CN103305562A - 一种对硝基苯胺生产工艺 - Google Patents
一种对硝基苯胺生产工艺 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103305562A CN103305562A CN2013102722864A CN201310272286A CN103305562A CN 103305562 A CN103305562 A CN 103305562A CN 2013102722864 A CN2013102722864 A CN 2013102722864A CN 201310272286 A CN201310272286 A CN 201310272286A CN 103305562 A CN103305562 A CN 103305562A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- eps
- nitroaniline
- subtilis
- extracellular polymeric
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 4-nitroaniline Chemical compound NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 99
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 65
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims abstract description 17
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims abstract description 17
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 9
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 63
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 62
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 57
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 48
- FYFDQJRXFWGIBS-UHFFFAOYSA-N 1,4-dinitrobenzene Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 FYFDQJRXFWGIBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 34
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 29
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 26
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 24
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 21
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 21
- 238000000967 suction filtration Methods 0.000 claims description 21
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 21
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 20
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 20
- 230000000050 nutritive effect Effects 0.000 claims description 20
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 18
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 16
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 15
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 14
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 14
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 14
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 14
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 13
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 claims description 13
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 13
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 claims description 13
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 12
- 230000003534 oscillatory effect Effects 0.000 claims description 12
- 230000008901 benefit Effects 0.000 claims description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 8
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 8
- NQASWDLHZOMGSS-UHFFFAOYSA-N CO.[N+](=O)([O-])C1=CC=C(N)C=C1 Chemical compound CO.[N+](=O)([O-])C1=CC=C(N)C=C1 NQASWDLHZOMGSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 7
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 claims description 7
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 7
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 7
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 claims description 7
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 7
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 7
- 230000035752 proliferative phase Effects 0.000 claims description 7
- 238000002390 rotary evaporation Methods 0.000 claims description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 7
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 7
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 7
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- XIFJZJPMHNUGRA-UHFFFAOYSA-N n-methyl-4-nitroaniline Chemical compound CNC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XIFJZJPMHNUGRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 4
- 239000002699 waste material Substances 0.000 claims description 4
- 238000011177 media preparation Methods 0.000 claims description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 7
- WDCYWAQPCXBPJA-UHFFFAOYSA-N 1,3-dinitrobenzene Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=CC([N+]([O-])=O)=C1 WDCYWAQPCXBPJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 abstract 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 abstract 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 abstract 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 125000000636 p-nitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1*)[N+]([O-])=O 0.000 description 8
- -1 ATT Chemical compound 0.000 description 7
- QJZYHAIUNVAGQP-UHFFFAOYSA-N 3-nitrobicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic acid Chemical compound C1C2C=CC1C(C(=O)O)C2(C(O)=O)[N+]([O-])=O QJZYHAIUNVAGQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N Aniline Chemical compound NC1=CC=CC=C1 PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 239000004021 humic acid Substances 0.000 description 6
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 235000011121 sodium hydroxide Nutrition 0.000 description 6
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 5
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 5
- IZUKQUVSCNEFMJ-UHFFFAOYSA-N 1,2-dinitrobenzene Chemical group [O-][N+](=O)C1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O IZUKQUVSCNEFMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FZERHIULMFGESH-UHFFFAOYSA-N N-phenylacetamide Chemical compound CC(=O)NC1=CC=CC=C1 FZERHIULMFGESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 3
- 150000004053 quinones Chemical group 0.000 description 3
- CZGCEKJOLUNIFY-UHFFFAOYSA-N 4-Chloronitrobenzene Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 CZGCEKJOLUNIFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001413 acetanilide Drugs 0.000 description 2
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 2
- AOMZHDJXSYHPKS-UHFFFAOYSA-L disodium 4-amino-5-hydroxy-3-[(4-nitrophenyl)diazenyl]-6-phenyldiazenylnaphthalene-2,7-disulfonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)(=O)C1=CC2=CC(S([O-])(=O)=O)=C(N=NC=3C=CC=CC=3)C(O)=C2C(N)=C1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 AOMZHDJXSYHPKS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- BQHRKYUXVHKLLZ-UHFFFAOYSA-M sodium 7-amino-2-[[4-[(4-aminophenyl)diazenyl]-2-methoxy-5-methylphenyl]diazenyl]-3-sulfonaphthalen-1-olate Chemical compound [Na+].COc1cc(N=Nc2ccc(N)cc2)c(C)cc1N=Nc1c(O)c2cc(N)ccc2cc1S([O-])(=O)=O BQHRKYUXVHKLLZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 108010046845 tryptones Proteins 0.000 description 2
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NSGVPXKWKUZSAY-UHFFFAOYSA-N 1-nitro-2-nitrosobenzene Chemical class [O-][N+](=O)C1=CC=CC=C1N=O NSGVPXKWKUZSAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ROPYWXVRNREIQD-UHFFFAOYSA-N 2-[n-(2-cyanoethyl)-4-[(2,6-dichloro-4-nitrophenyl)diazenyl]anilino]ethyl acetate Chemical compound C1=CC(N(CCC#N)CCOC(=O)C)=CC=C1N=NC1=C(Cl)C=C([N+]([O-])=O)C=C1Cl ROPYWXVRNREIQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BUMGQSCPTLELLS-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-5-nitrophenol Chemical compound OC1=CC([N+]([O-])=O)=CC=C1Cl BUMGQSCPTLELLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- STOOUUMSJPLRNI-UHFFFAOYSA-N 5-amino-4-hydroxy-3-[[4-[4-[(4-hydroxyphenyl)diazenyl]phenyl]phenyl]diazenyl]-6-[(4-nitrophenyl)diazenyl]naphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=C(N=NC=3C=CC(=CC=3)C=3C=CC(=CC=3)N=NC=3C=CC(O)=CC=3)C(O)=C2C(N)=C1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 STOOUUMSJPLRNI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 240000008564 Boehmeria nivea Species 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- VTFJNXAPZODVGC-UHFFFAOYSA-N N.[N+](=O)([O-])C1=CC=C(C=C1)Cl Chemical compound N.[N+](=O)([O-])C1=CC=C(C=C1)Cl VTFJNXAPZODVGC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124033 Salix Species 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006035 Tryptophane Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000003712 anti-aging effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 125000000664 diazo group Chemical group [N-]=[N+]=[*] 0.000 description 1
- BIXZHMJUSMUDOQ-UHFFFAOYSA-N dichloran Chemical compound NC1=C(Cl)C=C([N+]([O-])=O)C=C1Cl BIXZHMJUSMUDOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940004812 dicloran Drugs 0.000 description 1
- UZZFFIUHUDOYPS-UHFFFAOYSA-L disodium 4-amino-3,6-bis[[4-[(2,4-diaminophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-5-oxido-7-sulfonaphthalene-2-sulfonate Chemical compound [Na+].[Na+].Nc1ccc(N=Nc2ccc(cc2)N=Nc2c(N)c3c(O)c(N=Nc4ccc(cc4)N=Nc4ccc(N)cc4N)c(cc3cc2S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)c(N)c1 UZZFFIUHUDOYPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- DDLNJHAAABRHFY-UHFFFAOYSA-L disodium 8-amino-7-[[4-[4-[(4-oxidophenyl)diazenyl]phenyl]phenyl]diazenyl]-2-phenyldiazenyl-3,6-disulfonaphthalen-1-olate Chemical compound [Na+].[Na+].NC1=C(C(=CC2=CC(=C(C(=C12)O)N=NC1=CC=CC=C1)S(=O)(=O)[O-])S(=O)(=O)[O-])N=NC1=CC=C(C=C1)C1=CC=C(C=C1)N=NC1=CC=C(C=C1)O DDLNJHAAABRHFY-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- TUXJTJITXCHUEL-UHFFFAOYSA-N disperse red 11 Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=C(N)C(OC)=CC(N)=C3C(=O)C2=C1 TUXJTJITXCHUEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006480 glucose mineral salts medium Substances 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003808 methanol extraction Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- RJMUSRYZPJIFPJ-UHFFFAOYSA-N niclosamide Chemical compound OC1=CC=C(Cl)C=C1C(=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1Cl RJMUSRYZPJIFPJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001920 niclosamide Drugs 0.000 description 1
- KJONHKAYOJNZEC-UHFFFAOYSA-N nitrazepam Chemical compound C12=CC([N+](=O)[O-])=CC=C2NC(=O)CN=C1C1=CC=CC=C1 KJONHKAYOJNZEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- LQNUZADURLCDLV-UHFFFAOYSA-N nitrobenzene Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=CC=C1 LQNUZADURLCDLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006053 organic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 239000006273 synthetic pesticide Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 1
- 239000000273 veterinary drug Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明主要通过枯草芽孢杆菌胞外聚合物与二硝基苯常温反应生成对硝基苯胺。由于枯草芽孢杆菌易于大量培养，且本发明采用剔除有致病基因的工程枯草芽孢杆菌种来生产对硝基苯胺，所以是一种藉以生物工程为基础、以绿色环保为特点的对硝基苯胺制备工艺。以枯草芽孢杆菌胞外聚合物为前驱体采用绿色工艺生产对硝基苯胺。这些EPS既能起到还原剂的作用，又能起到电子传递的生物电子穿梭体作用。因此，是不可多得的一种对硝基苯胺制备材料，具有极高的应用和推广价值。
Description
技术领域
本发明属于生物化学领域，具体涉及微生物胞外聚合物制备硝基苯胺的技术领域，主要通过枯草芽孢杆菌胞外聚合物与对二硝基苯常温反应生成对硝基苯胺。
背景技术
对硝基苯胺是染料工业极为重要的中间体，可直接用于合成品种有：直接耐晒黑G，直接绿B、BE、2B-2N，黑绿NB，直接灰D、酸性黑10B、ATT，分散红P-4G、阳离深黄2RL，毛皮黑D，对苯二胺，邻氯对硝基苯胺，2.6-二氯-4硝基苯胺，5-硝基-2-氯苯酚等，也可合成农药氯硝胺，医药卡柳肿；同时还是防老剂，光稳定剂，显影剂等的原料。国外以对硝基苯胺为重氮组份合成的分散染料有：C，I分散橙1，3，7，21等、红色1，2，7，17等，蓝259；黑2，3，28，29等。其中，该品即冰染染料大红GG色基，可作黑色盐K，供棉麻织物染色、印花之用。但主要用作偶氮染料中间体，如用于生产直接墨绿B、酸性媒介棕G、酸性黑10B、酸性毛元ATT、毛皮黑D和直接灰D等。还可作农药和兽药的中间体，在医药工业中可用于生产氯硝柳胺、卡巴肿、硝基安定、喹啉脲硫酸盐等。还可用于生产对苯二胺；抗氧化剂和防腐剂等。
对硝基苯胺的生产工艺，一般采用乙酰苯胺硝化、水解的方法，也可用对硝基氯苯氨解的方法。如：以乙酰苯胺为原料，经硝化、水解而制得。其中化学反应试剂需要90％硝酸、硫酸、液碱等；如以对硝基氯苯为原料，可采用高压釜间歇法生产，也可采用管道反应器连续化生产，原料是氨水和对硝基氯苯。这些方法一方面耗费巨大的能源；另一方面，大量化学试剂的使用可能会造成严重的水体、土壤、和空气污染。因此，发展一种成本低、低能耗、环境友好、工艺简单的对硝基苯胺生产工艺是亟待解决的问题。
我们的大量实验研究表明：利用实验室M9培养基培养的枯草芽孢杆菌所获得的胞外聚合物，能够把对二硝基苯化合物中二硝基基团中的一个还原成氨基(图3)，并生成稳定的对硝基苯胺化合物。因此运用这一简单、环保、可再生的胞外聚合物，在温和溶液相中与对硝基苯反应生成对硝基苯胺，这一技术具有重要的科学意义和实际应用价值。
枯草芽孢杆菌的培养采用M9培养基，以低成本的无机盐为主。同时，该菌具有廉价、易得、环境友好、可再生等优势。所产生的胞外聚合物，其主要成分为蛋白质、糖类、少量腐殖酸和核酸类物质，也是是取之不尽用之不竭的可再生资源，具有极大的经济开发价值。由于EPS腐殖酸和蛋白质的存在，其内在疏水性官能和弱极性官能结构能吸附捕捉对二硝基苯化合物，使其进入反应位。EPS中醌类结构能传递还原糖醛基电子至硝基位，选择性地还地还原二硝基官能团中的一个至苯胺，另外一个仍旧保留硝基结构。这些EPS既能起到还原剂的作用，又能起到电子传递的生物电子穿梭体作用。因此，是不可多得的一种对硝基苯胺制备材料，具有极高的应用和推广价值。
本发明主要通过枯草芽孢杆菌胞外聚合物与二硝基苯常温反应生成对硝基苯胺。由于枯草芽孢杆菌易于大量培养，且本专利采用无致病性的枯草芽孢杆菌种来生产对硝基苯胺，所以是一种藉以生物工程为基础、以绿色环保为特点的对硝基苯胺制备工艺。
发明内容
本发明是一种低成本、低能耗、环境友好、工艺简单的对硝基苯胺生产工艺，具体技术方案如下：
一种对硝基苯胺生产工艺，即一种对硝基苯胺(或4-硝基苯胺，英文名：p-nitroaniline)的生产步骤如下，
(1)M9培养基制备：
该工艺使用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)生物菌种作为微生物胞外聚合物(EPS)来源，属于非致病性菌种，优点是生长速度快，24小时内即进入生长稳定期，EPS即ExtracellularPolymeric Substances的缩写；是由微生物所分泌的一种具黏性和具保护作用的基质，通常堆积在细胞的外围；主由蛋白质和多糖等活性成分构成；
该枯草芽孢杆菌生物菌种使用M9培养基培养，所述M9培养基制备步骤如下，
1)M9主培养基配方为：单位为毫摩尔每升，在1L烧杯中加入450mL蒸馏水和以下各成份配成溶液：NH4Cl0.5g，Na2HPO43.0g，KH2PO41.5g，用NaOH调整pH到7.0-7.5并将溶液体积调整至490-500mL，制得主培养基；
2)制备M9营养液各50ml，如下：1mol/L MgSO4.7H2O50ml；15-30％(w/v)Dextrose葡萄糖50ml，w/v即质量浓度；和1mol/L CaCl250ml；
将上述M9主培养基和3种50ml的M9营养液分别通过0.45um滤膜抽滤除菌，或者分别在120℃高压灭菌20分钟，灭菌后，无菌条件下取浓度为1mol/L的1mL MgSO4·7H2O、20％(w/v)的5ml葡萄糖及lmol/L的50mL氯化钙的营养液分别加入到M9主培养基，充分混匀制得M9培养基备用；
(2)枯草芽孢杆菌的培养及其胞外聚合物EPS提取
该方法使用枯草芽孢杆菌生物菌种作为微生物胞外聚合物(EPS)来源；枯草芽孢杆菌首先在无菌环境接种至所述M9培养基中，接种比为5∶1000～5000；接种后的培养基在37±1℃，150转/分钟培养箱中培养24-48小时；在所述24-48小时期间，是微生物胞外聚合物EPS增生阶段，培养48小时能获得最大胞外聚合物(EPS)提取量；如在M9培养基基础上，加入2-20g/L胰蛋白胨改性，则能收获更多的枯草芽孢杆菌量，获得更大的EPS提取量。针对本工艺中，仅使用M9培养基案例展示对硝基苯胺生产过程。
微生物胞外聚合物(EPS)提取方法：
第1步：取所述M9培养基培养48小时的枯草芽孢杆菌液1L，在6000g离心力下离心分离，移除上清液，收集沉淀下来的细胞；加入去离子水至原体积以重新悬浮枯草芽孢杆菌菌体，6000g离心力下再次离心，移除上清液，收获沉淀至离心管底的细胞体；该过程再次加入去离子水的目的是清洗枯草芽孢杆菌细胞，以移去残余培养基；
第2步：将所述第1步沉淀至离心管底的细胞体加入去离子水重新悬浮至500mL，在40～60W功率下超声10分钟得溶液备用；目的是增加微生物表面EPS的可剥离度；
第3步：将所述第2步超声后所得溶液，在11000～20000g离心力下离心20分钟；用高速离心的方法把微生物表面EPS剥离；
第4步：离心后的上清液经0.45um滤膜抽滤，获得的抽滤液为枯草芽孢杆菌EPS溶液，溶液保存在0～4℃环境；
第5步：上述提取的枯草芽孢杆菌胞外聚合物(EPS)经冷冻干燥、浓缩为原浓度的1％的微生物胞外聚合物(EPS)浓缩液备用；
(3)对硝基苯胺制备方法
第1步：取对二硝基苯，用甲醇配制成200g/L的对二硝基苯母液；将所述对二硝基苯母液加入到1L步骤(2)所述的浓缩至1％的微生物胞外聚合物(EPS)浓缩液中，使对二硝基苯浓度达到2g·L-1；
第2步：将上述第1步混合液在37℃、150转速/分钟下水平振荡反应48小时；
第3步：对于对硝基苯胺的收集；对于所述第2步水平振荡反应48小时后的混合液，2g/L的对二硝基苯完全转化为对硝基苯胺；转化后的溶液是EPS和对硝基苯胺的混合溶液，负60℃下冷冻干燥5天；所获取的干燥样品是固态EPS和对硝基苯胺混合物；加入甲醇经80W超声30min直接从固相微生物胞外聚合物(EPS)混合物中萃取对硝基苯胺，分3次萃取；所获得的对硝基苯胺甲醇溶液，在40℃条件下旋转蒸发；所搜集的甲醇蒸出液能重复使用；固体物为对硝基苯胺。
优选地，一种对硝基苯胺生产工艺，具体步骤如下：
(1)M9培养基制备：
该工艺使用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)生物菌种作为微生物胞外聚合物(EPS)来源，属于非致病性菌种，优点是生长速度快，24小时内即进入生长稳定期，该枯草芽孢杆菌生物菌种使用M9培养基培养；EPS即Extracellular Polymeric Substances的缩写；是由微生物所分泌的一种具黏性和具保护作用的基质，通常堆积在细胞的外围；主由蛋白质和多糖等活性成分构成；
1)M9主培养基配方为：单位为毫摩尔每升，在1L烧杯中加入450mL蒸馏水和以下各成份配成溶液：NH4Cl0.5g，Na2HPO43.0g，KH2PO41.5g，用NaOH调整pH到7.0-7.5并将溶液体积调整至490-500mL，制得主培养基；
2)制备M9营养液各50ml，如下：1mol/L MgSO4.7H2O50ml；15-30％(w/v)Dextrose葡萄糖50ml，w/v即质量浓度；和1mol/L CaCl250ml；
将上述M9主培养基和3种50ml的M9营养液分别通过0.45um滤膜抽滤除菌，或者分别在120℃高压灭菌20分钟，灭菌后，无菌条件下取浓度为1mol/L的1mL MgSO4·7H2O、20％(w/v)的5ml葡萄糖及1mol/L的50mL氯化钙的营养液分别加入到M9主培养基，充分混匀制得M9培养基备用；
(2)枯草芽孢杆菌的培养及其胞外聚合物EPS提取
该方法使用枯草芽孢杆菌生物菌种作为微生物胞外聚合物(EPS)来源；枯草芽孢杆菌首先在无菌环境接种至所述M9培养基中，接种比为5∶1000～5000；接种后的培养基在37±1℃，150转/分钟培养箱中培养24-48小时；在所述24-48小时期间，是微生物胞外聚合物EPS增生阶段，培养48小时能获得最大胞外聚合物(EPS)提取量；
微生物胞外聚合物(EPS)提取方法：
第1步：取M9培养基培养48小时的枯草芽孢杆菌液1L，在6000g离心力下离心分离，移除上清液，收集沉淀下来的细胞；加入去离子水至原体积以重新悬浮枯草芽孢杆菌菌体，6000g离心力下再次离心，移除上清液，收获沉淀至离心管底的细胞体；该过程再次加入去离子水的目的是清洗枯草芽孢杆菌细胞，以移去残余培养基；
第2步：将所述第1步沉淀至离心管底的细胞体加入去离子水重新悬浮至500mL，在40～60W功率下超声10分钟得溶液备用；目的是增加微生物表面EPS的可剥离度；
第3步：将所述第2步超声后所得溶液，在11000～20000g离心力下离心20分钟；用高速离心的方法把微生物表面EPS剥离；
第4步：离心后的上清液经0.45um滤膜抽滤，获得的抽滤液为枯草芽孢杆菌EPS溶液，溶液保存在0～4℃环境；
第5步：上述提取的枯草芽孢杆菌胞外聚合物(EPS)经冷冻干燥、浓缩为原浓度的百分之一的微生物胞外聚合物(EPS)浓缩液，组分如下(DW是干重，dry weight缩写)，
(3)对硝基苯胺制备方法
第1步：取对二硝基苯，用甲醇配制成200g/L的对二硝基苯母液；将所述对二硝基苯母液加入到1L步骤(2)所述的浓缩至1％的微生物胞外聚合物(EPS)浓缩液中，使对二硝基苯浓度达到2g·L-1；在60.3±5.0g/L DW的EPS浓度下，在48小时能够完全变成对硝基苯胺；
第2步：将上述第1步混合液在37℃、150转速/分钟下水平振荡反应48小时；
第3步：对硝基苯胺收集；所述第2步水平振荡反应48小时后的混合液，2g/L的对二硝基苯能够完全转化为对硝基苯胺；转化后的溶液是EPS和对硝基苯胺的混合溶液，负60℃下冷冻干燥5天；所获取的干燥样品是固态EPS和硝基苯胺混合物；加入甲醇经80W超声30min直接从固相微生物胞外聚合物(EPS)混合物中萃取对硝基苯胺，分3次萃取；所获得的对硝基苯胺甲醇溶液，在40℃条件下旋转蒸发；所搜集的甲醇蒸出液能重复使用；固体物为对硝基苯胺。
进一步地，如果一次要生产更高浓度的对硝基苯胺，则采用加大EPS浓度的方式进行。
进一步地，步骤(3)中萃取的过程工艺简单，无废弃物排放，且回收率达到98％以上。
有益效果
与已有的技术相比，本发明的有益效果体现在：枯草芽孢杆菌的培养采用M9培养基，以低成本的无机盐为主。同时，该菌具有廉价、易得、环境友好、可再生等优势。所产生的胞外聚合物，其主要成分为蛋白质、糖类、少量腐殖酸和核酸类物质，也是是取之不尽用之不竭的可再生资源，具有极大的经济开发价值。由于EPS腐殖酸和蛋白质的存在，其内在疏水性官能和弱极性官能结构能吸附捕捉二硝基苯化合物，使其进入反应位。EPS中醌类结构能传递还原糖醛基电子至硝基位，选择性地还地还原二硝基官能团中的一个至苯胺，另外一个仍旧保留硝基结构。这些EPS既能起到还原剂的作用，又能起到电子传递的生物电子穿梭体作用。因此，是不可多得的一种对硝基苯胺制备材料，具有极高的应用和推广价值，同时，填补了国内外的技术空白。
附图说明
图1：培养的枯草芽孢杆菌(A)及提取的EPS(B)的电镜图。
图2：芽孢杆菌光密度图。
图中为M9培养基加入不同浓度的胰化蛋白胨所获得的细胞量(OD600下光密度)
图3：EPS还原对二硝基苯的三维色谱图。
该反应体系为2g/L的硝基苯孵化48小时后的结果，色谱显示仅有对硝基苯胺能够被检测到，表明转化产物仅为对硝基苯胺，色谱图左侧3个红色峰主要为EPS蛋白质中的色氨酸峰，通过后续冷冻干燥甲醇萃取能进一步分离EPS和对硝基苯胺。
图4：对二硝基苯到对硝苯胺的生成反应路径图。
图5：不同对二硝基苯加入量所产生的对硝基苯胺转化效率图。图中EPS为60.3g/L，反应时间48小时，温度37℃。
具体实施例
本发明是一种低成本、低能耗、环境友好、工艺简单的对硝基苯胺生产工艺。具体实施方式如下：
1)培养基：
该方法使用枯草芽孢杆菌DH5a模式菌作为EPS来源。其优点是非致病性菌种，生长速度快，约20分钟一代，24小时即进入生长稳定期，该细菌使用M9培养基(葡萄糖-矿物盐培养基)培养，主培养基配方为(毫摩尔每升)：
在1L烧杯中加入450mL蒸馏水和以下各成份将其溶解于水中。NH4Cl0.5g，Na2HPO43.0g，KH2PO41.5g，用NaOH调整pH到7.4并将整体积调整至494mL。
制备营养液50ml：
1mol/L MgSO4.7H2O，20％(w/v)Dextrose(葡萄糖)，1mol/L CaCl2
将上述所有溶液通过0.45um滤膜抽滤除菌，也可以在120℃高压灭菌20分钟。灭菌后，无菌情况下把1mL MgSO4·7H2O(1M)，5ml葡萄糖[20％(w/v)]及50mL的氯化钙(1mol/L)的营养液分别加入到主培养基，充分混匀。
1)枯草芽孢杆菌培养
该方法使用枯草芽孢杆菌DH5a模式菌作为EPS来源。枯草芽孢杆菌首先在无菌环境接种至M9培养基中，接种比为5∶1000～5000。接种后的培养基在37℃，150rpm培养箱中培养48小时。在24-48小时期间，是EPS增生阶段，能获得最大的EPS提取量。
3)EPS提取方法：
第1步：培养好的枯草芽孢杆菌液在6000g(g为重力加速度的缩写)下离心分离，移除上清液，收集沉淀下来的细胞。加入去离子水至原体积，悬浮后6000g离心，移除上清液，其目的是清洗掉残余培养基。
第2步：沉淀的细胞加入去离子水重新悬浮至原体积的1/2，在40～60W功率下超声10分钟。目的是增加微生物表面EPS的可剥离度。
第3步：在11000g的离心力下，离心20分钟。用高速离心的方法把微生物表面EPS剥离。
第4步：离心后的上清液经0.45um滤膜抽滤，获得的抽滤液为枯草芽孢杆菌EPS溶液，溶液保存在4℃环境。
第5步：上述提取的EPS经冷冻干燥、浓缩为原浓度的百分之一。
表1：提取浓缩后的的EPS的各组分含量
3)对硝基苯胺制备方法
第1步：取对硝基苯，用甲醇配制成200g/L的对硝基苯母液。加入到1LEPS溶液中，使其对硝基苯浓度达到2g·L-1。对硝基苯的加入量影响生成硝基苯胺的效率(见附图4)。本案例中的2g/L的对硝基苯浓度，在60.3g/LDW的EPS浓度下，在48小时能够完全变成对硝基苯胺。如果一次生产更高浓度的对硝基苯胺，可以采用加大EPS浓度的方式进行。
第2步：上述混合液在37℃，150rpm水平振荡条件下反应48小时。
第3步：对硝基苯胺收集。反应48小时后，2g/L的对硝基苯能够完全转化为对硝基苯胺。上述样品负60℃下冷冻干燥5天。所获取的干燥样品加入甲醇经80W超声30min直接从固相EPS混合物种萃取对硝基苯胺(分3次萃取)。所获得的对硝基苯胺甲醇溶液，在40℃条件下旋转蒸发。所搜集的甲醇蒸出液能重复使用。固体物为对硝基苯胺。该萃取的过程工艺简单，无废弃物排放，且回收率达到98％以上。
M9培养基，一种培养大肠杆菌的已知培养基(葡萄-矿物盐)，但经过大量实验可知枯草芽孢杆菌可以在该培养基中生长，而且长势良好；如在M9培养基基础上，加入2-20g/L胰蛋白胨改性，则能收获更多的枯草芽孢杆菌量(参见图2)，获得更大的EPS提取量。针对本工艺中，仅使用M9培养基案例展示对硝基苯胺生产过程：
枯草芽孢杆菌来自于中国农业微生物菌种保藏管理中心(Agricultural Culture Collection ofChina)，保藏号(StrainNumber)：ACCC10144，可从该中心购得。
一种对硝基苯胺生产工艺，即一种对硝基苯胺(或4-硝基苯胺，英文名：p-nitroaniline)的生产步骤如下，
(1)M9培养基制备：
该工艺使用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)生物菌种作为微生物胞外聚合物(EPS)来源，属于非致病性菌种，优点是生长速度快，约20分钟一代，24小时内即进入生长稳定期，EPS即Extracellular Polymeric Substances的缩写；该枯草芽孢杆菌生物菌种使用M9培养基培养，所述M9培养基制备步骤如下，
1)M9主培养基配方为：单位为毫摩尔每升，在1L烧杯中加入450mL蒸馏水和以下各成份配成溶液：NH4Cl0.5g，Na2HPO43.0g，KH2PO41.5g，用NaOH调整pH到7.0-7.5并将溶液体积调整至490-500mL，制得主培养基；
2)制备M9营养液各50ml，如下：1mol/LMgSO4.7H2O50ml；15-30％(w/v)Dextrose葡萄糖50ml，w/v即质量浓度；和1mol/L CaCl250ml；
将上述M9主培养基和3种50ml的M9营养液分别通过0.45um滤膜抽滤除菌，或者分别在120℃高压灭菌20分钟，灭菌后，无菌条件下取浓度为1mol/L的1mL MgSO4·7H2O、20％(w/v)的5ml葡萄糖及1mol/L的50mL氯化钙的营养液分别加入到M9主培养基，充分混匀制得M9培养基备用；
(2)枯草芽孢杆菌的培养及其胞外聚合物EPS提取
该方法使用枯草芽孢杆菌生物菌种作为微生物胞外聚合物(EPS)来源；枯草芽孢杆菌首先在无菌环境接种至所述M9培养基中，接种比为5∶1000～5000；接种后的培养基在37±1℃，150转/分钟培养箱中培养24-48小时；在所述24-48小时期间，是微生物胞外聚合物EPS增生阶段，培养48小时能获得最大胞外聚合物(EPS)提取量；
微生物胞外聚合物(EPS)提取方法：
第1步：取所述M9培养基培养48小时的枯草芽孢杆菌液1L，在6000g离心力下离心分离，移除上清液，收集沉淀下来的细胞；加入去离子水至原体积以重新悬浮枯草芽孢杆菌菌体，6000g离心力下再次离心，移除上清液，收获沉淀至离心管底的细胞体；该过程再次加入去离子水的目的是清洗枯草芽孢杆菌细胞，以移去残余培养基；
第2步：将所述第1步沉淀至离心管底的细胞体加入去离子水重新悬浮至500mL，在40～60W功率下超声10分钟得溶液备用；目的是增加微生物表面EPS的可剥离度；
第3步：将所述第2步超声后所得溶液，在11000～20000g离心力下离心20分钟；用高速离心的方法把微生物表面EPS剥离；
第4步：离心后的上清液经0.45um滤膜抽滤，获得的抽滤液为枯草芽孢杆菌EPS溶液，溶液保存在0～4℃环境；
第5步：上述提取的枯草芽孢杆菌胞外聚合物(EPS)经冷冻干燥、浓缩为原浓度的1％的微生物胞外聚合物(EPS)浓缩液备用；
(3)对硝基苯胺制备方法
第1步：取对二硝基苯，用甲醇配制成200g/L的对二硝基苯母液；将所述对二硝基苯母液加入到1L步骤(2)所述的浓缩至1％的微生物胞外聚合物(EPS)浓缩液中，使对二硝基苯浓度达到2g·L-1；
第2步：将上述第1步混合液在37℃、150转速/分钟下水平振荡反应48小时；
第3步：对于对硝基苯胺的收集；对于所述第2步水平振荡反应48小时后的混合液，2g/L的对二硝基苯完全转化为对硝基苯胺；转化后的溶液是EPS和对硝基苯胺的混合溶液，负60℃下冷冻干燥5天；所获取的干燥样品是固态EPS和对硝基苯胺混合物；加入甲醇经80W超声30min直接从固相微生物胞外聚合物(EPS)混合物中萃取对硝基苯胺，分3次萃取；所获得的对硝基苯胺甲醇溶液，在40℃条件下旋转蒸发；所搜集的甲醇蒸出液能重复使用；固体物为对硝基苯胺。
优选地，一种对硝基苯胺生产工艺，具体步骤如下：
(1)M9培养基制备：
该工艺使用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)生物菌种作为微生物胞外聚合物(EPS)来源，属于非致病性菌种，优点是生长速度快，24小时内即进入生长稳定期，该枯草芽孢杆菌生物菌种使用M9培养基培养；EPS即Extracellular Polymeric Substances的缩写；
1)M9主培养基配方为：单位为毫摩尔每升，在1L烧杯中加入450mL蒸馏水和以下各成份配成溶液：NH4Cl0.5g，Na2HPO43.0g，KH2PO41.5g，用NaOH调整pH到7.0-7.5并将溶液体积调整至490-500mL，制得主培养基；
2)制备M9营养液各50ml，如下：1mol/LMgSO4.7H2O50ml；15-30％(w/v)Dextrose葡萄糖50ml，w/v即质量浓度；和1mol/L CaCl250ml；
将上述M9主培养基和3种50ml的M9营养液分别通过0.45um滤膜抽滤除菌，或者分别在120℃高压灭菌20分钟，灭菌后，无菌条件下取浓度为1mol/L的1mL MgSO4·7H2O、20％(w/v)的5ml葡萄糖及l mol/L的50mL氯化钙的营养液分别加入到M9主培养基，充分混匀制得M9培养基备用；
(2)枯草芽孢杆菌的培养及其胞外聚合物EPS提取
该方法使用枯草芽孢杆菌生物菌种作为微生物胞外聚合物(EPS)来源；枯草芽孢杆菌首先在无菌环境接种至所述M9培养基中，接种比为5∶1000～5000；接种后的培养基在37±1℃，150转/分钟培养箱中培养24-48小时；在所述24-48小时期间，是微生物胞外聚合物EPS增生阶段，培养48小时能获得最大胞外聚合物(EPS)提取量；
微生物胞外聚合物(EPS)提取方法：
第1步：取M9培养基培养48小时的枯草芽孢杆菌液1L，在6000g离心力下离心分离，移除上清液，收集沉淀下来的细胞；加入去离子水至原体积以重新悬浮枯草芽孢杆菌菌体，6000g离心力下再次离心，移除上清液，收获沉淀至离心管底的细胞体；该过程再次加入去离子水的目的是清洗枯草芽孢杆菌细胞，以移去残余培养基；
第2步：将所述第1步沉淀至离心管底的细胞体加入去离子水重新悬浮至500mL，在40～60W功率下超声10分钟得溶液备用；目的是增加微生物表面EPS的可剥离度；
第3步：将所述第2步超声后所得溶液，在11000～20000g离心力下离心20分钟；用高速离心的方法把微生物表面EPS剥离；
第4步：离心后的上清液经0.45um滤膜抽滤，获得的抽滤液为枯草芽孢杆菌EPS溶液，溶液保存在0～4℃环境；
第5步：上述提取的枯草芽孢杆菌胞外聚合物(EPS)经冷冻干燥、浓缩为原浓度的百分之一的微生物胞外聚合物(EPS)浓缩液，组分如下(DW是干重，dry weight缩写)，
(3)对硝基苯胺制备方法
第1步：取对二硝基苯，用甲醇配制成200g/L的对二硝基苯母液；将所述对二硝基苯母液加入到1L步骤(2)所述的浓缩至1％的微生物胞外聚合物(EPS)浓缩液中，使对二硝基苯浓度达到2g·L-1；在60.3±5.0g/LDW的EPS浓度下，在48小时能够完全变成对硝基苯胺；
第2步：将上述第1步混合液在37℃、150转速/分钟下水平振荡反应48小时；
第3步：对硝基苯胺收集；所述第2步水平振荡反应48小时后的混合液，2g/L的对二硝基苯能够完全转化为对硝基苯胺；转化后的溶液是EPS和对硝基苯胺的混合溶液，负60℃下冷冻干燥5天；所获取的干燥样品是固态EPS和硝基苯胺混合物；加入甲醇经80W超声30min直接从固相微生物胞外聚合物(EPS)混合物中萃取对硝基苯胺，分3次萃取；所获得的对硝基苯胺甲醇溶液，在40℃条件下旋转蒸发；所搜集的甲醇蒸出液能重复使用；固体物为对硝基苯胺。
进一步地，如果一次要生产更高浓度的对硝基苯胺，则采用加大EPS浓度的方式进行。
进一步地，步骤(3)中萃取的过程工艺简单，无废弃物排放，且回收率达到98％以上。
有益效果
与已有的技术相比，本发明的有益效果体现在：枯草芽孢杆菌的培养采用M9培养基，以低成本的无机盐为主。同时，该菌具有廉价、易得、环境友好、可再生等优势。所产生的胞外聚合物，其主要成分为蛋白质、糖类、少量腐殖酸和核酸类物质，也是是取之不尽用之不竭的可再生资源，具有极大的经济开发价值。由于EPS腐殖酸和蛋白质的存在，其内在疏水性官能和弱极性官能结构能吸附捕捉二硝基苯化合物，使其进入反应位。EPS中醌类结构能传递还原糖醛基电子至硝基位，选择性地还地还原二硝基官能团中的一个至苯胺，另外一个仍旧保留硝基结构。这些EPS既能起到还原剂的作用，又能起到电子传递的生物电子穿梭体作用。因此，是不可多得的一种对硝基苯胺制备材料，具有极高的应用和推广价值，同时，填补了国内外的技术空白。
有益效果：本发明所述的以生物工艺为基础生产对硝基苯胺，具有环境友好、操作简单、成本低的特定。整个工艺流程可以在5天内完成。而且使用本发明所述工艺以枯草芽孢杆菌胞外聚合物为原料，所带的糖醛基基团形成电子供体，醌式结构为电子传递体，促使对硝基苯被还原成对硝基苯胺。生成对硝基苯胺后，对硝基苯胺不会再向下游方向继续被还原。因此所生成的就一种最终产物——对硝基苯胺。这有别于化学合成方法，化学合成法中有机反应中除了对硝基苯胺外，可能还存在苯二胺、对硝基亚硝基苯等近10几种产物，这会导致分离产物过程出现的高成本和高能耗。因此采用本发明的工艺流程可以代替传统化学试剂合成法，具有环境友好的低成本优势和潜在应用价值。
在此说明的是实施例中涉及的数值范围均是经过多次实验所得，每一个点都可以实现，不局限在端点或者终点，篇幅所限，在此不进行一一列举。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (4)
1.一种对硝基苯胺生产工艺，其特征在于：一种对硝基苯胺(或4-硝基苯胺，英文名：p-nitroaniline)的生产步骤如下，
(1)M9培养基制备：
该工艺使用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)生物菌种作为微生物胞外聚合物(EPS)来源，属于非致病性菌种，优点是生长速度快，24小时内即进入生长稳定期，EPS即ExtracellularPolymeric Substances的缩写；该枯草芽孢杆菌生物菌种使用M9培养基培养，所述M9培养基制备步骤如下，
1)M9主培养基配方为：单位为毫摩尔每升，在1L烧杯中加入450mL蒸馏水和以下各成份配成溶液：NH4Cl0.5g，Na2HPO43.0g，KH2PO41.5g，用NaOH调整pH到7.0-7.5并将溶液体积调整至490-500mL，制得主培养基；
2)制备M9营养液各50ml，如下：1mol/LMgSO4.7H2O50ml；15-30％(w/v)Dextrose葡萄糖50ml，w/v即质量浓度；和1mol/LCaCl250ml。
将上述M9主培养基和3种50ml的M9营养液分别通过0.45um滤膜抽滤除菌，或者分别在120℃高压灭菌20分钟，灭菌后，无菌条件下取浓度为1mol/L的1mL MgSO4·7H2O、20％(w/v)的5ml葡萄糖及1mol/L的50mL氯化钙的营养液分别加入到M9主培养基，充分混匀制得M9培养基备用。
(2)枯草芽孢杆菌的培养及其胞外聚合物EPS提取
该方法使用枯草芽孢杆菌生物菌种作为微生物胞外聚合物(EPS)来源；枯草芽孢杆菌首先在无菌环境接种至所述M9培养基中，接种比为5∶1000～5000；接种后的培养基在37±1℃，150转/分钟培养箱中培养24-48小时；在所述24-48小时期间，是微生物胞外聚合物EPS增生阶段，培养48小时能获得最大胞外聚合物(EPS)提取量；
微生物胞外聚合物(EPS)提取方法：
第1步：取所述M9培养基培养48小时的枯草芽孢杆菌液1L，在6000g离心力下离心分离，移除上清液，收集沉淀下来的细胞；加入去离子水至原体积以重新悬浮枯草芽孢杆菌菌体，6000g离心力下再次离心，移除上清液，收获沉淀至离心管底的细胞体；该过程再次加入去离子水的目的是清洗枯草芽孢杆菌细胞，以移去残余培养基；
第2步：将所述第1步沉淀至离心管底的细胞体加入去离子水重新悬浮至500mL，在40～60W功率下超声10分钟得溶液备用；目的是增加微生物表面EPS的可剥离度；
第3步：将所述第2步超声后所得溶液，在11000～20000g离心力下离心20分钟；用高速离心的方法把微生物表面EPS剥离；
第4步：离心后的上清液经0.45um滤膜抽滤，获得的抽滤液为枯草芽孢杆菌EPS溶液，溶液保存在0～4℃环境；
第5步：上述提取的枯草芽孢杆菌胞外聚合物(EPS)经冷冻干燥、浓缩为原浓度的1％的微生物胞外聚合物(EPS)浓缩液备用；
(3)对硝基苯胺制备方法
第1步：取对二硝基苯，用甲醇配制成200g/L的对二硝基苯母液；将所述对二硝基苯母液加入到1L步骤(2)所述的浓缩至1％的微生物胞外聚合物(EPS)浓缩液中，使对二硝基苯浓度达到2g·L-1；
第2步：将上述第1步混合液在37℃、150转速/分钟下水平振荡反应48小时；
第3步：对于对硝基苯胺的收集；对于所述第2步水平振荡反应48小时后的混合液，2g/L的对二硝基苯完全转化为对硝基苯胺；转化后的溶液是EPS和对硝基苯胺的混合溶液，负60℃下冷冻干燥5天；所获取的干燥样品是固态EPS和对硝基苯胺混合物；加入甲醇经80W超声30min直接从固相微生物胞外聚合物(EPS)混合物中萃取对硝基苯胺，分3次萃取；所获得的对硝基苯胺甲醇溶液，在40℃条件下旋转蒸发；所搜集的甲醇蒸出液能重复使用；固体物为对硝基苯胺。
2.一种对硝基苯胺生产工艺，其特征在于具体步骤如下：
(1)M9培养基制备：
该工艺使用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)生物菌种作为微生物胞外聚合物(EPS)来源，属于非致病性菌种，优点是生长速度快，24小时内即进入生长稳定期，该枯草芽孢杆菌生物菌种使用M9培养基培养；EPS即Extracellular Polymeric Substances的缩写；
1)M9主培养基配方为：单位为毫摩尔每升，在1L烧杯中加入450mL蒸馏水和以下各成份配成溶液：NH4Cl0.5g，Na2HPO43.0g，KH2PO41.5g，用NaOH调整pH到7.0-7.5并将溶液体积调整至490-500mL，制得主培养基；
2)制备M9营养液各50ml，如下：1mol/L MgSO4.7H2O50ml；15-30％(w/v)Dextrose葡萄糖50ml，w/v即质量浓度；和1mol/L CaCl250ml；
将上述M9主培养基和3种50ml的M9营养液分别通过0.45um滤膜抽滤除菌，或者分别在120℃高压灭菌20分钟，灭菌后，无菌条件下取浓度为1mol/L的1mL MgSO4·7H2O、20％(w/v)的5ml葡萄糖及l mol/L的50mL氯化钙的营养液分别加入到M9主培养基，充分混匀制得M9培养基备用；
(2)枯草芽孢杆菌的培养及其胞外聚合物EPS提取
该方法使用枯草芽孢杆菌生物菌种作为微生物胞外聚合物(EPS)来源；枯草芽孢杆菌首先在无菌环境接种至所述M9培养基中，接种比为5∶1000～5000；接种后的培养基在37±1℃，150转/分钟培养箱中培养24-48小时；在所述24-48小时期间，是微生物胞外聚合物EPS增生阶段，培养48小时能获得最大胞外聚合物(EPS)提取量；
微生物胞外聚合物(EPS)提取方法：
第1步：取M9培养基培养48小时的枯草芽孢杆菌液1L，在6000g离心力下离心分离，移除上清液，收集沉淀下来的细胞；加入去离子水至原体积以重新悬浮枯草芽孢杆菌菌体，6000g离心力下再次离心，移除上清液，收获沉淀至离心管底的细胞体；该过程再次加入去离子水的目的是清洗枯草芽孢杆菌细胞，以移去残余培养基；
第2步：将所述第1步沉淀至离心管底的细胞体加入去离子水重新悬浮至500mL，在40～60W功率下超声10分钟得溶液备用；目的是增加微生物表面EPS的可剥离度；
第3步：将所述第2步超声后所得溶液，在11000～20000g离心力下离心20分钟；用高速离心的方法把微生物表面EPS剥离；
第4步：离心后的上清液经0.45um滤膜抽滤，获得的抽滤液为枯草芽孢杆菌EPS溶液，溶液保存在0～4℃环境；
第5步：上述提取的枯草芽孢杆菌胞外聚合物(EPS)经冷冻干燥、浓缩为原浓度的百分之一的微生物胞外聚合物(EPS)浓缩液，组分如下(DW是干重，dry weight缩写)，
(3)对硝基苯胺制备方法
第1步：取对二硝基苯，用甲醇配制成200g/L的对二硝基苯母液；将所述对二硝基苯母液加入到1L步骤(2)所述的浓缩至1％的微生物胞外聚合物(EPS)浓缩液中，使对二硝基苯浓度达到2g·L-1；在60.3±5.0g/L DW的EPS浓度下，在48小时能够完全变成对硝基苯胺；
第2步：将上述第1步混合液在37℃、150转速/分钟下水平振荡反应48小时；
第3步：对硝基苯胺收集；所述第2步水平振荡反应48小时后的混合液，2g/L的对二硝基苯能够完全转化为对硝基苯胺；转化后的溶液是EPS和对硝基苯胺的混合溶液，负60℃下冷冻干燥5天；所获取的干燥样品是固态EPS和硝基苯胺混合物；加入甲醇经80W超声30min直接从固相微生物胞外聚合物(EPS)混合物中萃取对硝基苯胺，分3次萃取；所获得的对硝基苯胺甲醇溶液，在40℃条件下旋转蒸发；所搜集的甲醇蒸出液能重复使用；固体物为对硝基苯胺。
3.根据权利要求1-3所述的一种对硝基苯胺生产工艺，其特征在于：如果一次要生产更高浓度的对硝基苯胺，则采用加大EPS浓度的方式进行。
4.根据权利要求1-3所述的一种对硝基苯胺生产工艺，其特征在于：步骤(3)中萃取的过程工艺简单，无废弃物排放，且回收率达到98％以上。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2013102722864A CN103305562A (zh) | 2013-07-02 | 2013-07-02 | 一种对硝基苯胺生产工艺 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2013102722864A CN103305562A (zh) | 2013-07-02 | 2013-07-02 | 一种对硝基苯胺生产工艺 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103305562A true CN103305562A (zh) | 2013-09-18 |
Family
ID=49131282
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2013102722864A Pending CN103305562A (zh) | 2013-07-02 | 2013-07-02 | 一种对硝基苯胺生产工艺 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103305562A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107619372A (zh) * | 2016-07-14 | 2018-01-23 | 中国石油化工股份有限公司 | 一种对硝基苯胺的连续生产方法 |
| CN107619373A (zh) * | 2016-07-14 | 2018-01-23 | 中国石油化工股份有限公司 | 一种高纯度对硝基苯胺的连续合成方法 |
| CN111377518A (zh) * | 2020-04-15 | 2020-07-07 | 湖南农业大学 | 利用胞外聚合物强化纳米零价铁循环降解废水中硝基苯的方法 |
-
2013
- 2013-07-02 CN CN2013102722864A patent/CN103305562A/zh active Pending
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| DE OLIVEIRA MARTINS PS等: "Application of a bacterial extracellular polymeric substance in heavy metal adsorption in a co-contaminated aqueous system", 《BRAZ J MICROBIOL》 * |
| 康福星等: "微生物胞外聚合物(EPS)对二硝基苯的还原及作用机制", 《中国化学会第28届学术年会第2分场摘要集》 * |
| 朱长亮等: "细菌胞外聚合物的工程应用现状及研究进展", 《金属矿山》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107619372A (zh) * | 2016-07-14 | 2018-01-23 | 中国石油化工股份有限公司 | 一种对硝基苯胺的连续生产方法 |
| CN107619373A (zh) * | 2016-07-14 | 2018-01-23 | 中国石油化工股份有限公司 | 一种高纯度对硝基苯胺的连续合成方法 |
| CN111377518A (zh) * | 2020-04-15 | 2020-07-07 | 湖南农业大学 | 利用胞外聚合物强化纳米零价铁循环降解废水中硝基苯的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105819913A (zh) | 一种复合菌肥及其制备方法和应用 | |
| CN102453676B (zh) | 秸秆发酵剂及其在秸秆发酵中的应用方法 | |
| CN106008101A (zh) | 一种盐碱地改良复合微生物有机肥料及其制备方法 | |
| CN103146610B (zh) | 一株植物根际促生菌及其应用 | |
| CN102391876A (zh) | 一种复合生物土壤改良剂及其应用 | |
| CN106495951A (zh) | 一种含有聚谷氨酸的高浓度微生物菌剂及其制备方法与应用 | |
| CN106187331B (zh) | 一种利用禽畜粪便制备复合微生物生态菌肥及其方法 | |
| CN101830737A (zh) | 一种化学-生物联用的秸秆腐熟剂及其腐熟方法 | |
| CN108863462A (zh) | 一种以秸秆为原料的生物有机肥及其制备方法 | |
| CN101665817B (zh) | 阿维菌素发酵废水循环利用方法 | |
| CN102391973A (zh) | 一种耐重金属的植物内生细菌及其应用 | |
| CN103305562A (zh) | 一种对硝基苯胺生产工艺 | |
| CN101250068A (zh) | 用养畜场污水生产光合细菌生物肥的方法 | |
| CN104016733B (zh) | 酵母废水资源化生产多功能生物有机肥 | |
| CN113265254B (zh) | 一种含有微生物的微胶囊型土壤改良剂及其制备方法和应用 | |
| CN110922975A (zh) | 一种微生物秸秆降解菌剂的制备方法及其应用 | |
| CN102910943A (zh) | 一种利用生物降解生活垃圾制备生物有机肥料的方法 | |
| CN106348887A (zh) | 海藻复合分级发酵制备氨基酸液体水溶肥的方法 | |
| CN102943058A (zh) | 一种利用沼液厌氧震荡培养光合细菌的方法 | |
| CN112266300A (zh) | 使用芽孢杆菌的藻类微生物发酵方法 | |
| CN102391972A (zh) | 一株樱桃根际促生假单胞菌及其应用 | |
| CN102173879B (zh) | 利用纤维素酶发酵废菌丝体和沼渣生产生物钾肥的方法 | |
| CN109081725A (zh) | 一种新型农业肥料及其制备方法 | |
| CN109180387A (zh) | 一种适于水稻追肥的含有海藻酸增效载体的颗粒尿素制备方法 | |
| CN109626596A (zh) | 一种复合微生物絮凝剂的制备方法及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130918 |