CN103327998A - 与再生障碍性贫血相关的膜突蛋白片段 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了用于检测和监测获得性再生障碍性贫血的组合物和方法。
Description
技术领域
本申请总体涉及对自身免疫性疾病的分子生物学和医学研究。更具体地，本申请关注基于独特存在的与再生障碍性贫血相关的特定自身抗体的方法和组合物。
背景技术
自身免疫性疾病是由免疫系统对患者自身物质和组织的异常应答引起的疾病。共有超过80种不同类型的自身免疫性疾病，其总的来说是导致慢性疾病的第二位的原因，在最高达64岁的所有年龄组中其是导致女性死亡的前十位的死因之一。
人们已在医学研究方面投入了大量精力用于了解自身免疫性疾病的机制以及寻找有效的诊断和治疗方法。目前多种自身免疫性疾病的特征是自身抗体的存在并且具有不良活性。这些自身抗体通常识别并结合至正常和健康的自身抗原，进而导致相关组织和器官的明显损伤和衰竭。
获得性再生障碍性贫血，也称为再生障碍性贫血(AA)，是一种罕见的但是致命的血液疾病，其特征为骨髓停止或减少制造血细胞。据信骨髓无法补充血细胞是造血细胞被破坏的结果——多能干细胞正常情况下产生全部三种类型的血细胞——红细胞、白细胞和血小板。因此，如果没有早期诊断，AA患者会发展成严重的症状，如果没有及时治疗可能是致命的。贫血，即红细胞数减少，导致血红蛋白缺乏和低氧(缺氧)；白细胞减少，即白细胞的数量减少，使得个体更容易感染；以及血小板减少，即血小板数量减少，使血液不容易凝血，导致出血、瘀伤和全身无力的风险增加。
再生障碍性贫血可能由多种内在和环境因素导致，如遗传缺陷、暴露于有毒的化学品、化疗及其他药物、辐射、病毒以及甚至是妊娠。由外在因素引起的那些，即获得性再生障碍性贫血，更为常见。人们认为AA的一个重要的病理生理机制是与自身免疫性应答相关，其中机体的免疫系统错误地发出攻击并破坏骨髓中的造血细胞。Young等，Blood，108：2509-19(2006)。近年来，伴随干细胞移植的免疫抑制已成为AA的主要疗法之一。
通过对自身免疫性疾病患者的血清进行免疫检测，已鉴定了多种自身免疫性疾病。此类靶抗原之一为膜突蛋白——膜组织延伸刺突蛋白，已发现其与类风湿性关节炎(RA)患者的自身抗体反应。Wagatsuma等，Mol.Immuol.，33：1171-6(1996)。最初是从牛子宫中鉴定出膜突蛋白，其特征为可能作为肝素的受体。Lankes等，Biochem J.251：831-42(1988)。进一步的研究将膜突蛋白作为埃兹蛋白-根蛋白-膜突蛋白(ERM)蛋白家族成员。这些蛋白主要在细胞质中表达，集中在富含肌动蛋白的细胞-表面结构中。其充当细胞质膜和肌动蛋白细胞骨架之间的结构连接体，在形成微绒毛、细胞间粘附、维持细胞形状、细胞活动性和膜运输中发挥作用。随后的研究揭示其还参与了生理性和病理性的信号转导。Louvet-Vallee，Biol.Cell92：305-16(2000)。
ERM蛋白的序列和结构分析显示，其在种间和分子间具有高度的同源性。ERM蛋白具有三个结构域：称为FERM结构域的N-末端结构域(条带4.1、埃兹蛋白、根蛋白、膜突蛋白同源结构域)，因为其与条带4.1蛋白具有同源性，中心螺旋结构域和C-末端尾结构域。C-末端尾结构域与F-肌动蛋白结合，而C-末端尾结构域负责与细胞质膜中的粘附分子结合。Louvet-Vallee(2000)。
Wagatsuma等(1996)报告了在RA患者中检出抗-ERM自身抗体。在已检测的71个患者血清中，有24个样品(33.8％)与至少一个重组ERM抗原反应且有10个样品(14％)仅与重组膜突蛋白反应。然而，该研究未发现在抗-ERM抗体的存在与临床表现如疾病的持续时间或阶段之间具有明显的相关性。此外，在其他自身免疫性疾病患者如原发性Sojgren综合症(PSS)和系统性红斑狼疮(SLE)患者的血清中未发现任何针对这三个ERM蛋白的反应性。
Shcherbina等研究了ERM蛋白在血细胞中的表达类型和功能性质。Shcherbina等，FEBS Letters443：31-6(1999)。已发现膜突蛋白是在不同类型的血细胞中表达的主要ERM蛋白。使用蛋白酶钙激活蛋白酶进行的裂解实验显示在完整受激淋巴细胞中，膜突蛋白对钙激活蛋白酶治疗具有抗性，而埃兹蛋白对钙激活蛋白酶敏感。对钙激活蛋白酶敏感性的这种差异提示这些ERM蛋白在血细胞中具有不同的特殊功能。在血小板中，膜突蛋白是所检测到的唯一的ERM蛋白，其表达随血小板的活性而改变。在循环状态下，发现膜突蛋白在外周表面光滑的血小板中表达。当血小板活化时，发现膜突蛋白在新形成的微绒毛上表达，提示其在调节血小板功能方面具有积极作用。
Takamatsu等报告了在获得性再生障碍贫血(AA)患者的血清中检出针对膜突蛋白的特异性抗体。Takamatsu等，Blood109：2514-20(2007)。使用ELISA发现，在67个AA患者中有25个(37％)表现出高滴度的抗膜突蛋白抗体。进一步的体外研究显示，来自AA患者的抗膜突蛋白抗体诱导产生了炎性细胞因子如TNF-α和IFN-γ，提示其在疾病的病理生理过程中发挥作用。Espinoza等，Intl.Immu.21：913-23(2009)；Takamatsu等，J. Immunol.182：703(2009)。
自身免疫性疾病临床管理的挑战之一是对患者疾病的准确和早期的鉴别。由于并非所有的AA患者均是免疫介导的，因此确定一个可靠的标记物以便将非免疫介导的AA与免疫介导的AA相区分非常重要。针对这种区分的方法在有选择地使用免疫抑制治疗目标AA患者方面是有用的。而且，测量抗体滴度为疾病阶段和治疗进展提供了有效监测。本申请所描述的本申请提供了这些工具和其他益处。
发明内容
本申请提供了用于诊断和监测AA的组合物和方法，所述组合物和方法至少部分地基于特定膜突蛋白功能性结构域形成的膜突蛋白片段及其检测特定抗膜突蛋白自身抗体的用途，所述膜突蛋白自身抗体的存在和水平与AA患者的疾病类型和阶段相关联。
一方面，本发明提供了一种组合物，所述组合物包括能够与抗膜突蛋白自身抗体结合的膜突蛋白片段，其中所述膜突蛋白片段包括来自人膜突蛋白的C-末端尾结构域的至少十个连续的氨基酸残基。
在某些实施方式中，本申请的膜突蛋白片段包括人膜突蛋白的C-末端尾结构域的至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个连续的氨基酸残基。在某些实施方式中，所述膜突蛋白片段包括人膜突蛋白的C-末端尾结构域的至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个连续的氨基酸残基。
在某些实施方式中，C-末端尾结构域由人膜突蛋白的氨基酸残基区段471-577组成。在某些实施方式中，本申请的膜突蛋白片段包括至少十个连续的氨基酸残基，所述连续的氨基酸残基选自人膜突蛋白氨基酸残基区段471-574、471-576、471-575、471-577、472-574、472-575、472-576、472-577、473-574、473-575、473-576、473-577、474-574、474-575、474-576、474-577、471-487、488-501或502-577。在一个实施方式中，膜突蛋白片段包括人膜突蛋白的整个C-末端尾结构域。
在某些实施方式中，本申请的膜突蛋白片段与人膜突蛋白的C-末端尾结构域或其片段具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。在某些实施方式中，膜突蛋白片段与选自人膜突蛋白氨基酸残基471-487、488-501、502-577和471-577的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。
在某些实施方式中，本申请的膜突蛋白片段基本上由人膜突蛋白的C-末端尾结构域或其片段组成。在某些实施方式中，本申请的膜突蛋白片段基本上由人膜突蛋白的氨基酸残基区段471-487、488-501、502-577和471-577组成。在某些实施方式中，本申请的膜突蛋白片段不含人膜突蛋白的螺旋结构域和N-末端FERM结构域的任何实质性部分。术语“实质性部分”指能够与所述结构域(螺旋结构域或N-末端FERM结构域或C-末端尾结构域)竞争，特异性结合抗体的所述相关结构域(螺旋结构域或N-末端FERM结构域或C-末端尾结构域)的部分。所述抗体能够与所述整个相关结构域(螺旋结构域或N-末端FERM结构域或C-末端尾结构域)结合。在某些实施方式中，本申请的膜突蛋白片段不含人膜突蛋白的N-末端FERM结构域的任何实质性部分。在某些实施方式中，本申请的膜突蛋白片段不含人膜突蛋白的螺旋结构域的任何实质性部分。
在某些实施方式中，本申请的膜突蛋白片段进一步包含载体多肽。术语“载体多肽”指能够与本申请肽的膜突蛋白片段偶联的任意肽或多肽。载体多肽对于本申请的肽可以是有益的，例如提高本申请肽的稳定性、溶解度、特异性或非特异性结合亲和性和/或功能。但是，载体多肽不必要对本申请的肽提供任何益处甚至生物学功能。常用的载体多肽包括人血清白蛋白、牛血清白蛋白、抗体片段如抗体恒定区。
一方面，本申请提供了本申请所述的膜突蛋白片段或其抗体在制备用于检测来自主体的样品中抗膜突蛋白自身抗体的诊断组合物的用途。样品可以是获取自或来自所关注主体的任意生物学组分，其含有细胞和/或其他分子实体，所述细胞和/或其他分子可以基于其性质例如物理学、生化、化学和/或生理学性质而被表征和/或鉴定。在某些实施方式中，所述样品是来自主体的血液样品包括全血、血清或血浆。主体可以是人或动物主体。在某些方面，所述人类主体患有或疑似患有AA。检测可以在体外、体内或离体进行。
一方面，通过本申请被诊断的AA与T淋巴细胞的异常活化相关。在某些实施方式中，所述与疾病相关的T淋巴细胞异常增殖。在某些实施方式中，通过本申请被诊断的AA与异常T-细胞释放的细胞因子如INF-γ和TNF-β相关。
一方面，可以用多种方法中检测自身抗体，比如通过Western印迹法或ELISA法来分析多种组织和样品包括血浆或血清。许多使用此类分析形式的免疫分析技术均可使用。其包括非竞争型的单位点和两位点或“夹心”分析，以及传统的竞争结合分析。这些分析还包括标记抗原与靶自身抗体直接结合。
一方面，本申请提供了一种用于在样品中检测抗膜突蛋白自身抗体的试剂盒，包括a)膜突蛋白片段，所述膜突蛋白片段含有人膜突蛋白的C-末端尾结构域的至少十个连续的氨基酸残基；b)能够与所述抗膜突蛋白自身抗体结合的检测抗体；和c)固相。在某些实施方式中，膜突蛋白片段结合至固相。在某些实施方式中，检测抗体是化学标记的。
另一方面，可以不使用第二抗体作为检测剂检测自身抗体。可以使用多种已知的、可用的直接检测抗原-抗体结合的技术来实施本申请。可以检测抗体的存在。
一方面，本申请提供了一种能够与上文所述的膜突蛋白片段结合的抗膜突蛋白抗体。此类抗体在与主体中的特定膜突蛋白片段结合方面能够与膜突蛋白自身抗体产生竞争。此类抗体可以用于竞争结合分析，其中结合信号减弱可以表明存在相应的自身抗体及其滴度。
一方面，本申请提供了一种在样品中检测抗膜突蛋白自身抗体的方法，包括a)提供膜突蛋白片段，其含有人膜突蛋白的C-末端尾结构域的至少十个连续的氨基酸残基；b)将所述膜突蛋白片段与所述样品反应，其中所述膜突蛋白片段与所述抗膜突蛋白自身抗体结合；和c)检测与膜突蛋白片段结合的抗膜突蛋白自身抗体。
一方面，本申请提供了一种在主体中诊断AA的方法，包括下述步骤：a)提供膜突蛋白片段，其含有人膜突蛋白的C-末端尾结构域的至少十个连续的氨基酸残基；b)在体外将所述膜突蛋白片段与来自所述主体的样品反应，其中所述膜突蛋白片段与所述抗膜突蛋白自身抗体结合；和c)确定所述样品中抗膜突蛋白自身抗体的水平是否高于正常参照样品中的所述抗膜突蛋白自身抗体的水平，以表明所述主体患有AA。抗膜突蛋白自身抗体的不同水平可能与主体AA的不同阶段和严重程度具有相关性。
一方面，本申请提供了一种确定AA患者病理状况的方法，包括下述步骤：a)提供膜突蛋白片段，其含有人膜突蛋白的C-末端尾结构域的至少十个连续的氨基酸残基；b)在体外将所述膜突蛋白片段与来自所述主体的样品反应，其中所述膜突蛋白片段与所述抗膜突蛋白自身抗体结合；c)测量抗膜突蛋白自身抗体的滴度；和d)将来自步骤c)的滴度与显示抗膜突蛋白自身抗体滴度与AA病理状况之间关系的参照数据库进行比较，根据比较结果确定所述患者的病理状况。
一方面，本申请提供了一种在进行AA治疗的主体中监测治疗进展的方法，包括下述步骤：a)提供膜突蛋白片段，其含有人膜突蛋白的C-末端尾结构域的至少十个连续的氨基酸残基；b)在体外将所述膜突蛋白片段与来自所述主体的样品反应，其中所述膜突蛋白片段与所述抗膜突蛋白自身抗体结合；c)测量抗膜突蛋白自身抗体的滴度；和d)将来自步骤c)的滴度与来自同一主体治疗前的抗膜突蛋白自身抗体的水平进行比较，其中滴度降低表明所述主体对所述治疗产生有效应答。
附图的简要说明
图1.全长人膜突蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：1，在本申请中也称为膜突蛋白-5)。
图2.膜突蛋白片段的氨基酸序列：膜突蛋白-1(SEQ ID NO：2)；膜突蛋白-2(SEQ IDNO：3)；膜突蛋白-3(SEQ ID NO：4)和膜突蛋白-4(SEQ ID NO：5)。
图3.编码全长人膜突蛋白的cDNA序列(SEQ ID NO：6)。
图4.pET32a(+)表达载体的克隆谱。
图5.pET28a(+)表达载体的克隆谱。
具体实施方式
除非另有说明，本申请的实施将采用常规的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学技术，其均在本领域常规技术手段的范围内。在文献中对此类技术进行了详细说明如Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第二版(Sambrook等，1989)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait，1984版)；″Animal Cell Culture″(R.I.Freshney，ed.，1987)；Methods in Enzymology丛书(美国学术出版社有限公司)；Current Protocols inMolecular Biology(F. M.Ausubel等，1987版，和定期更新)；PCR：The Polymerase ChainReaction(Mullis等，1994版)。本申请中使用的引物、多核苷酸和多肽可以采用本领域公知的标准技术制备。
除非另有定义，本申请所使用的技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的含义。Singleton等，Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology，第二版，J.Wiley&Sons(New York，N.Y.1994)，和March，Advanced Organic ChemistryReactions，Mechanisms and Structure，第四版，John Wiley&Sons(New York，N.Y.1992)，针对本申请中使用的多个术语为本领域技术人员提供了一般性的指导。
定义
如Lankes和Furthmayr(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.，88：8297-8301中所描述的，术语“膜突蛋白”指膜组织延伸刺突蛋白。全长的人膜突蛋白是577个氨基酸的多肽，其具有如图1所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。根据下文中的进一步定义，人膜突蛋白由三个结构域组成：N-末端FERM结构域、螺旋结构域和C-末端尾结构域。其属于ERM(埃兹蛋白-根蛋白-膜突蛋白)家族。所述的三种ERM蛋白，主要在细胞质膜下的细胞质中表达，其具有高度的序列同源性，并作为细胞质膜和肌动蛋白细胞骨架之间的连接蛋白。此外，人膜突蛋白与其他种属如小鼠和牛的膜突蛋白之间具有高度的氨基酸序列同一性。Sato等，(1992)J.Cell Sci.103：131-143。
术语“膜突蛋白片段”指短于全长野生型膜突蛋白的膜突蛋白多肽的一部分。特别地，该术语包括十个或更多氨基酸的多肽，所述多肽具有膜突蛋白的特定结构域(C-末端尾结构域、螺旋结构域或C-末端尾结构域，将在下文中进一步定义)内的氨基酸序列。此类能够与结构域特异性抗膜突蛋白自身抗体结合的膜突蛋白片段在本申请中是有用的。所述膜突蛋白片段的“片段”指短于此类膜突蛋白片段的膜突蛋白片段的一部分，其仍能与抗膜突蛋白自身抗体结合。
人膜突蛋白的“N-末端FERM结构域”指野生型人膜突蛋白的球状部分，其在结构上与所述蛋白的氨基末端邻近，在功能上负责将所述蛋白定位于细胞质膜并且与粘附分子相互作用。因为所述FERM结构域与条带4.1蛋白具有同源性而代表了条带4.1、埃兹蛋白、根蛋白、膜突蛋白同源结构域。该FERM结构域定义了条带4.1蛋白超家族成员，其包括细胞骨架蛋白如红细胞条带4.1、踝蛋白和埃兹蛋白-根蛋白-膜突蛋白(ERM)蛋白家族，以及若干酪氨酸激酶和磷酸酶及肿瘤抑制蛋白merlin。特别地，该术语指人膜突蛋白成熟形式的约前297个氨基酸残基(例如，氨基酸残基1-297(SEQ ID NO：2))。在某些文献中，也将同一结构域称为N-ERM相关结构域(N-ERMAD)，其包括在本申请的定义中。Bretscher等，(1995)Biochem.34，16830-7。
人膜突蛋白的“C-末端尾结构域”指野生型人膜突蛋白的一部分，其在结构上与所述蛋白的羧基末端邻近，在功能上负责与肌动蛋白丝结合并与其相互作用。膜突蛋白的尾结构域带正电并采用延伸、弯曲的结构。特别地，该术语指人膜突蛋白的约最后107个氨基酸残基(例如，氨基酸残基471-577(SEQ ID NO：5))。在某些文献中，也将同一结构域称为C-ERM相关结构域(C-ERMAD)，其包括在本申请的定义中。Bretscher等，(1995)。C-末端尾结构域的最后34个氨基酸残基在ERM蛋白中高度保守，并形成与F-肌动蛋白结合的区段。在F-肌动蛋白结合区段内，存在苏氨酸残基(在野生型人膜突蛋白中为Thr558)，其在该蛋白活化的过程中磷酸化。
人膜突蛋白的“螺旋结构域”指位于N-末端FERM结构域和C-末端尾结构域之间的野生型人膜突蛋白的中间部分。其采用延伸的α-螺旋结构，作为两个末端结构域之间的连接子。特别地，该术语指包含人膜突蛋白大约298-470位的氨基酸残基(SEQ ID NO：4)区段。
术语“抗膜突蛋白自身抗体”指抗膜突蛋白抗体，其由个体的免疫系统产生，并与此类个体自身的膜突蛋白或其片段识别和结合。抗膜突蛋白自身抗体的存在与AA相关，此类抗膜突蛋白自身抗体的滴度可能与AA的病理状况相关。
本申请所使用的术语“诊断”指鉴别分子或病理状况、疾病或状况，如鉴别自身免疫性疾病，或者指鉴别可能从特定治疗方案中获益的自身免疫性疾病患者。在一个实施方式中，诊断指鉴别特定类型的AA。在又一个实施方式中，诊断指鉴别AA，所述AA与主体中的抗膜突蛋白自身抗体高于正常值相关。
本申请所使用的术语“预后”指疾病症状后果的可能性预测，包括例如疾病的复发、发作和耐药性。该术语也指治疗的临床益处的可能性预测。
本申请所使用的术语“预测”指患者对药物或一组药物或特定治疗过程产生有利或不利应答的可能性。在一个实施方式中，所述预测与那些应答的程度相关。在一个实施方式中，所述预测涉及经治疗后患者是否存活或病情改善和/或其概率，例如使用特定治疗剂治疗，以及疾病某一时间段没有复发。本申请的预测方法可以在临床上使用，以便通过对任意特定患者选择最合适的治疗形式作出治疗决定。本申请的预测方法在预测患者是否可能对治疗方案产生有利应答方面是有价值的，如给定治疗方案，包括例如给予给定治疗剂或其组合、手术干预、类固醇治疗等，或者在采用治疗方案后患者是否可能长期存活。
本申请中的“样品”或“待测样品”指获取自或来自所关注主体的组分，其含有细胞和/或其他分子实体，所述细胞和/或其他分子实体可以基于其性质例如物理学、生化、化学和/或生理学性质而被表征和/或鉴别的。在一个实施方式中，该定义包括来源于生物的血液和其他液体样品以及组织样品如活检标本或组织培养物或从中得到的细胞或细胞培养物。组织样品的来源可以是实体组织如来自新鲜、冰冻和/或保存的器官或组织样品或者活检样品或抽出物；血液或任意血液成分如血浆或血清；体液；以及来自主体在妊娠或发育的任意时间的细胞或血浆。在另一个实施方式中，所述样品是来自主体的全血、血清或血浆。主体可以是人或动物主体。在另一个实施方式中，主体患有或疑似患有AA。在另一个实施方式中，该定义包括在取得后经过任意方法处理的生物样品，如使用试剂处理、增溶或对某些成分如蛋白或多核苷酸进行富集。
在一个实施方式中，样品来自在进行任何治疗以前的主体或患者。在另一个实施方式中，待测样品来自如AA治疗的过程中或治疗后。在一个实施方式中，待测样品是临床样品。在另一个实施方式中，待测样品用于诊断分析。在另一个实施方式中，在采用本申请的方法进行检测前，使用其他已知的临床技术(例如，血液检验法)对所述样品进行预试。在某些实施方式中，通过如全血计数、肝酶、肾功能、维生素B12水平、叶酸水平、红细胞沉降率、外周血液涂片、骨髓活检等对所述样品进行预试。
如本申请所使用的，“参照样品”指来自已知来源的样品，或来自确信未患有使用本申请的方法或组合物鉴别的疾病或病症的主体的样品。在一个实施方式中，参照样品来自使用本申请的组合物或方法对其疾病或病症进行鉴别的同一主体或患者身体的健康部分。在一个实施方式中，参照样品来自个体身体的健康部分。所述个体是本申请的组合物或方法无法鉴别的疾病或病症的主体或患者。在一个实施方式中，参照样品是来自具有正常血小板计数的健康个体的样品。
如本申请所使用的，“疾病参照样品”指来自在临床上已鉴别为患有疾病或病症的来源的样品，使用本申请的方法或组合物对所述疾病或病症进行鉴别。在一个实施方式中，疾病参照样品是来自在临床上诊断为AA的主体或患者的样品。在一个实施方式中，在临床上诊断为AA的主体或患者正接受针对AA的治疗。
如本申请所使用的，“参照数据库”指来自一个或多个参照样品或疾病参照样品的数据、标准或水平的集合。在一个实施方式中，此类数据、标准或水平的集合是标准化的，以便用来比较来自一个或多个样品的数据。“标准化”或“规范化”是一种方法，通过其将测量的原始数据转换成可以直接与其他这样标准化的数据直接进行比较的数据。标准化用于克服由于不同分析之间因素变化而导致的分析特异性误差，例如上样量、结合效率、检测敏感性和其他多种误差。在一个实施方式中，参照数据库包括来自一个或多个参照样品或疾病参照样品的抗膜突蛋白自身抗体滴度、血小板计数、血细胞计数和/或其他实验室和临床数据。在一个实施方式中，参照数据库包括抗膜突蛋白自身抗体的水平，其每个均标准化为对比样品(例如，已知量的抗膜突蛋白自身抗体)的抗膜突蛋白自身抗体水平的百分率，所述对比样品的抗膜突蛋白自身抗体水平是在与参照样品或疾病参照样品相同的条件下检验得到的。为了与此类标准化的抗膜突蛋白自身抗体的水平进行比较，还对待测样品抗膜突蛋白自身抗体的水平进行测量，并计算为对比样品的抗膜突蛋白自身抗体水平的百分率，所述对比样品的抗膜突蛋白自身水平是在与待测样品相同的条件下进行检验得到的。在一个实施方式中，通过汇总来自参照样品的数据建立参照数据库，所述参照样品来自健康主体和/或使用本申请的组合物或方法对其疾病或病症进行鉴别的同一主体或患者机体的未患病部分。在一个实施方式中，通过汇总来自疾病参照样品的数据建立参照数据库，所述疾病参照样品来自正在治疗AA的个体。在一个实施方式中，通过汇总来自疾病参照样品的数据建立参照数据库，所述疾病参照样品来自处于AA不同阶段的个体，所述AA所处的不同阶段通过例如血小板计数和其他临床指征的不同水平证实。
在某些实施方式中，术语“增加”指与参照样品相比自身抗体的水平总体升高5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多，所述自身抗体的水平通过本领域公知的标准方法如本申请所描述的那些方法检测得到。在某些实施方式中，术语增加指在样品中自身抗体的水平增加，其中增加的自身抗体的水平是参照样品的至少约1.25倍、1.5倍、1.75倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、25倍、50倍、75倍或100倍。
在某些实施方式中，本申请中的术语“减少”指与参照样品相比自身抗体的水平总体降低5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多，所述自身抗体的水平通过本领域公知的标准方法如本申请所描述的那些方法检测得到。在某些实施方式中，术语减少指在样品中自身抗体的水平减少，其中减少的自身抗体的水平是参照样品的至少约0.9倍、0.8倍、0.7倍、0.6倍、0.5倍、0.4倍、0.3倍、0.2倍、0.1倍、0.05倍或0.01倍。
术语“检测抗体”指能够直接通过利用检测方法放大的标记来检测的抗体，或间接通过例如另一种标记的抗体来检测的抗体。对于直接标记而言，一般地，抗体与可利用某些方法检测的部分相偶联。在一个实施方式中，可检测的抗体是生物素化的抗体。
术语“检测方法”指在本申请所述的ELISA中用于检测可检测抗体是否存在的部分或技术，包括检测剂，其扩增固定标记如被微量滴度板捕获的标记。在一个实施方式中，检测方法是比色检测剂如抗生物素蛋白或抗生物素蛋白链菌素HRP。在另一个实施方式中，检测方法是H2O2/TMB显色系统。
术语“捕获试剂”指在样品中能够结合并捕获靶分子的试剂，这样在适宜条件下，可以将捕获试剂-靶分子复合物与其余的样品分离。典型地，捕获试剂被固定或是可固定的。在夹心免疫分析中，捕获试剂优选是针对靶抗原的抗体或不同抗体的混合物。
所谓“关联”或“相关”指以任何方式将第一种分析或方案的表现和/或结果与第二种分析或方案的表现和/或结果进行比较。例如，可以使用第一种分析或方案的结果实施第二种方案和/或可以使用第一种分析或方案的结果确定是否应实施第二种分析或方案。就自身抗体检测的实施方式而言，可以使用检测分析或方案的结果确定是否应实施特定的治疗方案。
本申请中使用的单词“标记”指化合物或组合物，其直接或间接地偶联或融合至某种试剂如核酸探针或抗体，并使其偶联或融合的试剂易于检测。标记本身可以是可检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)，或者对于酶标记而言，其可以催化底物化合物或组合物的化学变化，所述化学变化是可检测的。
“分离的”多肽指已从其天然环境的污染组分中鉴别和分离和/或回收的多肽。其天然环境的污染组分是干扰多肽的诊断或治疗用途的材料，其可以包括酶、激素和其他蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在某些实施方式中，所述多肽将被纯化至(1)通过Lowry法测得多肽以重量计大于95％，或者以重量计大于99％，(2)通过使用转杯式测序仪测得达到足以获得至少15个N-末端或内部氨基酸序列残基的程度，或者(3)通过使用考马斯蓝或银染色法在还原或非还原条件下的SDS-PAGE测得具有同质性。分离的多肽包括在重组细胞内原位的多肽，因为多肽天然环境中的至少一种污染组分将不存在。然而，通常的，分离的多肽将通过至少一个纯化步骤制备。
与本申请的膜突蛋白结构域或片段相关的术语“氨基酸序列同一性百分率(％)”，其被定义为在所关注序列中与膜突蛋白结构域或片段的氨基酸残基相同的氨基酸残基百分率，且是在序列比对后，且如有必要引入间隙，以达到序列同一性的最大百分率，并且不把任何保守性氨基酸取代作为所述序列同一性的一部分。用于确定氨基酸序列同一性百分率的比对可以通过本领域内公知的多种方法实现，例如使用公众可以获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。参见例如Altschul等，NucleicAcids Res.25：3389-3402(1997)；Altschul等，Methods in Enzymology266：460-480(1996)。本领域技术人员能够确定用于测量比对的适宜参数，包括在待比较序列的全长范围内实现最大比对所需的任意算法。
术语“抗体”使用其最广泛的含义并且特别地涵盖了单克隆抗体(包括全长或完整的单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体、由至少两个完整抗体形成的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和只要其展示出所需的抗原结合活性抗体片段(如下文所示)即可。
“治疗”指治疗性治疗和预防或防范措施。需要治疗的主体包括已经患有疾病的主体以及需要预防疾病的主体。
可以使用任何表明对患者的益处的终点对患者的应答性进行评估，包括但不限于，在治疗后的给定时间点(1)在某种程度上抑制疾病的进展，包括延缓和完全阻止；(2)减少疾病发作的次数和/或减轻症状；(3)缩小损伤尺寸；(4)抑制(即，减少、延缓或完全阻止)疾病细胞向周围邻近的器官和/或组织浸润；(5)抑制(即，减少、延缓或完全阻止)疾病传播；(6)在某种程度上减轻与疾病相关的一个或多个症状；(7)治疗后增加无病期的长度；(8)减少自身免疫性应答，其可能，但不必须，导致疾病损伤消失或除去的结果，例如无进展生存；(9)增加总生存期；(10)提高应答率；和/或(11)降低死亡率。
术语“益处”使用其最广泛的含义并且指任意令人满意的效果以及特别包括临床益处。
本发明的典型方法和材料
本申请提供了用于诊断和监测AA的组合物和方法，所述AA与抗膜突蛋白自身抗体的存在或滴度相关。本申请可以通过使用本领域技术人员公知的常规方法实施。
载体、宿主细胞和重组方法
本申请的多肽可以使用易于获得的技术和材料来重组生产。对于本申请的多肽的重组生产而言，会将编码多肽的核酸分离并插入可复制载体中，所述载体供进一步克隆(DNA的扩增)或表达。使用常规方法可以容易地对编码本申请中多肽的DNA进行分离和测序。例如，通过使用寡核苷酸探针对编码人膜突蛋白的DNA进行分离和测序，所述探针能够特异性地与编码蛋白的基因结合。可以使用多种载体。载体组分一般包括，但不限于，下述中的一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种选择基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。
信号序列组分
本申请的多肽不仅可以直接重组生产，还可以作为带有异源多肽的融合多肽来重组生产，所述融合多肽一般地是在成熟蛋白或多肽的N-末端，具有特异性裂解位点的信号序列或其他多肽。一般选择的异源性信号序列可以被宿主细胞识别和处理(即，通过信号肽酶裂解)。对于原核宿主细胞而言，信号序列可以选自，例如原核信号序列碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp或热稳定肠毒素II前导物。对于酵母分泌物，信号序列可以是例如酵母转化前导物、α因子前导物(包括酵母属和克鲁维酵母属α-因子前导物)或酸性磷酸酶前导物、白色念珠菌葡萄糖淀粉酶前导物或WO90/13646中描述的信号。在哺乳动物细胞表达中，可以使用哺乳动物的信号序列以及病毒分泌前导物例如单纯疱疹gD信号。
将此类前体区的DNA在读码框中连接至编码本申请的多肽的DNA。
复制起点组分
表达和克隆载体均含有能够使载体在一个或多个选定的宿主细胞中复制的核酸序列。在一般情况下，在克隆载体中该序列可以使所述载体的复制独立于宿主染色体DNA，且包括复制起点或自发复制的序列。在多种细菌、酵母和病毒中，此类序列是公知的。来自质粒pBR322的复制起点适用于大多数的革兰氏阴性细菌、2μ质粒起点适用于酵母以及多种病毒起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)均可在哺乳动物细胞中用于克隆载体。在一般情况下，在哺乳动物表达载体中不需要复制起点组分(一般地可以仅使用SV40起点，因为其含有早期启动子)。
选择基因组分
表达和克隆载体可以含有选择基因，也称为选择性标记物。典型的选择基因编码蛋白，该蛋白(a)提供对抗生素或其他毒素，例如氨苄西林、新霉素、甲氨蝶呤或四环素的抗性，(b)弥补营养缺陷型缺陷，或者(c)提供从复合培养基中无法获得的关键营养成分，例如编码杆菌属D-丙氨酸消旋酶的基因。
选择方案的一个例子是利用药物阻止宿主细胞生长。那些被异源基因成功转化的细胞产生能赋予药物抗性的蛋白，因而在选择过程中得以存活。此类显性选择的例子使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。
另一个用于哺乳动物细胞的适宜选择性标记物的例子是能够识别可以摄取核酸的细胞的那些，如DHFR、胸腺嘧啶激酶、金属硫蛋白-I和-II、典型的灵长类动物金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。
例如，通过在含有DHFR的竞争性拮抗剂甲氨蝶呤(Mtx)的培养基中培养所有转化体，对使用DHFR选择基因转化的细胞首先进行鉴别。当引入野生型DHFR时适宜的宿主细胞是缺乏DHFR活性的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。
或者，可以在含有针对选择性标记物如氨基糖苷类抗生素例如卡那霉素、新霉素或G418的选择剂的培养基中，通过细胞生长对宿主细胞(特别是含有内源性DHFR的野生型宿主)进行选择，所述宿主细胞转化或共转化了编码本申请的多肽、野生型DHFR蛋白和其他选择性标记物如氨基糖苷3’-磷酸转移酶(APH)的DNA序列。参见美国专利号4,965,199。
在酵母中使用的适宜选择基因是在酵母质粒Yrp7中存在的trp1基因(Stinchcomb等，Nature，282：39(1979))。trp1基因提供了针对酵母突变株的选择标记物，所述酵母突变株在色氨酸中缺乏生长能力，例如ATCC No.44076或PEP4-1。Jones，Genetics，85：12(1977)。在酵母宿主细胞的基因组中的trp1损伤提供了一个有效环境，所述环境用于通过在缺乏色氨酸条件下生长来检测转化。类似地，使用已知携带Leu2基因的质粒弥补Leu2-缺陷型酵母菌株(ATCC20,622或38,626)。
启动子组分
表达和克隆载体通常含有启动子，其可被宿主生物体识别并且与编码本申请多肽的核酸可操作性地连接。适用于原核宿主的启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统和杂交启动子如tac启动子。但是，其他已知的细菌启动子也是适宜的。在细菌系统中使用的启动子还含有与编码本申请多肽的DNA可操作性地连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
用于真核生物的启动子序列是已知的。几乎所有真核基因在转录起点上游约25至30个碱基的位置均具有富含AT的区段。多个基因的转录起点上游70至80个碱基处存在另一个序列，所述序列是CNCAAT区段，在该区段中N可以是任意核苷酸。在大多数真核基因的3’末端是AATAAA序列，所述序列可能是在编码序列的3’末端添加polyA尾的信号。所有这些序列均适宜插入真核表达载体。
供酵母宿主使用的适宜启动子序列的例子包括3-磷酸甘油激酶或其他糖解酶如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸-果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油变位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶的启动子。
其他酵母启动子，其是具有转录的附加优势的诱导型启动子，所述转录由生长条件控制，所述酵母启动子是针对乙醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区段。在EP73,657中对适宜在酵母表达中使用的载体和启动子作了进一步的描述。将酵母增强子与酵母启动子一起使用也是有利地。
通过来自病毒基因组的启动子，在哺乳动物宿主细胞的载体中控制本申请多肽的转录，所述病毒基因组例如多瘤病毒、鸟痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、鸟类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猴病毒40(SV40)，所述启动子还来自异源性哺乳动物的启动子如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子，来自热休克的启动子，所提供的此类启动子与宿主细胞系统具有相容性。
SV40病毒的早期和晚期启动子能够方便地以SV40限制性片段的形式获得，所述限制性片段也含有SV40病毒的复制起点。人巨细胞病毒的即刻早期启动子能够方便地以HindIII E限制性片段的形式获得。在美国专利号4,419,446中披露了使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。在美国专利号4,601,978中描述了对该系统的改进。在来自单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶激酶启动子的控制下，人β-干扰素cDNA在小鼠细胞中的表达亦可参见Reyes等，Nature297：598-601(1982)。或者，可以使用劳氏肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子。
增强子元件组分
通过将增强子序列插入载体通常会增加高等真核细胞对编码本发明多肽的DNA的转录。现已知来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白和胰岛素)的多个增强子序列。典型地，可以使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括在复制起点后侧(bp100-270)的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、在复制起点后侧的多瘤病毒增强子、以及腺病毒增强子。用于真核启动子活化的增强元件亦可参见Yaniv，Nature297：17-18(1982)。增强子可以在多肽编码序列的5’或3’位点连接至载体，但是其一般位于启动子的5’位点。
转录终止组分
在真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或者来自其他多细胞生物体的有核细胞)中使用的表达载体还将含有转录终止和稳定mRNA所必须的序列。此类序列通常来自真核或病毒DNA或cDNA的非转译区5’位点，有时来自3’位点。这些区段含有核苷酸片段，所述核苷酸片段转录为在编码本申请多肽的mRNA非转译部分中的聚腺苷酸片段。牛生长激素多聚腺苷酸化区段是一种有用的转录终止组分。参见W094/11026和其中公开的表达载体。
宿主细胞的选择和转化
用于在本申请所述的载体中克隆或表达编码本申请多肽DNA的适宜宿主细胞为上文所述的原核细胞、酵母或更高等的真核细胞。适宜的原核生物包括真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科如埃希杆菌属例如大肠杆菌、肠杆菌属、欧文氏菌属、克雷伯氏菌属、变形杆菌属、沙门氏菌属例如鼠伤寒沙门氏菌、沙雷氏菌属例如粘质沙雷氏菌和志贺氏菌属以及杆菌属如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌(例如，在1989年4月12日公开的DD266,710中披露的地衣芽胞杆菌)、假单胞菌属如铜绿假单胞菌和链霉菌属。典型地，大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC31,446)，但是其他菌株如大肠杆菌B、大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌X1776(ATCC31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC27,325)也是适宜的。这些例子是说明性的而非限制性的。
除了原核生物以外，真核微生物如丝状真菌或酵母也是适宜用于编码本申请多肽的载体的克隆或表达宿主。在低等真核宿主微生物中，酿酒酵母或普通的面包酵母是最常用的。但是，多种其他的属、种和菌株通常在本申请中也是可用的和有用的，如粟酒裂殖酵母；克鲁维酵母菌属宿主例如克鲁维乳酸酵母、脆弱克鲁维酵母(ATCC12,424)、克鲁维保加利亚酵母(ATCC16,045)、维克拉姆克鲁维酵母(ATCC24,178)、瓦尔特克鲁维酵母(ATCC56,500)、果蝇克鲁维酵母(ATCC36,906)、耐热克鲁维酵母和马克斯克鲁维酵母；耶氏酵母属(EP402,226)；毕赤酵母属(EP183,070)；念珠菌属；瑞氏木霉(EP244,234)；粗糙脉孢菌；许旺酵母属如许旺酵母；和丝状真菌例如链孢霉菌、青霉菌、弯颈霉菌和曲霉宿主如构巢曲霉和黑曲霉。
用于表达本申请多肽的适宜宿主细胞可以来自多细胞生物体。非脊椎动物细胞包括植物和昆虫细胞。已鉴定了多种杆状病毒菌株及其变体和对应许可的昆虫宿主细胞，其来自宿主如草地夜蛾(幼虫)、埃及伊蚊(蚊子)、白纹伊蚊(蚊子)、黑腹果蝇(果蝇)和家蚕。用于转染的多种病毒菌株是可以公开获得的，例如苜蓿银纹夜蛾NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5菌株，此类病毒可以在此作为根据本申请的病毒使用，特别是用于转染草地夜蛾细胞。棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛和番茄的植物细胞培养物也能够作为宿主。
然而，最感兴趣的是脊椎动物细胞，在培养基(组织培养基)中繁殖脊椎动物细胞已成为常规方法。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子是由SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL1651)；人胚肾细胞系(用于在悬浮培养物中生长的亚克隆293细胞或293细胞，Graham等，J. Gen Virol.36：59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4216(1980))；小鼠支持细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1ATCC CCL70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL3A，ATCC CRL1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL75)；人肝细胞(Hep G2，HB8065)；小鼠乳房肿瘤(MMT060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等，Annals N.Y.Acad. Sci.383：44-68(1982))；MRC5细胞；FS4细胞；和人肝癌细胞系(Hep G2)。
使用上文所述的用于生产本申请多肽的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在常规营养培养基中对其进行培养，所述培养基被修饰以适合诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因。
培养宿主细胞
用于生产本申请的多肽使用的宿主细胞可以在多种培养基中培养。市售的培养基如Ham’s F10(Sigma)、最低必需培养基(MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和达尔伯克改良伊戈尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，DMEM)(Sigma)均适于培养宿主细胞。此外，Ham等，Meth.Enz.58：44(1979)，Barnes等，Anal.Biochem.102：255(1980)，美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO90/03430；WO87/00195；或美国专利复审号30,985中描述的任意培养基也可以作为宿主细胞的培养基。必要时可以用激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙盐、镁盐和磷酸盐)、缓冲剂(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCINTM药物)、痕量元素(定义为通常以微摩范围的最终浓度存在的的无机化合物)和葡萄糖或等效能量来源补充这些培养基的任意一种。还可以补充本领域技术人员公知的适宜浓度的任意其他必要的添加剂。培养条件如温度、pH等均是此前被选择用于表达宿主细胞的那些，其对本领域的普通技术人员而言是显而易见的。
肽的化学合成
本申请的多肽还可以通过化学合成生产，例如Merrifield in J.A.C.S.85：2149-2154(1963)中描述的固相合成法，或Bodanszky等，第二版，John Wiley and Sons，1976的《肽合成》中描述的标准溶液合成方法。这些书籍整体参考并入本申请。
肽合成的固相合成方法的一般步骤涉及首先将肽被保护的C-末端氨基酸与树脂连接。连接后，过滤、洗涤树脂并除去C-末端氨基酸α氨基基团上的保护基团(例如，t-叔丁氧羰基)。当然，除去该保护基团必须在不破坏氨基酸与树脂之间连接的前提下进行。然后在得到的树脂肽上偶联倒数第二个C-末端被保护的氨基酸。进行这一偶联时，通过在第二个氨基酸的游离羧基与连接在树脂上的第一个氨基酸的氨基之间形成一个酰胺键。用连续的氨基酸重复这一反应过程，直到肽全部的氨基酸均与树脂连接。最后，从树脂上裂解下被保护的肽，除去保护基团，得到所需的肽。用于从树脂上分离肽和除去保护基团的裂解技术取决于所选择的树脂和保护基团，这些技术对熟悉肽合成领域的人来说是已知的。
上述树脂可以是任意适宜的聚合物并且其含有能够通过共价键与第一个被保护的氨基酸牢固连接的官能团。多种聚合物均适用于这一目的，如纤维素、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸甲酯和聚苯乙烯。可以在固相合成中使用的适宜保护基团包括叔丁氧羰基(BOC)、苄基(BZL)、叔戊氧基羰基(AOC)、对甲苯磺酰基(TOS)、邻溴苯基甲氧羰基(BrZ)、2，6-二氯苄基(BZLCl2)和苯基甲氧基羰基(Z或CBZ)。其他保护基团亦可参见J.F.W.McOmie，″Protective Groups in Organic Chemistry"，Plenum Press，New York，1973中的描述。这本书整体参考并入本申请。
可以通过使用形成酰胺键的化学或酶学方法分步或嵌段偶联的方式进行标准溶液合成方法。这些溶液合成方法是本领域公知的。
多肽的纯化
可以从主体中回收本申请的多肽或蛋白。当使用重组技术时，本申请的多肽可能在细胞内、细胞周质间隙中产生，或者直接分泌到培养基中。可以从培养基或从宿主细胞的裂解物中回收本申请的多肽。如果是膜结合的，可以使用适宜的去垢剂溶液(例如，Triton-X100)或通过酶解将其从膜上释放。可以通过多种物理或化学方法破坏本申请多肽表达中使用的细胞，如反复冻融、超声、机械破坏或细胞溶解剂。
如果肽是化学合成的，可以通过任意适宜的技术将本申请的肽从反应基质中回收，所述技术能够将所需的多肽与基质中的其他组分分离。对于固相合成而言，首先使用适宜的裂解溶液将被保护的肽从树脂上裂解。裂解溶液的选择依赖于树脂以及与其结合的氨基酸的性质(如FMOC法使用三氟乙酸)。裂解通常在酸性条件下进行。裂解完成后，获得分离的肽，并使用任意适宜的技术对其进一步纯化(如下文中描述的方法)。
下述方法是示例性的适宜的蛋白纯化方法：在离子交换柱上分离；乙醇沉淀；反相HPLC；在二氧化硅上层析、在肝素SEPHAROSETM上层析、在阴离子或阳离子交换树脂上层析(如聚天冬氨酸柱、DEDA等)；聚焦层析；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤；除去污染物如IgG的蛋白A琼脂糖柱；以及与本申请的多肽以表位标记的形式结合的金属螯合柱。可以采用多种蛋白纯化方法，此类方法是本领域公知的并且已在例如Deutscher，Methods in Enzymology，182(1990)；Scopes，ProteinPurification：Principles and Practice，Springer-Verlag，New York(1982)中描述。纯化步骤的选择将依赖于例如所使用的生产工艺和所生产的本申请特定蛋白的性质。
检测方法
在本申请的方法中，生物样品来自疑似患有AA的主体，针对一种或多种抗膜突蛋白自身抗体对其进行检查。可以通过多种方法对样品中不同抗膜突蛋白自身抗体的表达进行分析，其中的多种方法是本领域公知和本领域技术人员了解的，包括但不限于酶联免疫吸附分析(ELISA)、酶联免疫流分析(ELIFA)、免疫印迹、Western印迹分析、免疫组化分析、免疫沉淀、分子结合分析等。多重免疫分析如从Rules Based Medicine或Meso ScaleDiscovery(MSD)获得的那些也可以使用。这些方法包括非竞争性类型的单一位点和双位点或“夹心”检测，以及常规的竞争性结合分析。检测可以在体外、体内或离体进行。
夹心分析是其中最有用和最常用的分析之一。夹心分析技术存在的多种变体，均包含在本申请中。简言之，在典型的正向夹心分析中，将未标记的捕获试剂(例如膜突蛋白片段)固定在固体底物上，将针对靶蛋白(例如，抗膜突蛋白自身抗体)的待测样品与底物中结合的分子接触。经过一段适宜时间的培养后，即一段足以形成抗体-抗原复合物的时间，然后加入对靶蛋白具有特异性的检测抗体(例如，通过与抗膜突蛋白自身抗体的Fc区结合)，所述检测抗体标记了能够产生检测信号的报告分子，并进行培养，培养时间要足以形成另一个捕获试剂-靶蛋白-检测抗体的复合物。洗涤除去所有未反应的材料，通过观察报告分子产生的信号确定靶蛋白的存在。可以是通过对可视信号的简单观察得到的定性结果，或者可以是通过与含有已知量报告分子的对照样品进行比较得到的定量结果。
在典型的正向夹心检测中，对靶蛋白具有特异性的捕获试剂与固体支持物形成共价或被动的结合。固体支持物一般是玻璃或聚合物，最常用的聚合物是纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固体支持物可以以小管、小珠、微板盘或适于进行免疫检测的任意其他表面。
正向分析的变体包括同时分析，其中将样品和检测抗体同时加入捕获试剂中。这些技术均是本领域技术人员公知的，包括任何微小的变化也是显而易见的。另一种替代方法包括固定样品中的靶蛋白，然后将固定的靶蛋白暴露于本申请的肽，其可以使用或不使用报告分子标记。根据靶蛋白的量和报告分子信号的强度，可以通过使用捕获试剂(例如，膜突蛋白片段)直接标记来检测结合的靶蛋白。或者，将另一个特异性针对捕获试剂的检测抗体暴露于靶蛋白-捕获试剂复合物，以便形成靶蛋白-捕获试剂-检测抗体三重复合物。通过报告分子发出的信号对复合物进行检测。
如本申请所使用的，术语“报告分子”指通过其化学性质提供分析上可识别信号的分子，其允许对抗原-结合的抗体的检测。在这一类型的分析中最常用的报告分子是酶、荧光团或含放射性核素的分子(即放射性同位素)和化学发光分子。
在某些实施方式中，报告分子是与检测抗体偶联的酶。酶一般催化显色底物的化学变化，能够使用多种技术对所述显色变化进行测量。例如，酶可以催化底物的颜色变化，能够通过分光光度法对其进行测量。或者，酶可以改变底物的荧光或化学发光。通过用特定波长的光照射激发荧光染料，其吸收光能，染料分子处于激发态，随后发射出使用光学显微镜可以目测检测的具有特征颜色的光。化学发光底物通过化学反应处于电子激发态，然后可以发射能够被测量(例如，使用化学发光计)或向荧光受体提供能量的光。酶标记的例子包括荧光素酶(例如，萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶；美国专利号4,737,456)、荧光素、2，3-二氢酞嗪基二酮、苹果酸脱氢酶、尿素酶、过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRPO)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。将酶与抗体偶联的技术在O′Sullivan et ah，Methods for thePreparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay，in Methods inEnzym.(ed.J.Langone&H.Van Vunakis)，Academic press，New York，73：147-166(1981)中进行了描述。
酶-底物组合的例子包括，例如：(i)辣根过氧化物酶(HRPO)和底物过氧化氢酶，其中过氧化氢酶氧化染料前驱体(例如，邻苯二胺(OPD)或3，3′，5，5′-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB))；(ii)碱性磷酸酶(AP)和显色底物对-硝基苯磷酸盐；和(iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)和显色底物(例如，p-硝基苯基-β-D-半乳糖苷酶)或荧光底物(例如，4-甲基伞形-β-D-半乳糖苷酶)。本领域技术人员还可以采用多种其他的酶-底物组合。对这些组合的一般性综述见美国专利号4,275,149和4,318,980。
在某些实施方式中，报告分子是荧光团，包括但不限于，稀土螯合物(铕螯合物)、德州红、罗丹明、荧光素、丹酰、丽丝胺、伞形花内酯、藻红蛋白、藻蓝蛋白或可购买获得的荧光团如SPECTRUM ORANGE7和SPECTRUM GREEN7和/或上述任意一种或多种的衍生物。例如，可以使用在Current Protocols in Immunology，第1和2卷，Coligen等，Wiley-Interscience，New York，Pubs.(1991)版中披露的技术将荧光团与抗体偶联。可以使用荧光计对荧光进行定量。
在某些实施方式中，报告分子是放射性同位素，如35S、14C、1251、3H和131I。例如可以使用上文所述的Current Protocols in Immunology中描述的技术对检测抗体或捕获试剂进行标记，并且使用闪烁计数测量放射活性。
有时，将标记间接地与检测抗体或捕获试剂偶联。本领域技术人员知晓实现此目标的多种技术。例如，检测抗体可以与生物素偶联，标记可以与抗生物素蛋白偶联，反之亦然。生物素选择性地与抗生物素蛋白结合，这样标记就可以通过这种间接方式与检测抗体偶联。或者，为实现将标记与检测抗体间接偶联，将检测抗体与较小的半抗原偶联，将标记与抗-半抗原的抗体偶联。这样，可以实现标记与抗体的间接偶联。
在某些实施方式中，检测方法是竞争结合分析，其中使用竞争性抗膜突蛋白抗体。此类竞争性抗体能够与膜突蛋白自身抗体竞争结合至本申请的肽。在竞争结合分析中，结合信号减弱可以表明存在相应的自身抗体及其滴度。
诊断试剂盒
对于在本申请上文描述的或建议的用途，本申请还提供了生产的试剂盒和产品。此类试剂盒可以包括被分隔成用于密封收纳一个或多个容器如小瓶、小管等中的载体，每个容器均包括将在所述方法中使用的一个独立元件。例如，其中一个容器可以包括探针，其是或者可能是可检测标记的。此类探针可以是对抗膜突蛋白自身抗体具有特异性的膜突蛋白片段。
典型地，本申请的试剂盒将包括上文所述的容器和一个或多个其他容器，所述容器包括从商业和用户的角度看所需的材料，包括缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头、注射器和插入包装中的使用说明书。可以在容器上使用标签，以便说明所述组分用于特定的治疗或非治疗应用，并且还可以说明是在体内或体外使用，如上文所述的那些。
本申请的试剂盒具有多种实施方式。一个典型的实施方式是试剂盒，其包括容器、在所述容器上的标签和在所述容器内的组分；其中所述组分包括能够与抗膜突蛋白自身抗体结合的本申请的肽，在所述容器上的标签表明可以使用所述组分评估样品中是否存在抗膜突蛋白自身抗体，并针对使用本申请的肽评估样品中是否存在抗膜突蛋白自身抗体进行说明。该试剂盒可以进一步包括一组说明和用于制备样品和将本申请的肽应用于样品的材料。该试剂盒可以包括第二抗体，其中第二抗体与标记偶联，例如酶标记。
在试剂盒中的其他可选组分包括一种或多种缓冲剂(例如，封闭缓冲液、洗涤缓冲液、底物缓冲液等)、其他试剂如底物(例如，显色体)，所述底物是通过酶标签化学改变的、表位修复溶液、对照样品(阳性和/或阴性对照)、对照片等。
下述为本申请方法和组合物的实施例。可以理解，考虑到上文所提供的一般性描述，可以实施多种其他的实施方式。
实施例
实施例1 膜突蛋白片段系列的产生
生产下述五个膜突蛋白片段：
a.膜突蛋白1，包含人膜突蛋白的氨基酸1-297(SEQ ID NO：2)，接近人膜突蛋白的N-末端结构域；
b.膜突蛋白-2，包含人膜突蛋白的氨基酸298-577(SEQ ID NO：3)，接近人膜突蛋白的螺旋和C-末端尾结构域；
c.膜突蛋白-3，含有人膜突蛋白的氨基酸298-470(SEQ ID NO：4)，接近人膜突蛋白的螺旋结构域；
d.膜突蛋白-4，含有人膜突蛋白的氨基酸471-577(SEQ ID NO：5)，接近人膜突蛋白的C-末端尾结构域；以及
e.膜突蛋白-5，全长人膜突蛋白，氨基酸1-577(SEQ ID NO：1)。
全长的膜突蛋白cDNA序列(1-1734bp)从Genebank获得(Genebank登录号AB527296.1)，见图3如SEQ ID NO：6所示。为产生上述所需的膜突蛋白片段，使用PCR扩增与上文所述的不同氨基酸片段对应的cDNA片段。
将PCR扩增的膜突蛋白DNA片段克隆至选自pET32a(+)和pET28a(+)的表达载体。然后使用已构建的载体转化用于培养和表达的大肠杆菌宿主细胞系BL21(DE3)。pET32a(+)和pET28a(+)的限制性和克隆谱分别见图4和5。使用限制性酶切反应对针对不同膜突蛋白片段构建的表达系统进行验证，所述限制性酶切反应通过测序以确认膜突蛋白片段表达的正确阅读框。
充分培养后，收获已表达膜突蛋白片段的宿主细胞，根据标准蛋白表达方案采集和纯化膜突蛋白片段。使用SDS-PAGE对最终得到的蛋白片段进行分析，以确认其种类和纯度。
实施例2 在AA患者的血清中对特定抗膜突蛋白自身抗体的检测和测量
从不同阶段的AA患者中采集血清和血浆样品，并检验抗膜突蛋白自身抗体的存在，所述抗膜突蛋白自身抗体识别并与膜突蛋白特定区段结合。使用患者的档案资料和临床信息基于其疾病的类型和阶段对其进行分类。
将从实施例1中获得的膜突蛋白片段作为针对抗膜突蛋白抗体的ELISA分析中的抗原。特别地，在2℃至8℃条件下使用约400ng膜突蛋白片段将ELISA板的各微孔包被12-16小时，然后用PBS洗涤一次，随后使用封闭溶液封闭并真空干燥贮存备用。这样，在自然保存抗原的条件下，将经高度纯化的膜突蛋白抗原与聚苯乙烯微孔板的孔结合。
用于随后ELISA检验的血清样品从45个已在临床上诊断为AA(患者组)的患者中采集并制备。还提供4个对照组用于比较，包括83个已在临床上诊断为肺病的患者(对照-1)、65个已在临床上诊断为肿瘤的患者(对照-2)、300个已在临床上诊断为CTD的患者(对照-4)和150个健康个体(对照-3)，并采集并制备血清样品以供随后的ELISA检验。
使用PBS-T缓冲液(即，含有0.05％(v/v)吐温-20的PBS缓冲液)对对照样品和患者血清进行稀释，然后在各孔中分别加入100μl此类已稀释的对照样品和已稀释的患者血清，以使得存在的所有抗膜突蛋白抗体均与固定的抗原结合。使用PBS-T缓冲液洗去未结合的样品，将酶标记的抗-人IgG偶联物加入各孔。再次进行培养，使得酶标记的抗-人IgG与已同微孔连接的任意抗膜突蛋白抗体结合。洗去所有未结合的酶标记的抗-人IgG后，通过加入显色底物(H2O2/TMB)测量保留的酶活性和测量显色强度。然后将100μl HRP终止液(例如，2M H2SO4)加入各孔中。根据TMB显色体确定HRP终止溶液加入的顺序和保持的时间。使用手指轻轻敲击各ELISA板，以便将孔彻底混匀。
通过使用分光光度计测量并比较患者孔显色和对照孔颜色的颜色强度，对分析进行评估。特别地，使用双色测量以测量和比较颜色强度，其中在终止反应15分钟内读取各孔的OD450值和OD630值(作为参照)。通过OD450值减去OD630值计算各待测或对照样品的OD值。
在各批次样品中采用ELISA低阳性对照样品、ELISA高阳性对照样品和ELISA阴性对照样品，以确保所有试剂和程序均正确地进行。ELISA阴性对照样品是采集自健康个体的血清。分别测量采集自50个健康个体的血清的OD值，计算这50个样品的平均OD值(“对照OD值”)和标准偏差(“对照标准偏差”)。此类对照OD值和对照标准偏差用于确定ELISA低阳性对照和高阳性对照样品的浓度。ELISA低阳性对照样品包含来自免疫性血小板减少症患者的血清，已对所述对照样品进行足够稀释以显示出等于对照OD值加三倍对照标准偏差的OD值。ELISA高阳性对照样品包含来自免疫性血小板减少症患者的血清，已对所述对照样品进行足够稀释以显示出等于三倍ELISA低阳性对照OD值的OD值。使用0.01M PBS-T缓冲液进行稀释。
首先确定样品各重复试验的平均OD值，如果该平均OD值高于ELISA低阳性对照样品的平均OD值，则确定样品为阳性。测定各样品的滴度作为所述样品的平均OD值。
本领域技术人员应理解，可以通过不同方式来实施和实现确定AA存在与否与标记物水平之间关系的步骤。一般选择参照人群并建立正常范围。使用适宜的参照人群确立这两种抗膜突蛋白抗体的正常范围是非常常规的做法。人们通常认为，在某种但是有限的程度上，正常范围依赖于确立其的参照人群。一方面，参照人群数量较多例如成百上千，并且按年龄、性别和视情况选取其他所关注的变量来匹配。依据绝对值的正常范围如给定的浓度，也依赖于所采用的分析和在实施所述分析的过程中使用的标准化方法。
可以使用在实施例部分给出的分析程序测量和建立抗膜突蛋白的水平。应理解，不同分析可能会导致不同的界值。
实验室检验的临床表现依赖于其诊断准确度，或者将主体正确分类至临床相关亚组的能力。诊断准确度用于衡量所述检验正确区分被研究主体两种不同状况的能力。此类状况例如健康和疾病或者良性对恶性疾病。
也就是说，从某个患者人群中获得显著升高的值表明相应抗膜突蛋白自身抗体的阳性存在。
针对对某些膜突蛋白片段具有特异性的不同抗膜突蛋白抗体的阳性存在对不同患者组进行比较，实验结果列于下表(表1)：
表1：在患者组的血清中比较针对特定膜突蛋白片段的抗膜突蛋白自身抗体的阳性存在
如表1所示，特异性识别并和膜突蛋白C-末端尾结构域结合的抗膜突蛋白自身抗体高于正常存在与AA的发生率(约42.2％)具有明显的相关性。
在AA患者中还测量了不同膜突蛋白片段的自身抗体滴度。计算各片段的平均滴度值并将其与其他片段的进行比较。参见表2和3中的结果。
表2：在AA患者的血清中针对特定膜突蛋白片段的抗自身抗体的滴度
表3：在表2中的自身抗体滴度之间差异的统计学显著性
滴度分析显示在AA患者中膜突蛋白的C-末端尾结构域不仅存在百分率最高，而且其还具有最高的滴度(也即敏感性)。因此，可以将包含C-末端尾结构域氨基酸的膜突蛋白用于针对患有或疑似患有AA的患者的诊断或预后方法。
Claims (18)
1.一种组合物，包括能够与抗膜突蛋白自身抗体结合的膜突蛋白片段，其中所述膜突蛋白片段包括人膜突蛋白C-末端尾结构域的至少十个连续的氨基酸残基。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述C-末端尾结构域由人膜突蛋白的氨基酸残基区段471-577组成。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述膜突蛋白片段包括至少十个连续的氨基酸残基，所述连续的氨基酸残基选自人膜突蛋白的氨基酸残基区段471-487。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述膜突蛋白片段包括至少十个连续的氨基酸残基，所述连续的氨基酸残基选自人膜突蛋白的氨基酸残基区段488-501。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述膜突蛋白片段包括至少十个连续的氨基酸残基，所述连续的氨基酸残基选自人膜突蛋白的氨基酸残基区段502-577。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述膜突蛋白片段包括人膜突蛋白的整个C末端尾结构域。
7.膜突蛋白片段在制备用于体外检测样品中的抗膜突蛋白自身抗体的诊断组合物中的用途，其中所述膜突蛋白片段能够与抗膜突蛋白自身抗体结合并且包括人膜突蛋白的C-末端尾结构域的至少十个连续的氨基酸残基。
8.根据权利要求7所述的用途，其中所述样品是来自人类主体的全血、血清或血浆。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述主体患有或疑似患有再生障碍性贫血(AA)。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述AA是免疫介导的。
11.根据权利要求10所述的用途，其中所述AA与T淋巴细胞的异常活化相关。
12.根据权利要求11所述的用途，其中所述AA与肿瘤坏死因子(TNF)-α的异常活化相关。
13.根据权利要求11所述的用途，其中所述AA与干扰素(IFN)-γ的异常活化相关。
14.一种用于检测样品中的抗膜突蛋白自身抗体的试剂盒，包括：a)膜突蛋白片段，所述膜突蛋白片段包括人膜突蛋白的C-末端尾结构域的至少十个连续的氨基酸残基；b)能够与所述抗膜突蛋白自身抗体结合的检测抗体；以及c)固相，其中所述膜突蛋白片段与所述固相结合。
15.一种检测样品中的抗膜突蛋白自身抗体的方法，包括a)提供膜突蛋白片段，所述膜突蛋白片段包括人膜突蛋白的C-末端尾结构域的至少十个连续的氨基酸残基；b)将所述膜突蛋白片段与所述样品反应；以及c)检测与所述膜突蛋白片段结合的抗膜突蛋白自身抗体。
16.一种在主体中诊断AA的方法，包括下述步骤：
a)提供膜突蛋白片段，所述膜突蛋白片段包括人膜突蛋白的C-末端尾结构域的至少十个连续的氨基酸残基；
b)在体外将所述膜突蛋白片段与来自所述主体的样品反应，其中所述膜突蛋白片段与所述抗膜突蛋白自身抗体结合；以及
c)确定所述样品中抗膜突蛋白自身抗体的水平是否高于正常参照样品中的抗膜突蛋白自身抗体的水平，以表明所述主体患有AA。
17.一种确定患有AA的患者病理状况的方法，包括下述步骤：
a)提供膜突蛋白片段，所述膜突蛋白片段包括人膜突蛋白的C-末端尾结构域的至少十个连续的氨基酸残基；
b)在体外将所述膜突蛋白片段与来自所述患者的样品反应，其中所述膜突蛋白片段与所述抗膜突蛋白自身抗体结合；以及
c)测定所述抗膜突蛋白自身抗体的水平；以及
d)将来自步骤c)的所述自身抗体的水平与显示抗膜突蛋白自身抗体滴度与AA病理状况之间关系的参照数据库进行比较，根据比较结果确定所述患者的病理状况。
18.一种在进行AA治疗的主体中监测治疗应答的方法，包括下述步骤：
a)提供膜突蛋白片段，所述膜突蛋白片段包括人膜突蛋白的C-末端尾结构域的至少十个连续的氨基酸残基；
b)在体外将所述膜突蛋白片段与来自所述主体的样品反应，其中所述膜突蛋白片段与所述抗膜突蛋白自身抗体结合；
c)测量所述抗膜突蛋白自身抗体的水平；以及
d)将来自步骤c)的所述自身抗体的水平与来自同一主体治疗前的抗膜突蛋白自身抗体的水平进行比较，其中滴度降低表明所述主体对所述治疗产生有效应答。
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