CN103308441A - 流式细胞仪光电信号峰值检测方法、装置及流式细胞仪 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细胞生物学技术领域，具体涉及一种流式细胞仪光电信号峰值检测方法、装置及流式细胞仪。本发明通过设定上行阈值、下行阈值及峰值门限，在确定一个峰值点后，可以根据上行阈值、下行阈值以及峰值门限连续对以后出现的峰值点进行判定，而不需要从外部输入清零信号；同时，本发明可以方便的获取峰值延时，利用峰值延时反推出峰值点出现的时刻。因此，本发明能够快速、精确的判定峰值点并提供该峰值点出现的时刻，为流式细胞仪的细胞亚群分类及延时充电分选提供依据。此外，本发明所提供的流式细胞仪光电信号峰值检测方法基于现场可编程逻辑门阵列运行，与基于单片机、DSP等微处理器件相比，编程难度更小、计算速度更快、运行更加稳定。

Description

流式细胞仪光电信号峰值检测方法、装置及流式细胞仪

技术领域

本发明涉及细胞生物学技术领域，具体涉及一种流式细胞仪光电信号峰值检测方法、流式细胞仪光电信号峰值检测装置及应用该流式细胞仪光电信号峰值检测装置的流式细胞仪。

背景技术

流式细胞仪是一种对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮以及显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。

如图1中所示的流式细胞仪，其工作流程主要包括：将待检测细胞染色后制成单细胞悬液的待检测样品1，然后在一定压力的作用下，将待检测样品1压入流动室；不含细胞的磷酸缓冲鞘液2在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待检测样品1的流向成一定角度，这样，鞘液2就能够包绕着待检测样品1高速流动，组成一个圆形的流束，待检测细胞在鞘液2的包被下呈单行排列，依次通过检测区域。流式细胞仪可同时进行多个参数的测量，测量数据主要来自特异性荧光信号以及非荧光散射信号。测量是在测量区进行的，所谓测量区是指入射激光束4和从流动室的喷嘴3喷出的液流束的垂直相交点。液流束中央的单个细胞通过测量区时，受到入射激光束4的照射，会向立体角为2π的整个空间散射光线，散射光的波长和入射激激光束的波长相同；散射光的强度及其空间分布与细胞的大小、形态、质膜以及细胞内部结构密切相关，因为这些生物学参数和细胞对光线的反射、折射等光学特性有关。未遭受任何损坏的细胞对光线都具有特征性的散射，因此，可以利用不同的散射光信号直接对不经染色的活细胞进行分析和分选。经过固定的和染色处理的细胞由于光学特性的改变，其散射光信号与不经染色的活细胞有所不同。散射光不仅与作为散射中心的细胞的参数相关，还与散射角以及收集散射光线的立体角等非生物因素有关。在流式细胞仪的测量中，通常使用以下两种散射方向的散射光测量：前向散射（FSC，Forward Scatter），又称0角散射,以及侧向散射（SSC，Side Scatter），又称90角散射；这里所指的角度是入射激光束4照射方向与收集散射光信号的光电倍增管轴向方向之间所成的角度。一般来说，前向散射光5的强度与细胞的形态大小有关，对于同种细胞群体，随着细胞截面积的增大而增大；例如，对于球形活细胞，经实验表明在小立体角范围内基本上和截面积大小成线性关系，对于形状复杂具有取向性的细胞，则可能差异性很大，尤其需要注意。侧向散射光6的测量主要用来获取有关细胞内部精细结构的颗粒性质的有关信息；侧向散射光6虽然也与细胞的形状以及大小有关，但它对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，同时也能够对细胞质内部较大颗粒做出灵敏的反应。

在实际使用中，首先要对散射光信号进行测量。当散射光信号分析与荧光探针联合使用时，可以鉴别出待检测样品中被染色和未被染色的细胞；散射光信号测量最有效的用途之一是可以从非均一的群体中鉴别出某些亚群。因此，被检测细胞的前向散射光信号和侧向散射光信号的测量是流式细胞仪测量的一个关键技术环节。图2以及图3中示出了流式细胞仪前向散射光信号51和侧向散射光信号61的标准波形，其中信号的峰值是形成统计散点图的关键信息。然而，现有技术中对流式细胞仪的分选速度要求越来越高，达到每秒钟上万个细胞，前向散射光信号51和侧向散射光信号61的峰值间隔时间很短，通常小于100毫秒。因此，流式细胞仪研究中的一个重要的内容，就是如何提供一种能够对前向散射光信号51和侧向散射光信号61的峰值进行快速、精确测量方法。

现有技术中的峰值检测方法，大致可以分为模拟检测方法和数字检测方法两个大类。模拟检测方法主要是利用模拟电路的方法得到峰值电压后再进行采样，得到峰值的大小；数字检测方法主要是首先对待检测信号进行采样得到数字信号，再对数字信号分析得到峰值。

模拟检测方法的核心是模拟峰值保持电路，输入需要检测的信号，电路以模拟信号的形式输出检测到的峰值，直到清零信号到来。峰值保持电路的基本原理是输入信号与输出信号的电压通过比较器，比较强的比较结果通过二极管对一个电容充电得到输出电压。当输入电压大于峰值输出时，二极管导通对电容充电，输出电压升高，到达峰值下降时，二极管关断，电容不会放电输出，峰值得到保持；当给出清零信号时，电容两端接通放电，输出重置为零。目前常见的模拟检测方法可以满足对窄脉冲的检测需求，但是由于反馈系统响应时间的问题，会造成峰值检测的线性度不佳，最后得到的峰值检测结果可能存在误差；而且，在流式细胞仪的应用中，还需要精确获得峰值出现的时间，硬件方法难以准确获得峰值出现的时间，如果需要获得峰值出现时间，则需要增加额外的部件。

数字检测方法的核心是峰值检测算法，输入信号转换为数字信号后，通过计算机或嵌入式处理器根据峰值检测算法进行计算，直接得到当前的峰值。峰值检测的算法很多，大致可以分为两类：一是针对复杂信号（例如：非周期性、叠加大量噪声等）采用小波变换、Hilbert（希尔伯特）变换、人工神经网络、滤波、插值或者分形等方法进行计算，通常要占用大量的硬件资源，并会消耗较长的时间，检测效率不高；二是针对简单信号（例如：周期性、单峰等）采用简单的幅值比较方法，简单的幅值比较方法的运算速度快，但是导致抗干扰能力差，不能抑制噪声，信号上噪声引起的微小波动也会被误检为峰值，不适用于类脉冲信号的峰值测量。数字检测方法的关键参数是运算时间，现有技术中一种比较有代表性的常用峰值检测算法是采取移动窗口计算平均值和方差值，根据平均值和方差值计算峰值门限，以是否超过峰值门限作为峰值判断的依据。该方法的计算量较大，难以在流式细胞仪应用中实现实时判断信号峰值，而且该方法在窗口交接处存在重复检测的问题。

发明内容

（一）要解决的技术问题

本发明的目的在于提供一种用于流式细胞仪前向散射光信号和侧向散射光信号峰值检测方法，用于快速、精确的判定峰值点并提供该峰值点出现的时刻；进一步的，本发明还提供了一种流式细胞仪光电信号峰值检测装置及应用该流式细胞仪光电信号峰值检测装置的流式细胞仪。

（二）技术方案

本发明技术方案如下：

一种流式细胞仪光电信号峰值检测方法，包括步骤：

S1.设定上行阈值、下行阈值以及峰值门限；

S2.确定一个峰值点为基准峰值点；

S3.对于所述基准峰值点后的极大值点，若该极大值点与该极大值点和基准峰值点间的最小值点的振幅差大于所述上行阈值、该极大值点与该极大值点后的最小值点的振幅差大于所述下行阈值，且该极大值点的振幅大于所述峰值门限，则判定该极大值点为峰值点；

S4.以检测到的峰值点为新的基准峰值点，并跳转至步骤S3。

优选的，所述步骤S3中，对于所述极大值点与所述极大值点后的最小值点之间的下降沿上的每个点，逐点检测该点与所述极大值点的振幅差：若大于所述下行阈值，则在该时刻判定所述极大值点为峰值点。

优选的，所述步骤S3还包括：

计算从检测到所述极大值点的时刻到判定所述极大值点为峰值点的时刻之间的时间，得到峰值延时；

将判定所述极大值点为峰值点的时刻与所述峰值延时做差反推出所述峰值点出现的时刻。

优选的，所述流式细胞仪光电信号峰值检测方法基于现场可编程逻辑门阵列实现。

本发明还提供了一种流式细胞仪光电信号峰值检测装置：

一种流式细胞仪光电信号峰值检测装置，包括接收前向散射光信号以及侧向散射光信号的模数转换器，所述模数转换器连接至现场可编程逻辑门阵列；所述现场可编程逻辑门阵列根据上述任意一种流式细胞仪光电信号峰值检测方法检测峰值点以及定位峰值点出现的时刻。

优选的，所述模数转换器的采样精度为12位。

优选的，所述模数转换器的转换速率为40MHz，所述现场可编程逻辑门阵列的工作频率为40MHz。

优选的，所述前向散射光信号以及侧向散射光信号经由光电倍增管输入前置放大器，通过前置放大器输入所述模数转换器。

本发明还提供了一种包括上述任意一种流式细胞仪光电信号峰值检测装置的流式细胞仪。

（三）有益效果

本发明实施例所提供的流式细胞仪光电信号峰值检测方法，通过设定上行阈值、下行阈值以及峰值门限，在确定一个峰值点后，可以根据上行阈值、下行阈值以及峰值门限连续对以后出现的峰值点进行判定，而不需要从外部输入清零信号；同时，本发明可以方便的获取峰值延时，利用峰值延时反推出峰值点出现的时刻。因此，本发明能够快速、精确的判定峰值点并提供该峰值点出现的时刻，为流式细胞仪的细胞亚群分类以及延时充电分选提供依据。此外，本发明所提供的流式细胞仪光电信号峰值检测方法基于现场可编程逻辑门阵列运行，与基于单片机、DSP等微处理器件相比，编程难度更小、计算速度更快、运行更加稳定。

附图说明

图1是现有技术中一种流式细胞仪的结构示意图；

图2是前向散射光信号及侧向散射光信号的标准波形图；

图3是图2中A区域的局部放大图；

图4是本发明实施例中各参数和输入信号以及输出信号之间的关系图；

图5是本发明实施例中输出信号的变化规律示意图；

图6是本发明实施例中标准颗粒分选散点图；

图7是本发明实施例中牛液细胞分选散点图。

图中：1：待检测样品；2：鞘液；3：喷嘴；4：入射激光束；5：前向散射光；51：前向散射光信号；6：侧向散射光；61：侧向散射光信号。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式做进一步描述。以下实施例仅用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本实施例中首先提供了一种流式细胞仪光电信号峰值检测装置，该流式细胞仪光电信号峰值检测装置主要包括接收前向散射光信号以及侧向散射光信号的高速高分辨率模数转换器，模数转换器连接至现场可编程逻辑门阵列，利用现场可编程逻辑门阵列和高速高分辨率模数转换器实现流式细胞仪前向散射光信号和侧向散射光信号的峰值点判定，并定位出峰值点出现的时刻。流式细胞仪前向散射光信号和侧向散射光信号为脉宽约为1微秒的正脉冲，出现间隔时间不定，在几微秒到几毫秒之间变化，前向散射光信号以及侧向散射光信号经由光电倍增管输入前置放大器，经过前置放大器后的脉冲幅值在1V左右，然后输入模数转换器。本实施例中采用转换速率为40MHz的数模转换器，以12位的采样精度采集两路散射光信号，送入现场可编程逻辑门阵列中进行峰值检测运算，现场可编程逻辑门阵列工作在40MHz时钟下，以40MHz的工作频率判断峰值点是否出现。

其中，可编程逻辑门阵列根据下述流式细胞仪光电信号峰值检测方法实现前向散射光信号和侧向散射光信号的峰值点判定，并定位出峰值点出现的时刻。该流式细胞仪光电信号峰值检测方法主要包括以下步骤：

S1.根据散射光信号的特点，设定上行阈值，表示信号脉冲上行最小幅值，下行阈值，表示信号脉冲下行最小幅值，以及峰值门限，表示有效的最小峰值，利用这三个参数区别正常的散射光信号和噪声波动；

S2.确定一个峰值点为基准峰值点；

S3.对于基准峰值点后的极大值点，若该极大值点与该极大值点和基准峰值点间的最小值点的振幅差大于上行阈值、该极大值点与该极大值点后的最小值点的振幅差大于下行阈值，且该极大值点的振幅大于峰值门限，则判定该极大值点为峰值点；

进一步的，步骤S3还包括：

计算从检测到该极大值点的时刻到判定该极大值点为峰值点的时刻之间的时间，得到峰值延时；

将判定该极大值点为峰值点的时刻与峰值延时做差反推出峰值点出现的时刻；

S4.以检测到的峰值点为新的基准峰值点，并跳转至步骤S3。

进一步的，步骤S3中，对于该极大值点与该极大值点后的最小值点之间的下降沿上的每个点，逐点检测该点与该极大值点的振幅差：若大于下行阈值，则在该时刻判定极大值点为峰值点。

具体的运算中，现场可编程逻辑门阵列读取到模数转换器给出的数字信号，利用现场可编程逻辑门阵列并行计算的特点，一个工作周期内，所有中间变量和输出信号根据输入信号的值进行同步改变。采用伪码描述根据上述流式细胞仪光电信号峰值检测方法进行的逐点运算过程如下：

算法中各变量以及参数说明如表1中所示；

表1 各变量以及参数说明表

变量名

I/O

类型

描述

AI	输入信号	16位无符号整数	输入光电倍增管信号
				Up	参数	16位无符号整数	上行阈值
Down	参数	16位无符号整数	下行阈值
				Thres	参数	16位无符号整数	峰值门限
Cmax	中间变量	16位无符号整数	基准峰值点峰值大小
				Cmin	中间变量	16位无符号整数	当前最小值
Updone	中间变量	布尔量	上升完成
				Peak_Detected	输出信号	布尔量	检测到峰值
Peak_Val	输出信号	16位无符号整数	峰值大小
				Peak_Delay	输出信号	16位无符号整数	峰值延时

注：x是变量则x^-1表示上一检测周期x的值，可以利用锁存器获得。

各参数和输入信号以及输出信号之间的关系如图4中所示，该算法可以在判定到一个峰值点出现后连续对后来的峰值点进行判定，而不需要从外部输入清零信号，从而实现对非周期信号的峰值点的快速、高效、精准的判断。图示中出现了三个极大值点A、B、C，其中极大值点A由于其下降幅度小于设定的参数下行阈值而被认为是干扰信号而非峰值点，极大值点B和极大值点C均可以被正常识别为峰值点。

输出信号的变化规律如图5中所示，输入信号是叠加了噪声的周期性sinc信号时，经过可知的延时Peak_Delay后，Peak_Val可以跟随当前的峰值信号，同时该检测周期的Peak_Detected会变为True。所以检测到Peak_Detected上升沿时，向前推Peak_Delay可以得到峰值点出现的时刻，后续电路便可根据这三个信号获得峰值的大小和峰值出现的时刻。

峰值检测结果上传到计算机等处理中心可以做出流式图，将流式图中框选后的范围发送回现场可编程门阵列，当检测到Peak_Detected上升沿时，则认为出现了一个细胞，将这时的峰值与框选范围做比较，便可以判断细胞类型，然后根据Peak_Delay数值反推出峰值出现的时刻，再通过设置合适的延时，在适当时刻为喷嘴中的液体充电，便可以完成细胞的分选。

本实施例中还提供了一种包括上述流式细胞仪光电信号峰值检测装置的流式细胞仪。

下面结合实际操作流程对本发明中的流式细胞仪加以详细说明：

实例一：采用标准颗粒进行流式分选

将标准颗粒样液加压上样，调节光路和液压系统使从喷嘴喷出的液体分断成单独的液滴；调节流式细胞仪的压电振荡频率为61960Hz、幅值为24.45V、相位为90°，充电电压参数设置是正偏转电压为80V，负偏转电压为-80V，此时液流偏转时不分散；光电倍增管的信号通过高速模数转换器采集后进入现场可编程逻辑门阵列，得到根据前向散射光信号和侧向散射光信号的峰值做出的流式图，在流式图中框选信号的主体进行分选，分选模式设置为纯化分选；然后进行充电延时调节，尝试不同的充电延时周期和充电细调组合，最后确定最佳延时为23+13/16微秒。在显微镜下观察每10个峰值中实际分选到的细胞个数，分选5次，分选到的细胞个数为8,10,9,8,8。重复该实验，能分选到的细胞个数平均在8以上，说明利用本发明中的方法及装置判断峰值出现的准确性和时间的精确性达到分选式流式细胞仪的应用要求。具体如图6中所示。

实例二：采用牛液细胞进行流式分选

保持流式细胞仪的工作状态与标准颗粒调试液滴延时的结果不变，压电振荡频率为61960Hz、幅值为24.45V、相位为90°，充电电压参数设置是正偏转电压为80V，负偏转电压为-80V。光电倍增管的信号通过高速模数转换器采集后进入现场可编程逻辑门阵列，得到根据前向散射光信号和侧向散射光信号的峰值做出的流式图，在流式图中可以区分两种不同类型的细胞，分别分布在流式图的不同区域，框选其中一种细胞进行分选，分选模式设置为纯化分选，然后开始分选。分选结果良好，可以达到80%以上分选率。说明利用本发明中的方法及装置判断峰值出现的准确性和时间的精确性达到分选式流式细胞仪的应用要求。具体如图7中所示。

本发明流式细胞仪光电信号峰值检测方法，能够通过现场可编程逻辑门阵列实现，在0.5微秒时间内可以精确测量定位流式细胞仪前向散射光和侧向散射光的峰值，准确率达到99.99%。此外，本发明方法基于现场可编程逻辑门阵列运行，与基于单片机、DSP（Digital SignalProcessing，数字信号处理）等微处理器件相比，编程难度更小、计算速度更快、运行更加稳定。

以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型，因此所有等同的技术方案也属于本发明的保护范畴。

Claims (9)

1.一种流式细胞仪光电信号峰值检测方法，其特征在于，包括步骤：

S1.设定上行阈值、下行阈值以及峰值门限；

S2.确定一个峰值点为基准峰值点；

S3.对于所述基准峰值点后的极大值点，若该极大值点与该极大值点和基准峰值点间的最小值点的振幅差大于所述上行阈值、该极大值点与该极大值点后的最小值点的振幅差大于所述下行阈值，且该极大值点的振幅大于所述峰值门限，则判定该极大值点为峰值点；

S4.以检测到的峰值点为新的基准峰值点，并跳转至步骤S3。

2.根据权利要求1所述的流式细胞仪光电信号峰值检测方法，其特征在于，所述步骤S3中，对于所述极大值点与所述极大值点后的最小值点之间的下降沿上的每个点，逐点检测该点与所述极大值点的振幅差：若大于所述下行阈值，则在该时刻判定所述极大值点为峰值点。

3.根据权利要求2所述的流式细胞仪光电信号峰值检测方法，其特征在于，所述步骤S3还包括：

计算从检测到所述极大值点的时刻到判定所述极大值点为峰值点的时刻之间的时间，得到峰值延时；

将判定所述极大值点为峰值点的时刻与所述峰值延时做差反推出所述峰值点出现的时刻。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的流式细胞仪光电信号峰值检测方法，其特征在于，所述流式细胞仪光电信号峰值检测方法基于现场可编程逻辑门阵列实现。

5.一种流式细胞仪光电信号峰值检测装置，其特征在于，包括接收前向散射光信号以及侧向散射光信号的模数转换器，所述模数转换器连接至现场可编程逻辑门阵列；所述现场可编程逻辑门阵列根据如权利要求1-4任意一项所述的流式细胞仪光电信号峰值检测方法检测峰值点以及定位峰值点出现的时刻。

6.根据权利要求5所述的流式细胞仪光电信号峰值检测装置，其特征在于，所述模数转换器的采样精度为12位。

7.根据权利要求5或6所述的流式细胞仪光电信号峰值检测装置，其特征在于，所述模数转换器的转换速率为40MHz，所述现场可编程逻辑门阵列的工作频率为40MHz。

8.根据权利要求5或6所述的流式细胞仪光电信号峰值检测装置，其特征在于，所述前向散射光信号以及侧向散射光信号经由光电倍增管输入前置放大器，通过前置放大器输入所述模数转换器。

9.一种流式细胞仪，其特征在于，包括权利要求5-8任意一项所述的流式细胞仪光电信号峰值检测装置。

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