CN103314973A - 从冠瘤海鞘中提取抗卤虫活性成分的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开的是从冠瘤海鞘中提取抗卤虫活性成分的方法。我国南海有着丰富的海鞘资源，但对海鞘抗卤虫活性成份的研究目前还处于空白阶段。本发明通过从冠瘤海鞘中提取醇溶性提取物；制备冠瘤海鞘萃取物；冠瘤海鞘甾体粗晶的制备；石油醚相黄色油状馏分的GC-MS成分分析；等技术措施，对海鞘的乙醇浸膏进行了石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水的萃取后，又对石油醚相进行了成分分析，经过柱层析及色质联用仪的分析后，证实本发明的石油醚相中存在着甾体粗晶及12种化合物成份，这些成份均对杀灭卤虫有明显的活性。本发明得到的活性提取物和成分分析为冠瘤海鞘的研究提供了数据参考，为海洋药物的研究和开发提供了基础。

Description

从冠瘤海鞘中提取抗卤虫活性成分的方法

技术领域

本发明涉及从冠瘤海鞘中提取抗卤虫活性成分的方法，属于海洋天然产物化学领域。 

背景技术

海鞘(Ascidian)是尾索动物亚门(Uronordata)海鞘纲的尾索动物，主要分布在热带及亚热带海域，目前国内外已经对数种海鞘进行了化学成分研究，已发现海鞘类生物中含有生物碱类、肽类、吲哚类、重金属螯合剂、多硫化物、大环内酯、萜类等数十种化合物，且大部分具有较强的生理活性，如抗肿瘤、抗病毒、抗菌、诱导肌浆网释钙、抑制钙调蛋白活性等，因此，有关海鞘生理活性成分的研究正受到越来越多的研究者关注。我国南海有着丰富的海鞘资源，对海鞘化学成份的研究还有待深入进行，并且目前的研究还未关注到海鞘的抗卤虫活性成份,经过检索可知,海鞘中抗卤虫活性成份的研究目前还处于空白阶段，因此，提供一种海鞘抗卤虫活性成份的提取方法，对于进一步开发海鞘的药用价值是非常有意义的。 

发明内容

本发明的目的在于提供从冠瘤海鞘中提取抗卤虫活性成分的方法，本发明方法包括了冠瘤海鞘石油醚相的成分分析方法，冠瘤海鞘乙醇浸膏、各有机相和甾体粗晶的抗卤虫活性试验，明确了从冠瘤海鞘中提取抗卤虫活性成份的有效途径。 

为实现上述目的，本发明采取了下述技术方案：从冠瘤海鞘中提取抗卤虫活性成分的方法，主要技术步骤是： 

（1）从冠瘤海鞘中提取醇溶性提取物：取鲜冠瘤海鞘洗净，于组织捣碎机中捣碎匀浆，于冠瘤海鞘浆中加入冠瘤海鞘浆体积1-2倍量的90-95% 乙醇 ，在室温至4℃状态下，采用超声提取、微波提取、冷浸、渗漉、高压提取或回流提取的方式，提取1-4次，每次2-24小时，收集合并提取液，过滤，滤液用100 – 300hPa大气压减压浓缩至40℃热测时相对密度是1.2-1.3，得到冠瘤海鞘浸膏备用；

（2）制备冠瘤海鞘萃取物：于冠瘤海鞘浸膏中以1：6.8-7.2的重量比加入水并充分混悬，然后分别用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到三种萃取液，三种萃取液分别经100 – 300hPa大气压减压浓缩至40℃热测时相对密度是1.2-1.3，分别得到石油醚相，乙酸乙酯相、正丁醇相和水相备用；

（3）冠瘤海鞘甾体粗晶的制备：将石油醚相用甲醇以1：1的体积比溶解，然后用正相硅胶柱层析，用石油醚与乙酸乙酯以100-10：1 的体积比配成的洗脱液洗脱，洗脱液各馏分点板合并后，经100 – 300hPa大气压减压浓缩，得石油醚相白色固体馏分和黄色油状馏分两部分，石油醚相白色固体馏分经甲醇重结晶得白色晶体，查阅文献，对照核磁共振氢谱，鉴定其为甾体粗晶；

（4）石油醚相黄色油状馏分的GC-MS成分分析：取石油醚相黄色油状馏分，经甲酯化处理，用ThermoTrace GC ultra DSQ II色质联用仪分析，色谱柱：VF-5MS(30 m×0．25 ram)；电离源：70 eV；操作系统：Xcalibur；谱库NIST02；程序升温：50℃ 保持2 min，以每分钟5℃ 升至130℃, 25℃每分钟升至300℃，经上述条件分析后，鉴定出12种化合物：

采取上述措施的本发明，对乙醇浸膏进行了石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水的萃取后，又对萃取后的石油醚相进行了深入的成分分析，经过柱层析及色质联用仪的分析后，证实本发明的石油醚相中存在着甾体粗晶及12种化合物成份。

抗卤虫活性检测依照Solis改良法进行，情况如下：取24孔培养板，每孔加1 mL含卤虫幼体的溶液 (每孔20个卤虫)，各化合物设置50 μg/mL, 25 μg/mL, 10 μg/mL三个终浓度，同时设置空白对照组(加处理过的海水1 ml)和DMSO对照组 (含与测试样品相当浓度的DMSO)，每个浓度的样品设三个平行样，制成测试培养板，培养24 h后，记录卤虫死亡个体数目。    

结果评定：死亡率 % = 死亡个体平均数/个体总数 × 100 %。

通过上述方法测得本发明所得乙醇浸膏和各相萃取物，均对杀灭卤虫有明显的活性，其中乙酸乙酯相的活性最高，其次为石油醚相，在浓度为100μg/mL时，乙酸乙酯相和石油醚相对卤虫的致死率分别为66.5%和35.0%，石油醚相的甾体粗晶，在50μg/mL时的活性为石油醚相的3-3.2倍，并且随着浓度的升高杀虫率也升高，表现出浓度依赖性，可以为新药研发提供科学依据。 

    卤虫作为生物活性筛选的模型生物具有来源广泛、操作简单、所需化合物的量较少等优势，应用卤虫进行杀虫活性物质的筛选是一种成本低、效率高的方法，本发明的应用可以大大缩短新药创新的周期，对新药的研发具有重要意义。 

本发明的制备方法简单，成本低，对环境的污染小；得到的活性提取物和成分分析为冠瘤海鞘的研究提供了数据参考，为海洋药物的研究和开发提供了基础。 

附图说明

图1是本发明冠瘤海鞘石油醚相气质分析总离子流图谱。 

具体实施方式

实施例1

（1）冠瘤海鞘提取物的制备方法：

鲜海鞘洗净、去壳(提取后干重271.5 g)，于组织捣碎机中匀浆，经95％ 乙醇提取3次，每次1 d，过滤，合并两次提取液，减压浓缩后得浸膏(73.5 g)。浸膏用水分散后，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，减压浓缩后得到石油醚相(9.8 g)、乙酸乙酯相(6.5 g)、正丁醇相(2.7 g) 和水相（43.5g）。

（2）冠瘤海鞘石油醚相成分分析方法： 

将9.5 g石油醚相用甲醇以1：1的体积比溶解，然后用正相硅胶柱层析，石油醚：乙酸乙酯(100-10：1)洗脱，洗脱液减压蒸干后得到二个馏分，分别为白色固体和黄色油状馏分，白色固体经甲醇重结晶得白色晶体3.7克，根据氢谱，查阅文献，鉴定其为甾体粗晶，而黄色油状馏分则用GC-MS进行成分分析。

（3）石油醚相GC-MS成分分析： 

冠瘤海鞘石油醚相黄色油状馏分经甲酯化处理后，用ThermoTrace GC ultra DSQ II色质联用仪分析，色谱柱：VF-5MS(30 m×0．25 ram)；电离源：70 eV；操作系统：Xcalibur；谱库NIST02；程序升温：50℃ 保持2 min，以每分钟5℃ 升至130℃,25℃每分钟升至300℃。

经GC-MS分析，得冠瘤海鞘石油醚相总离子流图谱如图1所示，共检测到30个峰，总离子流色谱图中的各峰经质谱扫描后得到相应的质谱图，通过Xcalibur工作站NIST标准质谱图库进行检索，共鉴定出其中的12个化合物，均为首次从冠瘤海鞘中分得，结果见表1。 

表1 冠瘤海鞘石油醚相中低极性化合物的GC-MS分析 

Table 1 Chemical components in the petroleum ether extracts of S. canopus

GC-MS分析表明，石油醚相主要为低极性化合物，脂肪类化合物最多6个，以不饱和脂肪酸为主，主要有十六酸甲酯Methyl hexadecanoate、7顺-十六烯酸甲酯Methyl cis-7-hexadecenoate和9-甲基十七烷酸甲酯9-Methyl heptadecanoic acid, methyl ester，还有甾醇类化合物4个，全部为胆甾醇类，分别为3β-胆甾烷醇Cholestan-3beta-ol (VAN)、胆固醇Cholesterol、异胆酸乙酯Ethyl iso-allocholate 和24R,25二羟基维生素D3 24(R)-25-Dihydroxyvitamin D3，以及2个长链烷烃1,1-二甲氧基辛烷1,1-Dimethoxyoctane 和十九烯1-nonadecene (见表2)。

（4）抗卤虫活性测定方法： 

依照Solis改良法，取24孔培养板，每孔加1 mL含卤虫幼体的溶液 (每孔20个卤虫)，每个粗提物及各相浸膏样品设置100 μg/mL, 50 μg/mL, 20 μg/mL三个终浓度，各化合物设置50 μg/mL, 25 μg/mL, 10 μg/mL三个终浓度，同时设置空白对照组(加处理过的海水1 ml)和DMSO对照组 (含与测试样品相当浓度的DMSO)，每个浓度的样品设三个平行样，制成测试培养板，培养24 h后，记录卤虫死亡个体数目。    

结果评定：死亡率 % = 死亡个体平均数/个体总数 × 100 %。

致死活性检测结果表明，冠瘤海鞘乙醇提取物有明显的活性，在100μg/mL时，对卤虫的致死率为22.0％，经萃取后，乙酸乙酯相的活性最高，在100μg/mL，卤虫致死率分别为66.5%，其次为石油醚相，在100μg/mL时，卤虫致死率分别为35.0％ (见表2)，且冠瘤海鞘乙醇提取物和各相的卤虫致死率与浓度呈正相关。冠瘤海鞘石油醚相甾体粗晶在50μg/mL时的活性约为石油醚相的3.2倍，且其致死率随着浓度的升高而增大，呈现浓度依赖性。结果显示冠瘤海鞘甾体类化合物是冠瘤海鞘石油醚相的有效活性成分，也是冠瘤海鞘生物活性成分之一。 

表2 冠瘤海鞘乙醇提取物、各有机相和甾体粗晶的卤虫致死活性 

Claims (1)

1.从冠瘤海鞘中提取抗卤虫活性成分的方法，其特征在于所述方法的主要技术步骤是：

（1）从冠瘤海鞘中提取醇溶性提取物：取鲜冠瘤海鞘洗净，于组织捣碎机中捣碎匀浆，于冠瘤海鞘浆中加入冠瘤海鞘浆体积1-2倍量的90-95% 乙醇 ，在室温至4℃状态下，采用超声提取、微波提取、冷浸、渗漉、高压提取或回流提取的方式，提取1-4次，每次2-24小时，收集合并提取液，过滤，滤液用100 – 300hPa大气压减压浓缩至40℃热测时相对密度是1.2-1.3，得到冠瘤海鞘浸膏备用；

（2）制备冠瘤海鞘萃取物：于冠瘤海鞘浸膏中以1：6.8-7.2的重量比加入水并充分混悬，然后分别用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到三种萃取液，三种萃取液分别经100 – 300hPa大气压减压浓缩至40℃热测时相对密度是1.2-1.3，分别得到石油醚相，乙酸乙酯相、正丁醇相和水相备用；

（3）冠瘤海鞘甾体粗晶的制备：将石油醚相用甲醇以1：1的体积比溶解，然后用正相硅胶柱层析，用石油醚与乙酸乙酯以100-10：1 的体积比配成的洗脱液洗脱，洗脱液各馏分点板合并后，经100 – 300hPa大气压减压浓缩，得石油醚相白色固体馏分和黄色油状馏分两部分，石油醚相白色固体馏分经甲醇重结晶得白色晶体，查阅文献，对照核磁共振氢谱，鉴定其为甾体粗晶；

（4）石油醚相黄色油状馏分的GC-MS成分分析：取石油醚相黄色油状馏分，经甲酯化处理，用ThermoTrace GC ultra DSQ II色质联用仪分析，色谱柱：VF-5MS(30 m×0．25 ram)；电离源：70 eV；操作系统：Xcalibur；谱库NIST02；程序升温：50℃ 保持2 min，以每分钟5℃ 升至130℃, 25℃每分钟升至300℃，经上述条件分析后，鉴定出12种化合物：

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