CN103340041A - 一种基于受激发光的作物种子萌发期抗旱性评价方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开的一种基于受激发光的作物种子萌发期抗旱性评价方法，采用高渗溶液法用一定浓度的高渗溶液对萌发作物种子进行水分胁迫，胁迫数天后将萌发种子用非饱和光激发，立即测量萌发种子受激后发出的光，通过对水分胁迫下萌发种子受激发光的分析评价种子萌发期的抗旱性。本发明基于受激发光的作物种子萌发期抗旱性评价方法，无需进行田间试验，只需对萌发种子进行水分胁迫，直接测定萌发种子受激发的发光衰减曲线，通过对发光参数的提取和分析实现萌发种子抗旱性强弱的无损和快速评价，简单实用，评价效果可靠。

Description

一种基于受激发光的作物种子萌发期抗旱性评价方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种植物抗逆性评价的方法，具体涉及一种基于受激发光的作物种子萌发期抗旱性评价方法。

背景技术

干旱是影响作物生产的最主要因素，萌发期干旱直接影响作物种子的发芽、生长发育和产量形成。因此，作物种子萌发期抗旱性是作物抗旱性研究中最为关注的问题之一。

长期以来，评价作物种子萌发期抗旱性的方法是采用田间法、人工模拟法或高渗溶液法形成干旱胁迫，然后依据萌发种子发生的生物学变化来判断和评价抗旱性。田间法因受季节限制、所需时间长、工作量大、速度慢、每年结果可比性差、难以重复；人工模拟法是在可人工控制水分及其它生长条件的干旱棚、抗旱池、生长箱或人工模拟气候室内实施，该法克服了田间鉴定的一些缺点，鉴定结果易于比较，同时便于控制胁迫时间、强度和重复次数，但需要一定设备，能源和资金消耗较大；高渗溶液法是用不同浓度的高渗溶液对种子萌发或苗期生长进行处理，造成作物的生理干旱，该法具有鉴定速度快、批量大的特点，是作物抗旱性研究中采用较多的方法。采用的评价指标有种子萌发抗旱指数（GDRI）、干物质积累速率、相对发芽率、胚根条数、主胚根长度、胚芽鞘长度、株高等生物抗旱指标和SOD活性、POD活性、CAT活性、MDA含量、呼吸速率、质膜透性、脯氨酸含量、脱落酸（ABA）含量、ATP酶活性、蛋白水解酶活性、K+含量等等生理抗旱指标。依据这些常规指标的评价方法有很多弊端，如测定繁杂、工作量大、周期长、无法定量、不能进行早期诊断和无损检测等等。更为重要的是，作物抗旱性是作物细胞在干旱胁迫下自我调节能力的体现，它是通过细胞内各组分的相互协作来实现的，而现今有关研究中的基础数据大多来源于破坏性的试管实验，这些实验的特点是需要离体操作，即要将细胞破碎、纯化和富集，不能进行活细胞的实时定位测量，造成了细胞内各组分、各层次之间相互作用信息的丢失，其测定结果无法反映生物代谢或者生命的真实运转状态。因此，尽管应用生物学方法研究作物抗旱性取得了许多进展，但是其研究结果不能准确反映作物抗旱性，需要开发基于活体细胞生命信息的、能够反映干旱胁迫下细胞整体代谢变化、并能实现无损和快速测量的作物种子萌发期抗旱性评价新方法。

在作物发出的各种生命信息中，电磁辐射（光）信息最容易实现无损测量，作物种子的发光在种子抗旱性评价中的应用早就受到关注。研究表明，萌发种子的发光与细胞生理代谢、细胞有序程度和细胞内各组分之间相互作用有关，是一种反映种子整体状态的生命信息。因此，通过对萌发种子发光的采集和分析有可能实现对萌发种子抗旱性评价的无损和快速测量。然而，迄今为止尚没有成熟的、基于种子发光的作物萌发期抗旱性评价方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于受激发光的作物种子萌发期抗旱性评价方法，解决现有检测方法周期长、费时费力、破坏性测量和评价不准的问题。

本发明所采取的技术方案是，一种基于受激发光的作物种子萌发期抗旱性评价方法，具体按照以下步骤实施：

步骤1：在待检测的作物种子中选择饱满程度和大小一致的种子，将其清洗、消毒，杀死表面微生物；

步骤2：取清洗过的未萌发的种子，用非饱和光照射至少0.1秒，照射光源选用激光、日光灯、自然光或LED中的一种；

步骤3：关闭照射光，用微光探测器立即测量种子的发光，测量时间至少10秒，得到种子受激后的发光强度I随时间t逐渐减小的衰减曲线；

步骤4：将种子发光强度I随时间t变化的衰减曲线按照下式拟合：

$I\left(t\right)=I_{\mathrm{SL}}+\frac{I\left(0\right)}{{(1+\frac{t}{\mathrm{\τ}})}^{\mathrm{\β}}},$

其中，I_SL、I（0）、τ和β为拟合常数，分别称为单位时间自发发光强度、受激发光初始发光强度、相干时间和衰减常数；

步骤5：将步骤4得到的I_SL、I（0）、τ和β代入下式得到未萌发种子受激发光衰减曲线下的面积，用I(T)表示：

$I\left(T\right)=I_{\mathrm{SL}}T+\frac{\mathrm{\τI}\left(0\right)}{\mathrm{\β}-1}[1-\frac{1}{{(1+T/\mathrm{\τ})}^{\mathrm{\β}-1}}];$

步骤6：将步骤1处理过的种子在水中浸泡3～24小时，将充分吸胀后的种子置于铺有滤纸的发芽床上，加入渗透势为-0.1MPa～-0.50MPa的PEG-6000，然后放入培养箱中恒温培养6～8天；

步骤7：从培养箱中取出一定量的萌发种子，将其用非饱和光照射，照射时间长度与步骤2中的时间长度相同，照射光源选用激光、日光灯、自然光或LED中的一种；

步骤8：关闭照射光，用微光探测器立即测量种子的发光，测量时间的长度与步骤3中的时间长度相同，得到种子发光强度I′随时间t变化的衰减曲线；

步骤9：将种子发光强度I′随时间t变化的衰减曲线按照下式拟合：

$I^{\′}\left(t\right)=I_{\mathrm{SL}}^{\′}+\frac{I^{\′}\left(0\right)}{{(1+\frac{t}{{\mathrm{\τ}}^{\′}})}^{{\mathrm{\β}}^{\′}}},$

其中，I′_SL、I′(0)、τ′和β′为拟合常数，分别为水分胁迫下萌发种子单位时间自发发光强度、受激发光初始发光强度、相干时间和衰减常数；

步骤10：将I′_SL、I′(0)、τ′和β′代入下式，得到在PEG-6000水分胁迫下萌发作物种子受激发光衰减曲线下的面积，用I′(T)表示：

$I^{\′}\left(T\right)=I_{\mathrm{SL}}^{\′}T+\frac{{\mathrm{\τ}}^{\′}{I}^{\′}\left(0\right)}{{\mathrm{\β}}^{\′}-1}[1-\frac{1}{{(1+T/{\mathrm{\τ}}^{\′})}^{{\mathrm{\β}}^{\′}-1}}],$

步骤11：定义萌发种子抗旱性评价系数R为：

$R=1-\frac{I\left(T\right)}{I^{\′}\left(T\right)},$

将步骤5得到的未萌发种子的发光衰减曲线下的面积I(T)和步骤10得到的经过水分胁迫一段时间后的萌发种子衰减曲线下的面积I′(T)代入上述公式，得到萌发种子的抗旱性评价系数R；

步骤12：根据R值的大小评价萌发种子抗旱性的强弱。

本发明所采取的另一技术方案是，一种基于受激发光的作物种子萌发期抗旱性评价方法，具体按照以下步骤实施：

步骤1：在待检测的作物种子中选择饱满程度和大小一致的种子，将其清洗、消毒，杀死表面微生物；

步骤2：取清洗过的未萌发的种子，用非饱和光照射至少0.1秒，照射光源选用激光、日光灯、自然光或LED中的一种；

步骤3：关闭照射光，用微光探测器立即测量种子的发光，测量时间至少10秒，得到种子受激后的发光强度I随时间t逐渐减小的衰减曲线；

步骤4：将种子发光强度I随时间t变化的衰减曲线按照双指数函数式拟合：

$I\left(t\right)=I_{\mathrm{SL}}+I_1{e}^{-t/{\mathrm{\τ}}_1}+I_2{e}^{-t/{\mathrm{\τ}}_2},$

得到上式中各拟合参数I_SL、I₁、I₂、τ₁和τ₂；

将上式在一个测量周期T内积分得到未萌发种子受激发后发光衰减曲线下的面积I（T）的表达式：

$I\left(T\right)=I_{\mathrm{SL}}T+I_1{\mathrm{\τ}}_1[1-\exp (-\frac{T}{{\mathrm{\τ}}_1})]+I_2{\mathrm{\τ}}_2[1-\exp (-\frac{T}{{\mathrm{\τ}}_2})];$

步骤5：将步骤4中得到的拟合参数I_SL、I₁、I₂、τ₁和τ₂代入I（T）的表达式得到未萌发种子受激发后发光衰减曲线下的面积I（T）的数值；

步骤6：将步骤1处理过的种子在水中浸泡3～24小时，将充分吸胀后的种子置于铺有滤纸的发芽床上，加入渗透势为-0.1MPa～-0.50MPa的PEG-6000，然后放入培养箱中恒温培养6～8天；

步骤7：从培养箱中取出一定量的萌发种子，将其用非饱和光照射，照射时间长度与步骤2中的时间长度相同，照射光源选用激光、日光灯、自然光或LED中的一种；

步骤8：关闭照射光，用微光探测器立即测量种子的发光，测量时间的长度T与步骤3中的时间长度相同，得到种子发光强度I′随时间t变化的衰减曲线；

步骤9：将萌发种子受激发光衰减曲线按照下式拟合：

$I^{\′}\left(t\right)=I_{\mathrm{SL}}^{\′}+I_1^{\′}{e}^{-t/{\mathrm{\τ}}_1^{\′}}+I_2^{\′}{e}^{-t/{\mathrm{\τ}}_2^{\′}},$

得到拟合常数I′_SL、I′₁、I′₂、τ′₁和τ′₂；

步骤10：将拟合参数I′_SL、I′₁、I′₂、τ′₁和τ′₂代入在一个测量周期T中的积分表达式：

$I^{\′}\left(T\right)=I_{\mathrm{SL}}^{\′}T+I_1^{\′}{\mathrm{\τ}}_1^{\′}[1-\exp (-\frac{T}{{\mathrm{\τ}}_1^{\′}})]+I_2^{\′}{\mathrm{\τ}}_2^{\′}[1-\exp (-\frac{T}{{\mathrm{\τ}}_2^{\′}})],$

得到水分胁迫一段时间后萌发种子受激发光衰减曲线下的面积I′(T)的数值；

步骤11：萌发种子抗旱性评价系数R定义为：

$R=1-\frac{I\left(T\right)}{I^{\′}\left(T\right)},$

将步骤5中得到的未萌发种子受激发发光衰减曲线下的面积I（T）的数值和步骤10中得到的水分胁迫一段时间后萌发种子受激发发光衰减曲线下的面积I′(T)的数值代入上式，得到萌发种子抗旱性评价系数R；

步骤12：根据R值的大小评价萌发种子抗旱性的强弱。

本发明的特点还在于，

其中的根据R值的大小评价萌发种子抗旱性的强弱，评价标准如下：R值的大小在0-1之间，R值越接近于1，种子抗旱性越强；R值越接近于0，种子抗旱性越弱。

本发明的有益效果是，无需进行田间试验，只需对萌发种子进行水分胁迫，直接测定萌发种子受激发的发光衰减曲线，通过对发光参数的提取和分析实现萌发种子抗旱性强弱的无损和快速评价，简单实用，评价效果可靠。

附图说明

图1是本发明实施例中陕农26小麦在水分胁迫下萌发时的受激发光衰减曲线；

图2是本发明实施例中周麦18小麦在水分胁迫下萌发时受激发光衰减曲线；

图3是本发明中实施例中水分胁迫下陕农26和周麦18小麦种子萌发过程中抗旱评价系数R的变化曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

本发明的原理是作物种子受外界光激发后，种子中的生物分子将处于激发态，当其自发跃迁到基态时将发出光来，种子受激后持续发光（称延迟发光）的强度与处于激发态的分子数有关，而后者与种子的代谢强度相关。因此，水分胁迫下萌发种子受激后持续发光强度的相对变化可以反映干旱条件下萌发种子生理代谢的变化情况，依据水分胁迫下萌发种子受激发光强度的相对变化可以判断萌发种子对干旱的抵抗能力。

本发明基于受激发光的作物种子萌发期抗旱性评价方法，采用高渗溶液法用一定浓度的高渗溶液（如PEG-6000）对萌发作物种子进行水分胁迫，胁迫数天后将萌发种子用非饱和光（可以是激光、日光灯、自然光和LED等各种光源）激发，立即测量萌发种子受激后发出的光，通过对水分胁迫下萌发种子受激发光的分析评价种子萌发期的抗旱性。

具体按照以下步骤实施：

第一种检测方法：

步骤1：在待检测的作物种子中选择饱满程度和大小一致的种子，将其清洗、消毒，杀死表面微生物。

步骤2：取清洗过的未萌发的种子若干，将其用非饱和光照射一段时间，照射时间长度可以是0.1秒以上的任意时间，照射光源可以是激光、日光灯、自然光和LED，本发明中非饱和光定义为种子受激发后发光的初始发光值达到饱和程度以下时的激发光。

步骤3：关闭照射光，用微光探测器立即测量种子的发光，测量时间的长度T可以是10秒以上的任意时间，得到种子受激后的发光强度I随时间t逐渐减小的衰减曲线。

步骤4：将种子发光强度I随时间t变化的衰减曲线按照式（1）拟合：

$I\left(t\right)=I_{\mathrm{SL}}+\frac{I\left(0\right)}{{(1+\frac{t}{\mathrm{\τ}})}^{\mathrm{\β}}}---\left(1\right)$

其中，I_SL、I（0）、τ和β为拟合常数，分别称为单位时间自发发光强度、受激发光初始发光强度、相干时间和衰减常数。

步骤5：将步骤4得到的I_SL、I（0）、τ和β代入式（2）得到未萌发种子受激发光衰减曲线下的面积，用I(T)表示：

$I\left(T\right)=I_{\mathrm{SL}}T+\frac{\mathrm{\τI}\left(0\right)}{\mathrm{\β}-1}[1-\frac{1}{{(1+T/\mathrm{\τ})}^{\mathrm{\β}-1}}]---\left(2\right)$

在本发明中，将种子受激发后发光衰减曲线下的面积定义为延迟发光积分强度。

步骤6：将步骤1中清洗过的种子在水中浸泡3～24小时，将充分吸胀后的种子置于铺有滤纸的发芽床上，加入渗透势为-0.1MPa～-0.50MPa的PEG-6000（具体数值可根据不同作物种子确定），然后放入培养箱中恒温培养6～8天（温度可在20～30℃选择，培养天数可以根据种子萌发情况适当调整）。

步骤7：从培养箱中取出一定量的萌发种子（取出的种子量可以根据不同作物有所区别），将其用非饱和光照射一段时间，照射时间长度与步骤2中的时间长度相同，照射光源可以是激光、日光灯、自然光和LED。

步骤8：关闭照射光，用微光探测器立即测量种子的发光，测量时间的长度T与步骤3中的时间长度相同，得到种子发光强度I′随时间t变化的衰减曲线。

步骤9：将种子发光强度I′随时间t变化的衰减曲线按照式（3）拟合：

$I^{\′}\left(t\right)=I_{\mathrm{SL}}^{\′}+\frac{I^{\′}\left(0\right)}{{(1+\frac{t}{{\mathrm{\τ}}^{\′}})}^{{\mathrm{\β}}^{\′}}}---\left(3\right)$

其中，I′_SL、I′(0)、τ′和β′为拟合常数，分别为水分胁迫下萌发种子单位时间自发发光强度、受激发光初始发光强度、相干时间和衰减常数。

步骤10：将I′_SL、I′(0)、τ′和β′代入式（4），得到在PEG-6000水分胁迫下萌发作物种子受激发光衰减曲线下的面积，用I′(T)表示：

$I^{\′}\left(T\right)=I_{\mathrm{SL}}^{\′}T+\frac{{\mathrm{\τ}}^{\′}{I}^{\′}\left(0\right)}{{\mathrm{\β}}^{\′}-1}[1-\frac{1}{{(1+T/{\mathrm{\τ}}^{\′})}^{{\mathrm{\β}}^{\′}-1}}]---\left(4\right)$

步骤11：定义萌发种子抗旱性评价系数R为

$R=1-\frac{I\left(T\right)}{I^{\′}\left(T\right)}---\left(5\right)$

将步骤5得到的未萌发种子的发光衰减曲线下的面积I(T)和步骤10得到的经过水分胁迫一段时间后的萌发种子衰减曲线下的面积I′(T)代入式（5），得到萌发种子的抗旱性评价系数R。

步骤12：根据R值的大小评价萌发种子抗旱性的强弱。评价标准如下：R值的大小在0-1之间，R值越接近于1，种子抗旱性越强；R值越接近于0，种子抗旱性越弱。

第二种检测方法：

步骤1：在待检测的作物种子中选择饱满程度和大小一致的种子，将其清洗、消毒，杀死表面微生物。

步骤2：取清洗过的未萌发的种子若干，将其用非饱和光照射一段时间，照射时间长度可以是0.1秒以上的任意时间，照射光源可以是激光、日光灯、自然光和LED，本发明中非饱和光定义为种子受激发后发光的初始发光值达到饱和程度以下时的激发光。

步骤3：关闭照射光，用微光探测器立即测量种子的发光，测量时间的长度T可以是10秒以上的任意时间，得到种子受激后的发光强度I随时间t逐渐减小的衰减曲线。

步骤4：将种子发光强度I随时间t变化的衰减曲线按照双指数函数式（6）拟合：

$I\left(t\right)=I_{\mathrm{SL}}+I_1{e}^{-t/{\mathrm{\τ}}_1}+I_2{e}^{-t/{\mathrm{\τ}}_2}---\left(6\right)$

得到式（6）中各拟合参数I_SL、I₁、I₂、τ₁和τ₂。

将式（6）在一个测量周期T内积分得到未萌发种子受激发后发光衰减曲线下的面积I（T）的另外一种表达：

$I\left(T\right)=I_{\mathrm{SL}}T+I_1{\mathrm{\τ}}_1[1-\exp (-\frac{T}{{\mathrm{\τ}}_1})]+I_2{\mathrm{\τ}}_2[1-\exp (-\frac{T}{{\mathrm{\τ}}_2})]---\left(7\right)$

步骤5：将步骤4中得到的拟合参数I_SL、I₁、I₂、τ₁和τ₂代入式（7）得到未萌发种子受激发后发光衰减曲线下的面积I（T）的数值。

步骤6：将步骤1中清洗过的种子在水中浸泡3～24小时，将充分吸胀后的种子置于铺有滤纸的发芽床上，加入渗透势为（-0.1MPa～-0.50MPa）的PEG-6000（具体数值根据不同作物种子确定），然后放入培养箱中恒温培养6～8天（温度可在20～30℃选择，培养天数可以根据种子萌发情况适当调整）。

步骤7：从培养箱中取出一定量的萌发种子（取出的种子量可以根据不同作物有所区别），将其用非饱和光照射一段时间，照射时间长度与步骤2中的时间长度相同，照射光源可以是激光、日光灯、自然光和LED。

步骤8：关闭照射光，用微光探测器立即测量种子的发光，测量时间的长度T与步骤3中的时间长度相同，得到种子发光强度I′随时间t变化的衰减曲线。

步骤9：将萌发种子受激发光衰减曲线按式（8）拟合：

$I^{\′}\left(t\right)=I_{\mathrm{SL}}^{\′}+I_1^{\′}{e}^{-t/{\mathrm{\τ}}_1^{\′}}+I_2^{\′}{e}^{-t/{\mathrm{\τ}}_2^{\′}}---\left(8\right)$

得到拟合常数I′_SL、I′₁、I′₂、τ′₁和τ′₂。

步骤10：将拟合参数I′_SL、I′₁、I′₂、τ′₁和τ′₂代入式（8）在一个测量周期T中的积分表达式（即种子受激发后发光衰减曲线下的面积）:

$I^{\′}\left(T\right)=I_{\mathrm{SL}}^{\′}T+I_1^{\′}{\mathrm{\τ}}_1^{\′}[1-\exp (-\frac{T}{{\mathrm{\τ}}_1^{\′}})]+I_2^{\′}{\mathrm{\τ}}_2^{\′}[1-\exp (-\frac{T}{{\mathrm{\τ}}_2^{\′}})]---\left(9\right)$

得到水分胁迫一段时间后萌发种子受激发光衰减曲线下的面积I′(T)的数值。

步骤11：萌发种子抗旱性评价系数R定义为式（10）：

$R=1-\frac{I\left(T\right)}{I^{\′}\left(T\right)}---\left(10\right)$

将步骤5中由式（7）得到未萌发种子受激发发光衰减曲线下的面积I（T）的数值和步骤10中得到水分胁迫一段时间后萌发种子受激发发光衰减曲线下的面积I′(T)的数值代入式（10），得到萌发种子抗旱性评价系数R。

步骤12：根据萌发种子R值的大小评价萌发种子抗旱性的强弱。评价标准如下：R值的大小在0-1之间，R值越接近于1，种子抗旱性越强；R值越接近于0，种子抗旱性越弱。

实施例

小麦种子选用周麦18（抗旱性弱）和陕农26（抗旱性强）。将籽粒饱满、大小均等的两种小麦种子用0.2%HgCl₂消毒2min，洗涤并放入25℃恒温培养箱中培养24h露白后，挑选露白均匀一致的种子分别以200粒为一组，均匀放在各自编号的90mm培养皿中，培养皿底部放置一张90mm中速滤纸，种子在培养过程中避光恒温（25±0.2℃），每天3：00，9：00，15：00，21：00，四个时间点添加适量、渗透势为―0.25MPa的PEG-6000培养液。

在种子培养过程中每隔一天（24h）取样测量萌发种子的受激发光，激发光为蓝色LED，发光采用中国科学院生物物理研究所研制的基于光电配增管的BPCL微弱发光测量仪。测试时取每组种子10粒，用滤纸吸干表面液体，然后放入电子天平称量种子鲜重并记录。将种子放入样品杯，设置光照时间为1min，工作电流为10mA，电子快门开启时间1min，数据采集时间（此时间称为测量周期，用T表示为40s），采集间隔为1s，工作电压为―1000V，暗室测量环境温度设为25℃。测量前后各测1次本底，并减去本底。重复测量3次，取平均值。

图1和图2分别为陕农26和周麦18小麦种子受激发后的发光衰减曲线，将图1和图2中的各曲线分别按式（1）拟合得到每一条衰减曲线的单位时间自发发光强度ISL、初始发光强度I（0）、相干时间τ和衰减常数β。将每条曲线的I_SL、I（0）、τ和β，分别代入式（2）、式（3）和式（4），得到两个品种的小麦种子在萌发过程中的种子抗旱性评价系数R，图3为水分胁迫下，陕农26和周麦18小麦种子萌发过程中抗旱评价系数R的变化。由图3可见，在水分胁迫下陕合26小麦的R值在萌发第4天时开始下降，而周麦18小麦的R值在萌发第2天时就开始下降，在萌发第6天时陕合26小麦的R值为0.77，而周麦18小麦的R值为0.55。由于陕合26小麦的R值高于周麦18小麦的R值，表明陕农26小麦种子萌发期的抗旱性比周麦18小麦要强。

陕农26小麦是旱地品种，抗旱性强；周麦18小麦是水地品种，抗旱性弱。本实施例对两种小麦抗旱性的判别结果符合实际情况。在同样的渗透胁迫下抗旱性强的作物种子细胞能够保持较为旺盛的细胞活力，受外界光激发后种子的发光随测量时间衰减的较慢，受激发光衰减曲线下的面积I′(T)较大，因而抗旱性评价系数R就较大；反之，抗旱性弱的作物种子细胞活力受到抑制，受外界光激发后种子的发光随测量时间衰减的较快，受激发光衰减曲线下的面积I′(T)较小，因而抗旱性评价系数R就较小。

由本实施例可见，本发明提出的评价作物种子萌发期抗旱性的方法无需进行田间试验，只需对萌发种子施加高渗溶液形成水分胁迫，直接测定萌发种子受激发的发光衰减曲线，通过对发光参数的提取和分析就可以实现萌发种子抗旱性强弱的无损和快速评价，简单实用，评价效果可靠。

Claims (3)

1.一种基于受激发光的作物种子萌发期抗旱性评价方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：

步骤1：在待检测的作物种子中选择饱满程度和大小一致的种子，将其清洗、消毒，杀死表面微生物；

步骤2：取清洗过的未萌发的种子，用非饱和光照射至少0.1秒，照射光源选用激光、日光灯、自然光或LED中的一种；

步骤3：关闭照射光，用微光探测器立即测量种子的发光，测量时间至少10秒，得到种子受激后的发光强度I随时间t逐渐减小的衰减曲线；

步骤4：将种子发光强度I随时间t变化的衰减曲线按照下式拟合：

$I\left(t\right)=I_{\mathrm{SL}}+\frac{I\left(0\right)}{{(1+\frac{t}{\mathrm{\τ}})}^{\mathrm{\β}}},$

其中，I_SL、I（0）、τ和β为拟合常数，分别称为单位时间自发发光强度、受激发光初始发光强度、相干时间和衰减常数；

步骤5：将步骤4得到的I_SL、I（0）、τ和β代入下式得到未萌发种子受激发光衰减曲线下的面积，用I(T)表示：

$I\left(T\right)=I_{\mathrm{SL}}T+\frac{\mathrm{\τI}\left(0\right)}{\mathrm{\β}-1}[1-\frac{1}{{(1+T/\mathrm{\τ})}^{\mathrm{\β}-1}}];$

步骤6：将步骤1处理过的种子在水中浸泡3～24小时，将充分吸胀后的种子置于铺有滤纸的发芽床上，加入渗透势为-0.1MPa～-0.50MPa的PEG-6000，然后放入培养箱中恒温培养6～8天；

步骤7：从培养箱中取出一定量的萌发种子，将其用非饱和光照射，照射时间长度与步骤2中的时间长度相同，照射光源选用激光、日光灯、自然光或LED中的一种；

步骤8：关闭照射光，用微光探测器立即测量种子的发光，测量时间的长度与步骤3中的时间长度相同，得到种子发光强度I′随时间t变化的衰减曲线；

步骤9：将种子发光强度I′随时间t变化的衰减曲线按照下式拟合：

$I^{\′}\left(t\right)=I_{\mathrm{SL}}^{\′}+\frac{I^{\′}\left(0\right)}{{(1+\frac{t}{{\mathrm{\τ}}^{\′}})}^{{\mathrm{\β}}^{\′}}},$

其中，I′_SL、I′(0)、τ′和β′为拟合常数，分别为水分胁迫下萌发种子单位时间自发发光强度、受激发光初始发光强度、相干时间和衰减常数；

步骤10：将I′_SL、I′(0)、τ′和β′代入下式，得到在PEG-6000水分胁迫下萌发作物种子受激发光衰减曲线下的面积，用I′(T)表示：

$I^{\′}\left(T\right)=I_{\mathrm{SL}}^{\′}T+\frac{{\mathrm{\τ}}^{\′}{I}^{\′}\left(0\right)}{{\mathrm{\β}}^{\′}-1}[1-\frac{1}{{(1+T/{\mathrm{\τ}}^{\′})}^{{\mathrm{\β}}^{\′}-1}}],$

步骤11：定义萌发种子抗旱性评价系数R为：

$R=1-\frac{I\left(T\right)}{I^{\′}\left(T\right)},$

将步骤5得到的未萌发种子的发光衰减曲线下的面积I(T)和步骤10得到的经过水分胁迫一段时间后的萌发种子衰减曲线下的面积I′(T)代入上述公式，得到萌发种子的抗旱性评价系数R；

步骤12：根据R值的大小评价萌发种子抗旱性的强弱。

2.一种基于受激发光的作物种子萌发期抗旱性评价方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：

步骤1：在待检测的作物种子中选择饱满程度和大小一致的种子，将其清洗、消毒，杀死表面微生物；

步骤2：取清洗过的未萌发的种子，用非饱和光照射至少0.1秒，照射光源选用激光、日光灯、自然光或LED中的一种；

步骤3：关闭照射光，用微光探测器立即测量种子的发光，测量时间至少10秒，得到种子受激后的发光强度I随时间t逐渐减小的衰减曲线；

步骤4：将种子发光强度I随时间t变化的衰减曲线按照双指数函数式拟合：

$I\left(t\right)=I_{\mathrm{SL}}+I_1{e}^{-t/{\mathrm{\τ}}_1}+I_2{e}^{-t/{\mathrm{\τ}}_2},$

得到上式中各拟合参数I_SL、I₁、I₂、τ₁和τ₂；

将上式在一个测量周期T内积分得到未萌发种子受激发后发光衰减曲线下的面积I（T）的表达式：

$I\left(T\right)=I_{\mathrm{SL}}T+I_1{\mathrm{\τ}}_1[1-\exp (-\frac{T}{{\mathrm{\τ}}_1})]+I_2{\mathrm{\τ}}_2[1-\exp (-\frac{T}{{\mathrm{\τ}}_2})];$

步骤5：将步骤4中得到的拟合参数I_SL、I₁、I₂、τ₁和τ₂代入I（T）的表达式得到未萌发种子受激发后发光衰减曲线下的面积I（T）的数值；

步骤6：将步骤1处理过的种子在水中浸泡3～24小时，将充分吸胀后的种子置于铺有滤纸的发芽床上，加入渗透势为-0.1MPa～-0.50MPa的PEG-6000，然后放入培养箱中恒温培养6～8天；

步骤7：从培养箱中取出一定量的萌发种子，将其用非饱和光照射，照射时间长度与步骤2中的时间长度相同，照射光源选用激光、日光灯、自然光或LED中的一种；

步骤8：关闭照射光，用微光探测器立即测量种子的发光，测量时间的长度T与步骤3中的时间长度相同，得到种子发光强度I′随时间t变化的衰减曲线；

步骤9：将萌发种子受激发光衰减曲线按照下式拟合：

$I^{\′}\left(t\right)=I_{\mathrm{SL}}^{\′}+I_1^{\′}{e}^{-t/{\mathrm{\τ}}_1^{\′}}+I_2^{\′}{e}^{-t/{\mathrm{\τ}}_2^{\′}},$

得到拟合常数I′_SL、I′₁、I′₂、τ′₁和τ′₂；

步骤10：将拟合参数I′_SL、I′₁、I′₂、τ′₁和τ′₂代入在一个测量周期T中的积分表达式：

$I^{\′}\left(T\right)=I_{\mathrm{SL}}^{\′}T+I_1^{\′}{\mathrm{\τ}}_1^{\′}[1-\exp (-\frac{T}{{\mathrm{\τ}}_1^{\′}})]+I_2^{\′}{\mathrm{\τ}}_2^{\′}[1-\exp (-\frac{T}{{\mathrm{\τ}}_2^{\′}})],$

得到水分胁迫一段时间后萌发种子受激发光衰减曲线下的面积I′(T)的数值；

步骤11：萌发种子抗旱性评价系数R定义为：

$R=1-\frac{I\left(T\right)}{I^{\′}\left(T\right)},$

将步骤5中得到的未萌发种子受激发发光衰减曲线下的面积I（T）的数值和步骤10中得到的水分胁迫一段时间后萌发种子受激发发光衰减曲线下的面积I′(T)的数值代入上式，得到萌发种子抗旱性评价系数R；

步骤12：根据R值的大小评价萌发种子抗旱性的强弱。

3.根据权利要求1或2所述的基于受激发光的作物种子萌发期抗旱性评价方法，其特征在于，所述的根据R值的大小评价萌发种子抗旱性的强弱，评价标准如下：R值的大小在0-1之间，R值越接近于1，种子抗旱性越强；R值越接近于0，种子抗旱性越弱。

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