饼粕制备饲料用复合酶兼益生菌制剂的方法，将经渥堆发酵的普洱熟茶、香菇菌棒、茶树菇菌棒与第一马铃薯茎叶、第一向日葵饼粕、第一麦麸、第一苹果渣和第一水等基质混合后，通过驯化培养，使经渥堆发酵的普洱熟茶中的普洱茶渥堆菌群与基质中的天然菌群融合形成微生态稳定的食品级安全菌群，该微生态稳定的食品级安全菌群既拥有普洱茶渥堆菌群的丰富而强大的产酶能力、发酵转化能力和益生功效，又适应基质环境，同时，基质环境中含有丰富的来源于香菇菌棒和茶树菇菌棒的木质纤维素酶类，可对马铃薯茎叶和向日葵饼粕进行低成本高效生物转化。用发酵剂内微生态稳定的食品级安全菌群对马铃薯茎叶和向日葵饼粕进行发酵，将马铃薯茎叶和向日葵饼粕转化为饲料用复合酶兼益生菌制剂，得到的饲料用复合酶兼益生菌制剂的各项性能指标较好。

本发明中，生物转化马铃薯茎叶和向日葵饼粕制备饲料用复合酶兼益生菌制剂的方法，在发酵剂内微生态稳定的食品级安全菌群作用下，发酵可采用固态发酵，微生物易生长，酶活力高，发酵过程粗放，不需严格无菌条件，后处理简便，无废水排放，设备构造简单、投资少、能耗低、易操作，易于工业化大规模生产，具有良好的经济效益和广阔的应用前景。

具体实施方式

实施例中的香菇菌棒和茶树菇菌棒均采用浙江天泉莫干山菇业有限公司生产的市售产品，马铃薯茎叶从种植地自行采集，向日葵饼粕采用石家庄亨通饲料有限公司生产的市售产品，麦麸采用大丰市金麦缘麦仁厂生产的市售产品，苹果渣采用万荣县双荣生态农牧有限公司生产的市售产品。

实施例1

1）将10kg经渥堆发酵的普洱熟茶、5kg香菇菌棒、5kg茶树菇菌棒与10kg马铃薯茎叶、5kg向日葵饼粕、2kg麦麸、1kg苹果渣、22kg水充分混合，在35℃驯化培养48小时后，形成发酵剂；

2）将步骤1）中的发酵剂20kg与600kg马铃薯茎叶、300kg向日葵饼粕、60kg麦麸、30kg苹果渣、800kg水充分混合，采用固态发酵，料厚度为15cm，自然通风，在40℃发酵4天，得到饲料用复合酶兼益生菌制剂。

经测定，本实施例的饲料用复合酶兼益生菌制剂的性能指标为：羧甲基纤维素酶活力达到33.89IU/g；总纤维素酶活力达到4.77IU/g；beta-葡萄糖苷酶活力达到10.29IU/g；葡聚糖内切酶活力达到33.88IU/g；木聚糖酶活力达到41.68IU/g；beta-木糖苷酶活力达到3.76IU/g；聚半乳糖醛酸酶活力达到76.29IU/g；果胶酸酯裂解酶活力达到65.36IU/g；漆酶活力达到68.87IU/g；甘露聚糖酶活力达到33.82IU/g；alpha-半乳糖苷酶活力达到11.55IU/g；alpha淀粉酶活力达到144.36IU/g；蛋白酶活力达到125477IU/g；植酸酶活力达到111.26IU/g；单宁酶活力达到1435IU/g；乳酸菌密度达到3.86×10⁸CFU/g。

实施例2

1）将10kg经渥堆发酵的普洱熟茶、5kg香菇菌棒、5kg茶树菇菌棒与10kg马铃薯茎叶、5kg向日葵饼粕、2kg麦麸、1kg苹果渣、25kg水充分混合，在35℃驯化培养48小时后，形成发酵剂；

2）将步骤1）中的发酵剂20kg与600kg马铃薯茎叶、300kg向日葵饼粕、60kg麦麸、30kg苹果渣、800kg水充分混合，采用固态发酵，料厚度为15cm，自然通风，在40℃发酵4天，得到饲料用复合酶兼益生菌制剂。

经测定，本实施例的饲料用复合酶兼益生菌制剂的性能指标为：羧甲基纤维素酶活力达到33.63IU/g；总纤维素酶活力达到4.68IU/g；beta-葡萄糖苷酶活力达到10.15IU/g；葡聚糖内切酶活力达到33.67IU/g；木聚糖酶活力达到41.58IU/g；beta-木糖苷酶活力达到3.69IU/g；聚半乳糖醛酸酶活力达到75.43IU/g；果胶酸酯裂解酶活力达到65.34IU/g；漆酶活力达到67.98IU/g；甘露聚糖酶活力达到33.47IU/g；alpha-半乳糖苷酶活力达到11.53IU/g；alpha淀粉酶活力达到142.14IU/g；蛋白酶活力达到125376IU/g；植酸酶活力达到109.78IU/g；单宁酶活力达到1438IU/g；乳酸菌密度达到3.85×10⁸CFU/g。

实施例3

1）将10kg经渥堆发酵的普洱熟茶、5kg香菇菌棒、5kg茶树菇菌棒与10kg马铃薯茎叶、5kg向日葵饼粕、2kg麦麸、1kg苹果渣、25kg水充分混合，在40℃驯化培养36小时后，形成发酵剂；

2）将步骤1）中的发酵剂10kg与600kg马铃薯茎叶、300kg向日葵饼粕、60kg麦麸、30kg苹果渣、1000kg水充分混合，采用固态发酵，料厚度为10cm，自然通风，35℃发酵5天，得到饲料用复合酶兼益生菌制剂。

经测定，本实施例的饲料用复合酶兼益生菌制剂的性能指标为：羧甲基纤维素酶活力达到32.65IU/g；总纤维素酶活力达到5.05IU/g；beta-葡萄糖苷酶活力达到11.32IU/g；葡聚糖内切酶活力达到32.56IU/g；木聚糖酶活力达到42.56IU/g；beta-木糖苷酶活力达到3.69IU/g；聚半乳糖醛酸酶活力达到75.46IU/g；果胶酸酯裂解酶活力达到62.32IU/g；漆酶活力达到66.57IU/g；甘露聚糖酶活力达到34.15IU/g；alpha-半乳糖苷酶活力达到10.90IU/g；alpha淀粉酶活力达到139.08IU/g；蛋白酶活力达到130087IU/g；植酸酶活力达到121.31IU/g；单宁酶活力达到1389IU/g；乳酸菌密度达到3.86×10⁸CFU/g。

实施例4

1）将10kg经渥堆发酵的普洱熟茶、1kg香菇菌棒、1kg茶树菇菌棒与5kg马铃薯茎叶、2kg向日葵饼粕、1kg麦麸、0.5kg苹果渣、10kg水充分混合，在45℃驯化培养24小时后，形成发酵剂；

2）将步骤1）中的发酵剂20kg与200kg马铃薯茎叶、100kg向日葵饼粕、20kg麦麸、10kg苹果渣、200kg水充分混合，采用固态发酵，料厚度为5cm，自然通风，在45℃发酵2天，得到饲料用复合酶兼益生菌制剂。

经测定，本实施例的饲料用复合酶兼益生菌制剂的性能指标为：羧甲基纤维素酶活力达到29.56IU/g；总纤维素酶活力达到4.58IU/g；beta-葡萄糖苷酶活力达到10.48IU/g；葡聚糖内切酶活力达到29.68IU/g；木聚糖酶活力达到38.45IU/g；beta-木糖苷酶活力达到3.34IU/g；聚半乳糖醛酸酶活力达到69.78IU/g；果胶酸酯裂解酶活力达到56.72IU/g；漆酶活力达到61.38IU/g；甘露聚糖酶活力达到33.07IU/g；alpha-半乳糖苷酶活力达到10.12IU/g；alpha淀粉酶活力达到127.46IU/g；蛋白酶活力达到121068IU/g；植酸酶活力达到110.86IU/g；单宁酶活力达到1376IU/g；乳酸菌密度达到3.57×10⁸CFU/g。

实施例5

1）将10kg经渥堆发酵的普洱熟茶、10kg香菇菌棒、10kg茶树菇菌棒与15kg马铃薯茎叶、8kg向日葵饼粕、4kg麦麸、2kg苹果渣、30kg水充分混合，在30℃驯化培养60小时后，形成发酵剂；

2）将步骤1）中的发酵剂10kg与800kg马铃薯茎叶、500kg向日葵饼粕、100kg麦麸、60kg苹果渣、1500kg水充分混合，采用固态发酵，料厚度为20cm，自然通风，30℃发酵7天，得到饲料用复合酶兼益生菌制剂。

经测定，本实施例的饲料用复合酶兼益生菌制剂的性能指标为：羧甲基纤维素酶活力达到29.32IU/g；总纤维素酶活力达到4.62IU/g；beta-葡萄糖苷酶活力达到10.21IU/g；葡聚糖内切酶活力达到29.41IU/g；木聚糖酶活力达到38.76IU/g；beta-木糖苷酶活力达到3.43IU/g；聚半乳糖醛酸酶活力达到69.35IU/g；果胶酸酯裂解酶活力达到56.68IU/g；漆酶活力达到61.24IU/g；甘露聚糖酶活力达到33.19IU/g；alpha-半乳糖苷酶活力达到10.29IU/g；alpha淀粉酶活力达到127.35IU/g；蛋白酶活力达到121026IU/g；植酸酶活力达到110.65IU/g；单宁酶活力达到1384IU/g；乳酸菌密度达到3.58×10⁸CFU/g。

各种酶活力及乳酸菌密度测定方法如下：

一、羧甲基纤维素酶、总纤维素酶和beta-葡萄糖苷酶的酶活力的测定

总纤维素酶（即滤纸纤维素酶（FPase）、羧甲基纤维素酶（CMCase）、beta葡萄糖苷酶活力的测定按照国际纯化学与应用化学联合会（InternationalUnion of Pure and Applied Chemistry）的规定程序进行（详见“Ghose TK,1987.Measurements of cellulase activities.Pure Appl Chem,59,257-268.”）。

滤纸纤维素酶（FPase）活力单位：以Whatman No.1滤纸(1.0×6.0cm=50.0mg)为底物，50℃下，50mM柠檬酸钠缓冲液(pH=4.8)中反应60min，以每分钟释放1μmol还原糖为一个酶活力国际单位（IU），表示为IU/g干重。

羧甲基纤维素酶（CMCase）活力单位：以2%(w/v)羧甲基纤维素为底物，50℃下，50mM柠檬酸钠缓冲液(pH=5.5)中反应30min，以每分钟释放1μmol还原糖为一个酶活力国际单位（IU），表示为IU/g干重。

beta葡萄糖苷酶活力单位：2mL醋酸盐缓冲液中加入1mL对硝基酚-β-葡萄糖苷(p-nitrophenyl glucopyranoside,pNPG)(1mM)作为底物，50℃下反应30min，430nm比色测定，以每分钟释放1μmol对硝基酚(p-nitrophenol)(pNP)为一个酶活力国际单位（IU），表示为IU/g干重。

二、葡聚糖内切酶、木聚糖酶、beta-木糖苷酶、聚半乳糖醛酸酶和果胶酸酯裂解酶的酶活力的测定

葡聚糖内切酶、木聚糖酶、聚半乳糖醛酸酶和果胶酸酯裂解酶活力测定分别以羧甲基纤维素、桦木木聚糖酶、聚半乳糖醛酸和果胶酸为底物，具体按照有关文献(Cheilas T,Stoupis T,Christakopoulos P,Katapodis P,MammaD,Hatzinikolaou DG,Kekos D,Macris BJ,2000.Hemicellulolytic activity ofFusarium oxysporum grown on sugar beet pulp.Production of extracellulararabinanase.Process Biochem,35,557-561;Jayani RS,Saxena S,Gupta R,2005.Microbial pectinolytic enzymes:a review.Process Biochem,40,2931-2944.)。每分钟释放1μmol还原糖为一个酶活力国际单位（IU），表示为IU/g干重。

beta-木糖苷酶活力测定以硝苯基糖苷（p-nitrophenyl glycoside）为底物，具体按照有关文献(Mamma D,Koullas D,Fountoukidis G,Kekos D,MacrisBJ,Koukios E,1996.Bioethanol from sweet sorghum:Simultaneoussaccharification and fermentation of carbohydrates by a mixed microbial culture.Process Biochem,31,377-381.)。每分钟释放1μmol p-nitrophenol为一个酶活力国际单位（IU），表示为IU/g干重。

三、漆酶的酶活力的测定

漆酶活力通过对ABTS(2,2’-azino-bis-3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonicacid)的氧化而测定，反应体系为柠檬酸钠缓冲液（pH=3.0）中加入100μL的20mM ABTS再用柠檬酸钠缓冲液（pH=3.0）定容至1mL，ABTS氧化率通过420nm吸收值而确定，具体按照有关文献(Susan Grace Karp,VincenzaFaraco,Antonella Amore,Leila Birolo,Chiara Giangrande,Vanete ThomazSoccol,Ashok Pandey,Carlos Ricardo Soccol.Characterization of laccaseisoforms produced by Pleurotus ostreatus in solid state fermentation of sugarcanebagasse.Bioresource Technology,2012,114,735-739.)。每分钟氧化1μmol ABTS为一个酶活力国际单位（IU），表示为IU/g干重。

四、甘露聚糖酶的酶活力的测定

甘露聚糖酶的活力测定以角豆胶为底物，1g酶粉于40℃、pH5.0条件下，1min水解角豆胶生成相当于1μmol甘露糖还原物质，即为1个酶活力单位，表示为IU/g干重。

五、alpha-半乳糖苷酶的酶活力的测定

alpha-半乳糖苷酶活力测定体系为“0.1mL酶液+0.8mL0.2M醋酸盐缓冲液(pH4.8)+0.1mL2mM pNPG”，50℃反应15min后，加3mL0.2MNa₂CO₃终止反应，405nm处测吸收值，具体按照有关文献(Dey PM,PridhamJB,1972.Biochemistry of alpha-galactosidase.Adv Enzymol,36,911-930.)。每分钟释放1μmol对硝基酚（paranitrophenol）为一个酶活力国际单位（IU），表示为IU/g干重。

六、alpha-淀粉酶的酶活力的测定

alpha-淀粉酶活力测定体系为“150μL酶液+200μL0.2%可溶性淀粉，以0.1M Tris-HCl缓冲液(pH=7.0)为溶液体系”，37℃反应30min后，加400μl3,5-dinitro salicylic acid终止反应并沸水浴保持5min，冷却至室温25℃后加8mL蒸馏水稀释，489nm处测吸收值，具体按照有关文献(BernfeldP(1955)Amylases,alpha and beta.In:Colowick SP,Kaplan NO(eds)Methodsin enzymology,Vol1.Academic,New York,pp149-154.)。每分钟释放1μmol还原糖为一个酶活力国际单位（IU），表示为IU/g干重。

七、蛋白酶的酶活力的测定

蛋白酶活力测定以氨苯磺胺偶氮酪蛋白（sulphanilamide azocasein）为底物，反应体系为250μL0.1M磷酸缓冲液(pH8.5)中含0.5%偶氮酪蛋白(azocasein)(w/v)，再加150μL酶液，37℃反应30min后，加1.2mL三氯乙酸溶液（trichloroacetic acid solution）(10%,w/v)灭酶，再加800μL of1.8N NaOH中和，420nm处测吸收值，具体按照有关文献(Leighton TJ,Doi RH,WarrenRAJ,Kelln RA(1973)The relationship of serine protease activity to RNApolymerase modification and sporulation in Bacillus subtilis.J MolBiol,76:103-122.).每分钟释放1μg偶氮酪蛋白(azocasein)为一个酶活力国际单位（IU），表示为IU/g干重。

八、植酸酶和单宁酶的酶活力的测定

植酸酶活力测定以对硝基苯磷酸盐(p-nitrophenylphosphate)为底物，具体按照有关文献(Stockmann C,Losen M,Dahlems U,Knocke C,Gellissen G,Buchs J(2003).Effect of oxygen supply on passaging,stabilizing and screeningof recombinant Hansenula polymorpha production strains in test tube cultures.FEMS Yeast Res,4(2):195-205.)。每分钟释放1μmol对硝基苯酚(p-nitrophenol)为一个酶活力国际单位（IU），表示为IU/g干重。

单宁酶活力测定以单宁酸为底物，具体按照有关文献(Mondal KC,Banerjee D,Jana M,Pati BR(2001).Colorimetric assay method fordetermination of the tannin acyl hydrolase(EC3.1.1.20)activity.AnalBiochem,295(2):168-171.)。每分钟转化1μmol单宁酸为一个酶活力国际单位（IU），表示为IU/g干重。

九、乳酸菌密度的测定

Man Rogosa Sharpe(MRS)培养基为乳酸菌选择培养基，测定ManRogosa Sharpe(MRS)培养基上的菌落总数，即可换算为乳酸菌密度。菌落总数测定按照有关文献进行(Song Y,Luo Y,You J,Shen H,&Hu S.(2012).Biochemical,sensory and microbiological attributes of bream(Megalobramaamblycephala)during partial freezing and chilled storage.J Sci FoodAgric,92(1),197-202.)。

Claims (5)

1.一种生物转化马铃薯茎叶和向日葵饼粕制备饲料用复合酶兼益生菌制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将经渥堆发酵的普洱熟茶、香菇菌棒、茶树菇菌棒、第一马铃薯茎叶、第一向日葵饼粕、第一麦麸、第一苹果渣和第一水充分混合，经驯化培养后形成发酵剂；

所述的经渥堆发酵的普洱熟茶、香菇菌棒、茶树菇菌棒、第一马铃薯茎叶、第一向日葵饼粕、第一麦麸、第一苹果渣和第一水的质量比为10：1～10：1～10：5～15：2～8：1～4：0.5～2：10～30；

所述的驯化培养的条件为在30℃～45℃驯化培养24～60小时；

2)将步骤1)中的发酵剂、第二马铃薯茎叶、第二向日葵饼粕、第二麦麸、第二苹果渣和第二水充分混合，经发酵后，得到饲料用复合酶兼益生菌制剂；

所述的发酵剂、第二马铃薯茎叶、第二向日葵饼粕、第二麦麸、第二苹果渣和第二水的质量比为10：100～800：50～500：10～100：5～60：100～1500；

所述的发酵采用固态发酵，所述的固态发酵的条件为：料厚度为5cm～20cm，自然通风，在30℃～45℃发酵2～7天。

2.根据权利要求1所述的生物转化马铃薯茎叶和向日葵饼粕制备饲料用复合酶兼益生菌制剂的方法，其特征在于，步骤1)中，所述的经渥堆发酵的普洱熟茶、香菇菌棒、茶树菇菌棒、第一马铃薯茎叶、第一向日葵饼粕、第一麦麸、第一苹果渣和第一水的质量比为10：5：5：10：5：2：1：22～25。

3.根据权利要求1所述的生物转化马铃薯茎叶和向日葵饼粕制备饲料用复合酶兼益生菌制剂的方法，其特征在于，步骤1)中，所述的驯化培养的条件为在35℃～40℃驯化培养36～48小时。

4.根据权利要求1所述的生物转化马铃薯茎叶和向日葵饼粕制备饲料用复合酶兼益生菌制剂的方法，其特征在于，步骤2)中，所述的发酵剂、第二马铃薯茎叶、第二向日葵饼粕、第二麦麸、第二苹果渣和第二水的质量比为10：300～600：150～300：30～60：15～30：400～1000。

5.根据权利要求1所述的生物转化马铃薯茎叶和向日葵饼粕制备饲料用复合酶兼益生菌制剂的方法，其特征在于，步骤2)中，所述的固态发酵的条件为：固态发酵的料厚度为10cm～15cm，自然通风，在35℃～40℃发酵4～5天。