CN103314951A - 一种适用于延长成年公兔精液常温保存时间的方法及稀释液 - Google Patents

Abstract

本发明本发明属于生物学领域，具体涉及一种适用于延长成年公兔精液常温保存时间的方法和专用稀释液。该方法是在葡－柠－卵基础稀释液中添加0.75mg/mL维生素C，用于精液常温保存。所述专用稀释液，是在葡－柠－卵基础稀释液中添加0.75mg/mL维生素C。本发明能有效延长成年公兔精液常温保存时间。

Description

一种适用于延长成年公兔精液常温保存时间的方法及稀释液

技术领域

本发明属于生物学领域，具体涉及一种适用于延长成年公兔精液常温保存时间的方法。

背景技术

人工授精技术是家畜繁殖改良工作中最经济科学的方法。该技术是对精液进行品质鉴定及稀释后保存一段时间，或直接输入发情母畜生殖道内，以代替自然交配的配种方法。近年来，随着兔规模化养殖的不断发展，人工授精技术在集约化兔场中得到普及推广与应用，并在降低饲养成本、提高繁殖效率中发挥了显著的作用。与兔人工授精技术相配套的兔精液常温保存技术也越来越受到人们的重视。

精液常温保存是将精液稀释后保存在一定变动幅度的室温下，利用一定范围的弱酸性环境抑制精子活动，减少其能量消耗，使精子保持在可逆性的静止状态而不丧失受精能力，达到保存精子的目的。常温保存无需特殊温控和制冷设备，操作程序简单，具有一定应用价值，特别适宜猪、兔等动物精液的保存。动物精液经稀释后能扩大精液量，利于精子的保存和运输，延长精子在体外的存活时间，增强其受精能力，充分提高优良种公兔的配种效率。因此，精液稀释液的配制是人工授精的一个重要环节。

精液保存时，如果精子暴露在有氧环境中，会发生氧化反应而产生活性氧（也称自由基），在活性氧浓度过高时影响精子质膜完整性及精子形态功能，还能破坏精子中的DNA结构，降低精子的活力和受精能力。因此，在稀释液中添加抗氧化物质来保护精子免受外界因素的损伤是一种有效可行的方法。目前，常用的抗氧化物质有超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、维生素类（如维生素C、维生素E）以及氨基酸类等。

目前，在关于维生素作为精液稀释液添加成分的相关研究报道中，有研究者报道了在精液常温保存时，精液稀释液中加入维生素B₁₂、维生素E，对羊及猪精液保存效果的影响。亦有研究者针对维生素C的作为精液稀释液添加成分，结合与其他药物联用，研究了相关稀释液对于牛、羊、猪、马等动物的精液冷冻保存和低温保存效果的影响。由于不同维生素在精液保存过程中的作用机理不尽相同，同时，各种动物精子的生理特性亦有差异，所以，从目前的研究情况来看，不同维生素在不同动物精液保存中应用的效果并不相同。

维生素C又名抗坏血酸，在机体内许多氧化还原反应中起重要作用。它具有强还原性，常被用作抗氧化剂。维生素C作为一种有效的自由基清除剂，添加于精液中可以有效维持精细胞基因结构的完整和防止精子磷脂发生过氧化，从而起到直接保护精子的作用和效能，而且，还可以通过保护其他抗氧化剂（如维生素E、不饱和脂肪酸以及抗氧化酶）间接保护精子。如维生素C可使氧化型的谷胱甘肽转变为还原型的谷胱甘肽，从而起到保护酶的活性基团-SH的作用。已有的一些研究结果表明，冷冻及低温保存条件下添加维生素C对畜禽精液品质有一定的影响。但有关维生素C对畜禽精液常温保存效果影响的研究报道目前国内外还尚属少见。特别是针对兔精液常温保存中单独添加抗氧化剂维生素C的研究尚未见有报道。

本研究目的在于利用维生素C作为精液稀释液的添加成分，建立一种适用于延长成年公兔精液常温保存时间的方法，以利于兔精液常温保存技术的普及推广。

发明内容

为了解决公兔精液常温保存的问题，本发明提供一种适用于延长成年公兔精液常温保存时间的稀释液及方法。

本发明所述的一种适用于延长成年公兔精液常温保存时间的方法，是在葡－柠－卵基础稀释液中添加0.75mg/mL维生素C，用于精液常温保存。

一种用于成年公兔精液常温保存稀释液，是葡－柠－卵基础稀释液中添加0.75mg/mL维生素C，所述葡－柠－卵基础稀释液配方为：葡萄糖3g，柠檬酸钠1.4g，双蒸水95mL，卵黄5mL，青霉素、链霉素各10万IU/100mL。

本发明利用成年新西兰白兔公兔，对其采精后，在精液稀释液（葡萄糖－柠檬酸钠－卵黄基础稀释液）中添加不同含量的抗氧化物维生素C（0mg/mL、0.25mg/mL、0.50mg/mL、0.75mg/mL、1.00mg/mL、1.50mg/mL和2.00mg/mL），研究其对成年新西兰白兔精液常温保存效果的影响，选出优化的维生素C添加含量，建立了一种方便快捷、经济实用的延长成年公兔精液常温保存时间的方法。

具体实施方式

1、试验动物选用15只同批出生、体质健康、体重接近、经精液品质检查合格的成年新西兰公兔作为试验兔。

2、试验分组葡－柠－卵精液基础稀释液：葡萄糖3g，柠檬酸钠1.4g，双蒸水95mL，卵黄5mL，青霉素、链霉素各10万IU/100mL。试验共分为七组：其中I组为对照组，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ组为试验组。

Ⅰ:基础稀释液+0mg/mL维生素C

Ⅱ:基础稀释液+0.25mg/mL维生素C

Ⅲ:基础稀释液+0.50mg/mL维生素C

Ⅳ:基础稀释液+0.75mg/mL维生素C

Ⅴ:基础稀释液+1.00mg/mL维生素C

Ⅵ:基础稀释液+1.50mg/mL维生素C

Ⅶ:基础稀释液+2.00mg/mL维生素C

3、精液的采集利用假阴道法一次性采集5只（一次试验）公兔精液，置于集精瓶中，立即送至实验室进行精液品质检查。

4、精液的稀释与保存将品质鉴定合格的精液除去少量絮状物和其它杂质，然后混合均匀以消除不同兔子间的个体差异。用移液器取7份精液，置于7个贮精瓶中，分别缓慢加入等温的两倍于精液量（稀释倍数根据精液密度确定）的不同稀释液，作为7个试验组，并轻轻摇动混匀。稀释结束后，立即进行精子活力检查并记录。

将已稀释精液标记、密封。避光保存于室温下。保存期间每隔6小时检查一次精子活力并记录，直至精子活力等于零为止。整个实验共重复5次完成。

5、测定指标精子存活时间越长，生存指数越大，说明精子活力越强，精液品质越好，受精能力越高。因此试验主要测定精子不同时间点的活力和精子的存活时间、生存指数三项指标，用于确定和评价兔精液常温保存稀释液中维生素C的最适添加量。

精子活力：指精液中呈直线前进运动的精子所占精子总数的百分率；

存活时间：指由开始检查时间起到倒数第二次检查之间所经历的时间，加上最后一次检查与倒数第二次检查间隔时间的一半的总和；

生存指数：指每前后两次检查的精子平均活力与两次检查间隔时间之积的和。

实施例1不同维生素C添加浓度稀释液对精子活力的影响

在葡－柠－卵基础稀释液中加入不同含量的维生素C，对公兔精液进行常温保存时，在每个检测时间点，随着维生素C添加含量的增加，精子活力呈现由上升到下降的趋势。当添加含量为0.50mg/mL和0.75mg/mL时，其对精子活力有明显提高作用，与其他各组相比，基本表现为差异显著或极显著（P<0.05或P<0.01）水平；但当维生素C添加含量为1.00mg/mL、1.50mg/mL和2.00mg/mL时，精子活力一般表现为显著或极显著低于0mg/mL组（对照组）；对于维生素C添加含量0.50mg/mL与0.75mg/mL相比，精子活力基本表现为差异不显著（P>0.05），但总体水平以0.75mg/mL组为高（见表1）。

表1不同稀释液对精子活力的影响

注：同列数据肩标相同小写字母的表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

实施例2不同维生素C添加浓度稀释液对精子存活时间和生存指数的影响

在葡－柠－卵基础稀释液中加入不同含量的维生素C，对公兔精液进行常温保存时，各组精子存活时间进行比较时，0.75mg/mL组显著高于对照组（P<0.05），0.25mg/mL组、0.50mg/mL组、1.00mg/mL组与对照组差异不显著（P>0.05），1.50mg/mL组、2.00mg/mL组极显著低于对照组（P<0.01）。对精子生存指数进行比较的结果表明，0.50mg/mL、0.75mg/mL极显著高于对照组（P<0.01），0.25mg/mL组与对照组差异不显著（P>0.05），1.00mg/mL组显著低于对照组（P<0.05），1.50mg/mL组、2.00mg/mL组极显著低于对照组（P<0.01）。从对精子存活时间和生存指数影响来看，0.75mg/mL维生素添加组可以取得最佳的效果（见表2）。

表2不同稀释液对精子存活时间和生存指数的影响

注：同列数据肩标相同小写字母的表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

综上研究结果，葡－柠－卵基础稀释液中添加0.75mg/mL维生素C，可以作为一种适用于延长成年公兔精液常温保存时间的方法。

Claims (2)

1.一种适用于延长成年公兔精液常温保存时间的方法，是在葡－柠－卵基础稀释液中添加0.75mg/mL维生素C，用于精液常温保存；所述葡－柠－卵基础稀释液配方为：葡萄糖3g，柠檬酸钠1.4g，双蒸水95mL，卵黄5mL，青霉素、链霉素各10万IU/100mL。

2.一种用于权利要求1所述方法的稀释液，其特征在于，是在葡－柠－卵基础稀释液中添加0.75mg/mL维生素C，所述葡－柠－卵基础稀释液配方为：葡萄糖3g，柠檬酸钠1.4g，双蒸水95mL，卵黄5mL，青霉素、链霉素各10万IU/100mL。