CN103299191A - 中风的生物标记 - Google Patents

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Abstract

中风的生物标记及检测方法的公开。一方面，本申请公开了用于受试者中风诊断的生物标记。另一方面，本申请公开了用于受试者中风诊断的方法。所述方法包括对受试者脑脊髓液、血液、血清或外周血单个核细胞中的中风生物标记的检测。还公开了用于受试者中风诊断的生物标记检测试剂盒。

Description

中风的生物标记
本申请享有2010年8月13日提交的美国临时专利申请61/344，517的优先权。通过引用将上午申请的全文包含于此。
技术领域
本申请主要涉及中风的诊断、处理和治疗。特别是，本发明涉及用于对受试者中风的诊断、监测迸展和治疗的方法及试剂盒。
背景技术
中风是衰弱的身体状态，治疗方法的选择有限。目前，溶栓是仅有的被认可的中风治疗法。然而，溶栓仅对3-5%的中风患者有效，主要是由于它非常短暂的治疗窗。中风患者在溶栓治疗窗内外的稳定性对阻止脑损伤由最初的缺血性病变发展至扩大区域的进程也至关重要。成像技术，包括计算机断层扫描(CT)和磁共振成像(MRl)在检测中风的发生、类型和严重性中非常有用。然而，这些技术昂贵并且需要相当长的时间来完成全面和准确的诊断。在农村以及具有大量的弱势群体的城市中尤其是这种情况。
除了不能提供有效的中风治疗方法外，非洲-美洲人和白人配偶死于中风的概率存在巨大的悬殊。降低中风引起的健康差异在美国仍然是主要的公共健康挑战。尽管在1970年至1990年间白人和非洲人-美洲人的中风死亡率均急剧降低，但非洲-美洲人的男人和女人死于中风的概率几乎还是他们白人配偶的两倍。
中风的迅速诊断很重要，因为诊断和药物干涉的延误可能促成临床恶化和残疾。早期诊断使临床医生能够更有效地选择紧急的干涉例如抗血小板的和/或神经保护的治疗方法，也能够更好地预测疾病结果。中风的成功治疗需要快速情况诊断。诊断的延误减少了大脑可以响应再灌注的可用的时间，并显著增加了大部分永久性损伤发生后的大出血的危险。
发展快速的、可及的和容易的使用诊断工具确定和治疗中风症状是长期的需要。长期以来中风的血液生物标记的运用被认为是确定中风的发生、时期、亚型和严重性的极好的方法。血液生物标记也可以用来确定现有的和新颖的中风治疗策略的有效性。
寻找特异的、可靠的和临床有效的生物标记基本上是不成功的。许多被认为是有希望的生物标记只能在中风后数小时或数天可被检测到，到这时它们将不再有帮助了(Anand，Netal.(2005)CerebrovascDis20:213-219)。此外，一些用于感兴趣的标记的实验需要劳动密集型的实验室工作，需要长周期的时间获得结果并且使用受限制。
理想的生物标记对指定类型的中风(例如缺血性中风)应该是特异的、灵敏的(早期的即时的释放)、可预测的(与损伤程度成比例的)、耐用的(精确的和便宜的)、非侵害的并结合临床前结果和临床确认。包括基因组分析和蛋白质组学在内的先进技术促进了有效的癌症生物标记的发现并可能导致中风标记的发现。基于高通量微阵列的基因组和蛋白质组分析的一个优点是能够确定在组织或体液中具有可变的表达模式的编码假定的分泌蛋白或膜表面蛋白的基因簇/群及蛋白簇/群。缺血性中风的基因组生物标记将具有可测量RNA特征，作为正常生物进程、缺血性损伤和/或响应治疗干涉的指示器。蛋白质组生物标记将检测血浆或血清中的肽或蛋白质。中风生物标记与神经影像和临床诊断检查的结果之间的良好相关性也很重要。
总结
本发明一方面涉及一种用于诊断受试者中风的方法。所述方法包括步骤(a)从受试者样品中测量一种或多种生物标记的水平;(b)将一种或多种生物标记的水平与一种或多种生物标记的参考水平进行比较;以及(c)基于比较步骤的结果做出诊断。一种或多种生物标记包括从白细胞介素-la(lL-la)、白细胞介素-lβ(lL-lβ)、白细胞介素lra(lL-lra)、白细胞介素3(lL-3)、白细胞介素2(lL-2)、白细胞介素4(lL-4)、白细胞介素5(lL-5)、白细胞介素6(lL-6)、白细胞介素7(lL-7)、白细胞介素8(lL-8)、白细胞介素9(lL=9)、白细胞介素10(lL-10)、白细胞介素12(P4O)(lL-12(P40))、白细胞介素12(P7O)(lL-12(P70))、白细胞介素13(lL-13)、白细胞介素15(lL-15)、白细胞介素17(lL-17)、表皮生长因子(EGF)、嗜酸细胞活化趋化因子(Eotaxin)、成纤维细胞生长因子2(FGF-2)、铁蛋白轻链3配体(FTL-3ligand)、趋化因子叶actalkine、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、生长调节致癌基因(GRO)、干扰素a2(lFN-a2)、干扰素Y(lFN-Y)、干扰素诱导蛋白10(lP-10)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、单核细胞趋化蛋白3(MCP-3)、MCD、巨噬细胞炎症蛋白la(MlP-la)、巨噬细胞炎症蛋白lβ(M「P-lβ)、血小板衍生生长因子aa(PDGF-aa)、血小板衍生生长因子aabb(PGDF-aabb)、调节活化正常T细胞表达和分泌的趋化因子(RANTES)、可溶性CD40配体(sCD4OL)、可溶性白细胞介素2-ra(slL2-ra)、肿瘤坏死因子a(TNF-a)、肿瘤坏死因子8(TNF-β)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)所组成的组合中选择的基因以及表4、5、6、8列出的基因的表达产物。
在一个实施例中，所述一种或多种生物标记是多聚核苷酸。
在附加实施例中，所述一种或多种生物标记是蛋白或肽。
附加实施例中，步骤(a)包括从受试者样品中测量三种或多种生物标记组。
在某些实施例中，所述组包括至少一种即时的早期中风生物标记(即，在中风后1小时差异表达的标记)、至少一种早期中风生物标记(即，在中风后2小时差异表达的标记)以及至少一种晚期中风生物标记(即，在中风后24小时差异表达)。在某些另外的实施例中，所述组包括至少两种即时的早期中风生物标记(在中风后1小时差异表达)、至少两种早期中风生物标记(在中风后2小时差异表达)以及至少两种晚期中风生物标记(在中风后24小时差异表达)。在某些另外的实施例中，所述组包括至少三种即时的早期中风生物标记、至少三种早期中风生物标记以及至少三种晚期中风生物标记。
本发明的另一个方面涉及一种用来确定受试者中风后的疾病进展的方法。所述方法包括步骤(a)在第一时间点从受试者获得的第一样品中测量一种或多种生物标记的水平;(b)在第二时间点从受试者获得的第二样品中测量一种或多种生物标记的水平;(c)将第一时间点的一种或多种生物标记的水平和第二时间点的一种或多种生物标记的水平进行比较;以及(d)基于步骤(c)的结果确定第一时间点和第二时间点之间的疾病进展。所述一种或多种生物标记包括从白细胞介素-la(lL-la)、白细胞介素-lβ(lL-lβ)、白细胞介素lra(lL-lra)、白细胞介素3(lL-3)、白细胞介素2(lL-2)、白细胞介素4(lL-4)、白细胞介素5(lL-5)、白细胞介素6(lL-6)、白细胞介素7(lL-7)、白细胞介素8(lL-8)、白细胞介素9(lL-9)、白细胞介素10(lL-10)、白细胞介素12(P40)(lL-12(P40))、白细胞介素12(P70)(lL-12(P70))、白细胞介素13(lL-13)、白细胞介素15(lL-15)、白细胞介素17(lL-17)、表皮生长因子(EGF)、嗜酸细胞活化趋化因子(EotaXin)、成纤维细胞生长因子2(FGF-2)、铁蛋白轻链3配体(FTL-3ligand)、趋化因子叶actalkine、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、生长调节致癌基因(GRO)、干扰素a2(lFN-a2)、干扰素Y(lFN-Y)、干扰素诱导蛋白10(lP-10)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、单核细胞趋化蛋白3(MCP-3)、MCD、巨噬细胞炎症蛋白la(MlP-la)、巨噬细胞炎症蛋白lβ(M「P-lβ)、血小板衍生生长因子aa(PDGF-aa)、血小板衍生生长因子aabb(PGDF-aabb)、调节活化正常T细胞表达和分泌的趋化因子(RANTES)、可溶性CD40配体(sCD4OL)、可溶性白细胞介素2-ra(slL2-ra)、肿瘤坏死因子a(TNF-a)、肿瘤坏死因子8(TNF-β)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)所组成的组合中选择的基因和表4、5、6、8中列出的基因的表达产物。
本发明的另一个方面涉及一种用来确定受试者中风治疗效果的方法。所述方法包括步骤(a)在第一时间点从受试者获得的第一样品中测量一种或多种生物标记的水平;(b)在第二时间点从受试者获得的第二样品中测量一种或多种生物标记的水平，所述受试者在第二时间点处于治疗中;(c)将第一时间点的一种或多种生物标记的水平和第二时间点的一种或多种生物标记的水平进行比较;以及(d)基于步骤(c)的结果确定治疗效果。所述一种或多种生物标记包括从白细胞介素-la(lL-la)、白细胞介素-lβ(lL-lβ)、白细胞介素lra(lL-lra)、白细胞介素3(lL-3)、白细胞介素2(lL-2)、白细胞介素4(lL-4)、白细胞介素5(lL-5)、白细胞介素6(lL-6)、白细胞介素7(lL-7)、白细胞介素8(lL-8)、白细胞介素9(lL-9)、白细胞介素10(lL-10)、白细胞介素12(P40)(lL-12(P40))、白细胞介素12(P70)(lL-12(P70))、白细胞介素13(lL-13)、白细胞介素15(lL-15)、白细胞介素17(lL-17)、表皮生长因子(EGF)、嗜酸细胞活化趋化因子(EotaXin)、成纤维细胞生长因子2(FGF-2)、铁蛋白轻链3配体(FTL-3ligand)、趋化因子叶actalkine、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、生长调节致癌基因(GRO)、干扰素a2(lFN-a2)、干扰素Y(lFN-Y)、干扰素诱导蛋白10(「P-10)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、单核细胞趋化蛋白3(MCP-3)、MCD、巨噬细胞炎症蛋白la(MlP-la)、巨噬细胞炎症蛋白lβ(MlP-lβ)、血小板衍生生长因子aa(PDGF-aa)、血小板衍生生长因子aabb(PGDF-aabb)、调节活化正常T细胞表达和分泌的趋化因子(RANTES)、可溶性CD40配体(sCD4OL)、可溶性白细胞介素2-ra(slL2-ra)、肿瘤坏死因子a(TNF-a)、肿瘤坏死因子8(TNF-β)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)所组成的组合中选择的基因和表4、5、6、8中列出的基因的表达产物。
本发明的另一个方面涉及一种用于检测生物样品中中风生物标记的试剂盒。所述试剂盒包括(a)用于检测中风生物标记组的试剂，及(b)列出每一种生物标记的参考值范围的操作指南。所述生物标记组包括两种或多种生物标记，其中两种或多种生物标记包括从白细胞介素-la(lL-la)、白细胞介素-lβ(lL-lβ)、白细胞介素lra(lL-lra)、白细胞介素3(lL-3)、白细胞介素2(lL-2)、白细胞介素4(lL-4)、白细胞介素5(lL-5)、白细胞介素6(lL-6)、白细胞介素7(lL-7)、白细胞介素8(lL-8)、白细胞介素9(lL-9)、白细胞介素10(lL-10)、白细胞介素12(P40)(lL-12(P40))、白细胞介素12(P70)(lL-12(P70))、白细胞介素13(lL-13)、白细胞介素15(lL-15)、白细胞介素17(lL-17)、表皮生长因子(EGF)、嗜酸细胞活化趋化因子(EotaXin)、成纤维细胞生长因子2(FGF-2)、铁蛋白轻链3配体(FTL-3ligand)、趋化因子叶actalkine、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、生长调节致癌基因(GRO)、干扰素a2(lFN-a2)、干扰素Y(lFN-V)、干扰素诱导蛋白10(lP-10)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、单核细胞趋化蛋白3(MCP-3)、MCD、巨噬细胞炎症蛋白la(MlP-la)、巨噬细胞炎症蛋白lβ(MlP-lβ)、血小板衍生生长因子aa(PDGF-aa)、血小板衍生生长因子aabb(PGDF-aabb)、调节活化正常T细胞表达和分泌的趋化因子(RANTES)、可溶性CD40配体(sCD4OL)、可溶性白细胞介素2-ra(slL2-ra)、肿瘤坏死因子a(TNF-a)、肿瘤坏死因子8(TNF-β)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAreceptor)、神经元特异性烯醇化酶、神经胶质酸性蛋白(GFAP)、载脂蛋白C-lll(ApoC-lll)、基质金属蛋白酶g(MMP-g)、D二聚体(D-dimer)、C反应蛋白(CRP)、脑钠素、S100B组成的组合中选择的基因以及表4、5、6、8列出的基因的表达产物。
附图说明
图1显示了猴受试者(MonkeyAO35)中脑动脉闭塞之后立即和随后24小时采集的扩散加权(DWl;图1A、1C)和T2加权(图lB、lD)的核磁共振成像图像，中脑动脉闭塞(MCAO)24小时时通过扩散加权测量的梗塞面积的增加(图lE)以及通过扩散加权测量的与任务定向神经学评估中观察到的运动障碍相关的梗塞面积(图lF)。
图2显示了来自非人类灵长目动物中脑动脉闭塞后外周血单核细胞的RA的微阵列分析。在中脑动脉闭塞前(Pre-O)和缺血后(1小时、2小时和24小时)采集血液。绿色表示低水平表达或不表达的基因。红色表示缺血后诱导的基因。
图3运用LUmineX实验法(图1A)和确认LUmineX实验结果的血清蛋白质印迹分析(图lb)显示了血清中细胞活素单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的水平在中脑动脉闭塞后1-2小时显著增加，然后在中风后24小时回到基线。
图4显示了非人类中脑动脉闭塞后血清中蛋白质的肽组学分析。在中脑动脉闭塞前(Pre-O)和缺血后(1小时、2小时和24小时)采集血液。绿色表示低水平表达或不表达的基因。红色表示缺血后诱导的基因。
详细说明
以下介绍的详细说明使任何此领域的技术人员能够生产和使用本发明。为达到解释的目的，提到了特定的术语，用于提供对本发明的全面理解。然而，本领域的技术人员显然知道这些特定的描述对实践本发明不是必须的。特定申请的说明仅作为典型例子提供。本发明不局限于所显示的实施例，但适用于与这里公开的原理和特征一致的最大可能范围。
在此所用的下列术语应具有以下含义:
这里使用的"生物标记"，括的是可以在身体的部分如血液或组织中检测和计录的小分子、蛋白或核酸，其存在或浓度反映了受试者中风的存在、严重性、类型或进展。更广义地，生物标记是任何能够作为生物体特定疾病状态或一些其它的生物状态的指示器的东西。在生物术语中，生物标记是可以通过基因组学、蛋白质组学技术或成像技术检测到的标记的集合。生物标记可以包括，但不局限于细胞活素、趋化因子、生长因子、酶或血栓症相关蛋白中的任何一种。生物标记也可以包括编码在中风过程中或中风后差异表达的上述任一蛋白或mRNA或微小RNA的核酸。生物标记可以是中风后表达量增加或降低的基因产物。
这里使用的术语"基因产物"或"基因的表达产物"指的是基因的转录产物如mRNAs和基因编码的cDNAs，以及/或基因的翻译产物如基因编码的肽和它的片段。
这里使用的术语"抗体"指的是免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(lg)分子的免疫活性部分，即，它的抗原结合片段或含有特异结合(免疫反应)抗原的抗原结合位点的分子。术语"抗体"运用于最宽泛的含义中，确切地说包括了单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)以及只要表现出想要的生物活性的抗体片段。"特异性结合"或"免疫反应"意思是抗体与一个或多个想要的抗原的抗原决定簇反应(即结合)，而不与其它的多肽反应或与其它的多肽以较低的亲和性结合。术语"抗体"还包括含有全长抗体的一部分的抗体片段，通常是它的抗原结合部位或可变区域。抗体片段的例子包括Fab，Fab'，Hab')2，和Fv片段;双体;线性抗体;单链抗体分子(scFv)；和由抗体片段形成的多重特异性抗体。在本发明的某些实施例中，例如为了增加肿瘤穿透性，采用一个抗体片段比一个完整抗体更好。既然这样，为了增加抗体的血清半衰期，用本领域已知方法修改过的抗体片段更令人满意。
这里使用的术语"单克隆抗体"指的是从基本上同源的抗体群体中获得的抗体，即除了可能少数存在的自然发生突变以外，包含所述群体的单独抗体是一样的。这里的单克隆抗体确切的说包括"嵌合"抗体，其重链和/或轻链的一部分等同于或同源于来自特定物种或属于特定抗体种类或亚类的抗体的相应序列，而链的剩余部分则等同于或同源于来自另外的物种或属于另外的抗体种类或亚类的抗体的相应序列，此外还包括只要表现出所需生物活性的这些抗体的片段(U.S.Pat.N0.4，816，567;andMorrisonetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:685]-6855(1984))。
术语"生物样品"指的是从哺乳动物受试者，更好是从人类受试者获得的生物材料的样品，包括组织、组织样品、细胞样品、外周血单核细胞以及生物流体，例如血液、血浆、血清、唾液、尿液、脑或脊髓液以及淋巴液。生物样品可以用例如组织活检的形式获得，如针吸活检、刷拭活检、表面活检、穿刺活检、钻取活检、切除活检、切开活检、切取活检及经内窥镜活检。在一个实施例中，生物样品是血液、血清或细胞质样品。在另一个实施例中，生物样品是外周血单核细胞。
生物样品的"分离"(例如组织或肿瘤样品的分离)指的是从样品中分开的、提取的、萃取的、纯化的或分离的材料或成分(例如，生物材料或成分)，并且更好地是去除与生物样品相关的不想要的成分和/或杂质或污染物。
术语"升高的水平"指的是高于相关领域中通常使用或规定的正常水平或对照水平的水平。例如，组织免疫染色的升高的水平是指被认为高于本领域普通技术人员所做的对照组织免疫染色的水平的免疫染色的水平。
术语"降低的水平"指的是低于相关领域中通常使用或规定的正常水平或对照水平的水平。例如，组织免疫染色的降低的水平是指被认为低于本领域普通技术人员所做的对照组织免疫染色的水平的免疫染色的水平。
范围在这里可以表示为从"大约"一个特定值和/或到"大约"另一个特定值。如果表示了这样的范围，那么另一个实施例包括从一个特定值和/或到另一个特定值。类似的，如果通过前提"大约"的使用来将数值表示为近似值，那么它将被理解为特定值形成了另一个实施例。它还将被理解为每个范围的端点对涉及另一个端点和独立于另一个端点都很重要。也理解为有许多在此公开的数值，并且除了这个数值本身外，每个值在这里也作为"大约"这个特定值公开，即加上数值本身的特定数值。例如，如果公开了数值"10"，那么"大约10"也公开了。还理解为如果公开了数值，那么也公开了"少于或等于所述数值"、"大于或等于所述数值"以及数值间可能的范围，正如本领域熟练技术人员的恰当的理解一样。例如，如果公开了数值“10"，那么也公开了"少于或等于10"及"大于或等于10"。
术语"中风生物标记的表达水平"可以在转录水平测量，在这种情况下多核苷酸的存在和/或数量被确定，或在翻译水平测量，在这种情况下多肽的存在和/或数量被确定。中风生物标记的表达可以用任何一种合适的方法描述。
本发明的一个方面涉及一种用于诊断受试者中风的方法。本发明的一个方面涉及一种用于诊断受试者中风的方法。所述方法包括步骤(a)在来自受试者的样品中测量一种或多种生物标记的水平;(b)将一种或多种生物标记的水平与一种或多种生物标记的参考水平比较;以及(c)基于比较步骤的结果做出诊断。
在一个实施例中，将生物样品中的中风生物标记水平和参考样品，如正常的对照样品，相关的中风标记水平进行比较。短语"正常对照水平"指的是通常在不患有中风的群体的生物样品中获得的中风标记水平。参考样品更好地是具有与测试样品相似的性质。例如，如果测试样品包含患者的血清，那么参考样品也应该是血清。在自对照和测试受试者的生物样品中的中风生物标记水平可以往同一时间确定，或者作为选择，可以通过统计学方法基于以前从对照组采集的样品的中风生物标记水平的分析结果来确定正常对照水平。
在一个实施例中，生物标记是从白细胞介素-la(lL-la)、白细胞介素-lβ(lL-lβ)、白细胞介素lra(lL-lra)、白细胞介素3(lL-3)、白细胞介素2(lL-2)、白细胞介素4(lL-4)、白细胞介素5(lL-5)、白细胞介素6(lL-6)、白细胞介素7(lL-7)、白细胞介素8(lL-8)、白细胞介素9(lL-9)、白细胞介素10(lL-10)、白细胞介素12(P40)(lL-12(P40))、白细胞介素12(P70)(lL-12(P70))、白细胞介素13(lL-13)、白细胞介素15(lL-15)、白细胞介素17(lL-17)、表皮生长因子(EGF)、嗜酸细胞活化趋化因子(EotaXin)、成纤维细胞生长因子2(FGF-2)、铁蛋白轻链3配体(FTL-3ligand)、趋化因子Fractalkine、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、生长调节致癌基因(GRO)、干扰素a2(lFN-a2)、干扰素Y(lFN-Y)、干扰素诱导蛋白10(lP-10)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、单核细胞趋化蛋白3(MCP-3)、MCD、巨噬细胞炎症蛋白la(MlP-la)、巨噬细胞炎症蛋白lβ(MlP-lβ)、血小板衍生生长因子aa(PDGF-aa)、血小板衍生生长因子aabb(PGDF-aabb)、调节活化正常T细胞表达和分泌的趋化因子(RANTES)、可溶性CD40配体(sCD4OL)、可溶性白细胞介素2-ra(slL2-ra)、肿瘤坏死因子a(TNF-a)、肿瘤坏死因子8(TNF-β)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAreceptor)、神经元特异性烯醇化酶、神经胶质酸性蛋白(GFAP)、载脂蛋白C-lll(ApoC-lll)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、D二聚体(D-dimer)、C反应蛋白(CRP)、脑钠素、S100B组成的组合中选择的基因以及表4、5、6、8中列出的基因的表达产物。
在相关的实施例中，生物标记是细胞活素基因、趋化因子基因或生长因子基因的表达产物。在进一步相关的实施例中，细胞活素、趋化因子或生长因子基因从编码白细胞介素-la(lL-la)、白细胞介素-lβ(lL-lβ)、白细胞介素lra(lL-lra)、白细胞介素2(lL-2)、白细胞介素3（lL-3)、白细胞介素4(lL-4)、白细胞介素5(lL-5)、白细胞介素6（lL-6)、白细胞介素7(lL-7)、白细胞介素8(lL-8)、白细胞介素9(lL-9)、白细胞介素10(lL-10)、白细胞介素12(P40)(lL-12(P40))、白细胞介素12(P70)(lL-12(P70))、白细胞介素13(lL-13)、白细胞介素15(lL-15)、白细胞介素17(lL-17)、表皮生长因子(EGF)、嗜酸细胞活化趋化因子(EotaXin)、成纤维细胞生长因子2(FGF-2)、铁蛋白轻链3配体(FTL-3ligand)、趋化因子叶actalkine、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、生长调节致癌基因(GRO)、干扰素a2(lFN-a2)、干扰素Y(lFN-Y)、干扰素诱导蛋白10(lP-10)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、单核细胞趋化蛋白3(MCP-3)、MCD、巨噬细胞炎症蛋白la(MlP-lα)、巨噬细胞炎症蛋白lβ(MlP-lβ)、血小板衍生生长因子aa(PDGF-aa)、血小板衍生生长因子aabb(PDGF-aabb)、调节活化正常T细胞表达和分泌的趋化因子(RANTES)、可溶性CD40配体(sCD4OL)、可溶性白细胞介素2-ra(slL2-ra)、肿瘤坏死因子a(TNF-a)、肿瘤坏死因子8(TNF-β)及血管内皮细胞生长因于(V三GF)的基因中选择。
在某些实施例中，生物标记是蛋白或肽标记。
在某些其它的实施例中，生物标记是核酸生物标记。在某些相关的实施例中，核酸生物标记是DNA或RNA生物标记。在某些实施例中，通过定量RT-PCR、Northern杂交或其它本领域普通技术人员己知的方法在mRNA水平确定中风生物标记的表达。
在一些实施例中，在步骤(a)测量多种生物标记组。多标记组改善了单一标记的诊断的灵敏性和特异性。例如，通过同时靶向缺血性代谢流的不同成分，生物标记组可以将严重中风患者与年龄和性别匹配的对照受试者区分开并确定中风的时间进程和严重性。在一些实施例中，多标记组包括指示中风发生、缺血后时间进程及神经元损伤严重性的生物标记。在其它的实施例中，所述组也包括确定或排除大出血和短暂性脑缺血发作(例如不可逆的神经元损伤)的标记。
在其它的实施例中，步骤(a)包括在来自受试者的样品中测量三种或多种生物的标记组。在某些实施例中，所述组包括至少一种即时的早期中风生物标记(在中风后1小时差异表达)、至少一种早期中风生物标记(在中风后2小时差异表达)以及至少一种晚期中风生物标记(在中风后24小时差异表达)。在某些其它的实施例中，所述组包括至少两种即时的早期中风生物标记(在中风后1小时差异表达)、至少两种早期中风生物标记(在中风后2小时差异表达)以及至少两种晚期中风生物标记(在中风后24小时差异表达)。在某些其它的实施例中，所述组包括至少三种即时的早期中风生物标记(在中风后1小时差异表达)、至少三种早期中风生物标记(在中风后2小时差异表达)以及至少三种晚期中风生物标记(在中风后24小时差异表达)。
即时的早期中风生物标记的例子包括，但不局限于CD163、蛋白激酶C亚型D(PKCdelta)、丙酮酸激酶、肌肉(丙酮酸激酶M2(PKM2))、甲状腺激素受体相关蛋白2、甲状腺激素受体相关蛋白5、Nod样受体(NLR)家族蛋白、含pyrin结构域1的蛋白(pyrindomaincontaining1)、胰核糖核酸酶(Rnase1)、细胞色素b-245、P多肽、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)以及表4所列基因的基因产物。
早期中风生物标记的例子包括，但不局限于CD163、蛋白激酶C亚型D(PKCdelta)、蛋白檄酶AKT1底物1(富含脯氨酸)异构体1、Cmtm3、WD重复蛋白19(WDR19)、0-2型LX胶原蛋白、甲状腺激素受体相关蛋白2、甲状腺激素受体相关蛋白5、Nod佯受体(NLR)家族蛋白、热蛋白结构域蛋白1(pyrindomaincontaining1)、胰核糖核酸酶(Rnase1)、补体因子H异构体前体、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)以及表5所列基因的基因产物。
晚期中风生物标记的例子包括，但不局限于NOD9(NLRK1)、天门冬氨酰-tRNA合成酶、淋巴细胞质蛋白1(L-plastin)、几丁质酶1(壳三糖酶)、蛋白酶体α1亚基(PSMA4)、蛋白激酶C亚型D(PKCdelta)、Cmtm3、WD重复蛋白19(WDR19)、α-2型lX胶原蛋白、丙酮酸激酶M2(PKM2)、甲状腺激素受体相关蛋白2、甲状腺激素受体相关蛋白5、Nod样受体家族蛋白、热蛋白结构域蛋白1、胰核糖核酸酶(Rnase1)、细胞色素b-245、p多肽、补体因子H异构体前体以及表6所列基因的基因产物。
在某些实施例中，生物标记组还包括包括一种或多种只能在中风后的血液中检测到的中风发生生物标记。
所述生物标记的例子包括，但不局限于α-2型血纤维蛋白溶酶抑制剂、WD重复蛋白19(WDR19)、α-2型DC胶原蛋白、丙酮酸激酶M2(PKM2)、甲状腺激素受体相关蛋白2、甲状腺激素受体相关蛋白5、Nod样受体家族蛋白、热蛋白结构域蛋白1、胰核糖核酸酶(Rnase1)以及细胞色素b-245、p多肽、S100-B。
在某些其它的实施例中，生物标记组还包括一种或多种中风严重性生物标记，其在血液中的水平随中风后时间的延长而升高。
这样的生物标记组的例子包括但不局限于蛋白檄酶C亚型D(PKCdelta)，趋化因子样超家族成员3(Cmtm3)，和NLR家族，含pyrin域1蛋白(pyrindomaincontaining1)。
在其它的实施例中，上述生物标记组还可以包括一种或多种神经元损伤标记，例如N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAreceptor)、神经元特异性烯醇化酶的基因产物。
在其它的实施例中，上述生物标记组还可以包括一种或多种出血性中风标记，例如神经胶质酸性蛋白(GFAP)、载脂蛋白C-lll(ApoC-lll)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)。
在其它的实施例中，上述生物标记组还可以包括一种或多种从D二聚体(D-dimer)、C反应蛋白(CRP)、脑钠素(BNP)以及S100B组成的组合中选择的双标记。
在其它的实施例中，生物标记组包括表4中所列基因的至少一种表达产物、表5中所列基因的至少一种表达产物以及表6中所列基因的至少一种表达产物。在其它的实施例中，生物标记组包括表4中所列基因的至少三种表达产物、表5中所列基因的至少三种表达产物以及表6中所列基因的至少三种表达产物。在其它的实施例中，生物标记组包括表4中所列基因的至少五种表达产物、表5中所列基因的至少五种表达产物以及表6中所列基因的至少五种表达产物。这些生物标记组还可以包括中风严重性标记、神经元损伤标记以及出血性中风标记的表达产物。
在一些实施例中，生物标记和生物标记组对缺血性中风是特异的。在相关的实施例中，缺血性中风是大血管缺血性中风。
在另一个实施例中，在组织样品中检测生物标记。
在某些其它的实施例中，在体液中检测生物标记。正如以下所用到的，术语"体液"指的是血液、血浆或血清、尿液、唾液及脑脊髓液。在相关的实施例中，在从体液获得的细胞中检测生物标记，例如从血液样品中分离的外周血单核细胞。
在另一个实施例中，测量步骤包括在来自受试者的样品中测量两种或多种生物标记。
在另一个实施例中，测量步骤包括在来自受试者的样品中测量三种或多种生物标记。
在另一个实施例中，测量步骤包括在来自受试者的样品中测量四种或多种生物标记。
在另一个实施例中，测量步骤包括在来自受试者的样品中测量五种、十种、十五种、二十种、二十五种或多种生物标记。
本发明的另一个方面是用于确定受试者中风后疾病进展的方法。所述方法包括步骤(a)在来自接受治疗的受试者的样品中测量一种或多种生物标记的水平以及(b)基于样品中一-种或多种生物标记的水平确定疾病进展。
本发明的另一个方面涉及用于确定受试者中风后疾病进展的方法。所述方法包括步骤(a)在第一时间点在在从受试者获得的第一样品中测量一种或多种生物标记的水平;(b)在第二时间点在从受试者获得的第二样品中测量一种或多种生物标记的水平;(c)将第一时间点的一种或多种生物标记的水平与第二时间点的一种或多种生物标记的水平进行比较;以及(d)基于步骤(c)的结果确定第一时间点和第二时间点之间的疾病进展。
本发明的另一个方面涉及一种用来确定受试者中风治疗效果的方法。所述方法包括步骤(a)在第一时间点在从受试者获得的第一样品中测量一种或多种生物标记的水平;(b)在第二时间点在从受试者获得的第二样品中测量一种或多种生物标记的水平，所述受试者在第二时间点处于治疗中;(c)将第一时间点的一种或多种生物标记的水平和第二时间点的一种或多种生物标记的水平进行比较;以及(d)基于步骤(c)的结果确定治疗效果。
在受试者中检测中风生物标记
在组织或体液样品中检测中风生物标记的方法有许多申请。例如，可以测量一种或多种生物标记来辅助中风诊断。在另一个例子中，生物标记的检测方法可以用来确定中风的严重性。在另一个例子中，生物标记的检测方法可以用来确定中风发生后消逝的时间。在另一个例子中，生物标记的检测方法可以用来确定受试者经受的中风类型。例如，在受试者体内中风生物标记类型的不同，和/或特定生物标记的数量不同可以说明所述受试者是否经受出血性中风或缺血性中风，或者缺血性中风是否是大血管缺血性中风。又在另一个例子中，检测标记的方法可以用来监测受试者体内中风进展。还有在另一个例子中，生物标记的检测方法可以用来监测受试者对治疗的反应或确定应该用于受试者的治疗类型。还有在另一个例子中，生物标记可以用来检测受试者是否经受短暂缺血，例如与再灌注损伤相关的短暂缺血。在另一个例子中，生物标记可以说明受试者是否经受永久性中风或暂时性中风。在另一个例子中，生物标记可以用来评估神经保护药物或成分的有效性。
为检测受试者体内中风生物标记，脑脊髓液、血液或血清样品要与至少一种特异结合中风生物标记的抗体接触。作为选择，可以按照本领域已知的方法通过溶解外周血单核细胞获得样品并将溶解产物与至少一种特异结合中风生物标记的抗体接触。除此之外，也可以在唾液、尿液、眼泪和特定的白细胞亚类中检测生物标记，例如B淋巴细胞、T淋巴细胞、粒细胞(例如嗜中性粒细胞)以及单核细胞。
典型的中风生物标记包括从白细胞介素-la(lL-la)、白细胞介素-lβ(lL-lβ)、白细胞介素lra(lL-lra)、白细胞介素3(lL-3)、白细胞介素2(lL-2)、白细胞介素4(lL-4)、白细胞介素5(lL-5)、白细胞介素6(lL-6)、白细胞介素7(lL-7)、白细胞介素8(lL-8)、白细胞介素9(lL-9)、白细胞介素10(lL-10)、白细胞介素12(P40)(lL-12(P40))、白细胞介素12(P70)(lL-12(P70))、白细胞介素13(lL-13)、白细胞介素15(lL-15)、白细胞介素17(lL-17)、表皮生长因子(EGF)、嗜酸细胞活化趋化因子(EotaXin)、成纤维细胞生长因子2(FGF-2)、铁蛋白轻链3配体(FTL-3ligand)、趋化因子Fractalkine、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、生长调节致癌基因(GRO)、干扰素a2(lFN-a2)、干扰素Y(lFN-Y)、干扰素诱导蛋白10(lP-10)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、单核细胞趋化蛋白3(MCP-3)、MCD、巨噬细胞炎症蛋白la(MlP-la)、巨噬细胞炎症蛋白lβ(MlP-lβ)、血小板衍生生长因子aa(PDGF-aa)、血小板衍生生长因子aabb(PGDF-aabb)、调节活化正常T细胞表达和分泌的趋化因子(RANTES)、可溶性CD40配体(sCD4OL)、可溶性白细胞介素2-ra(slL2-ra)、肿瘤坏死因子a(TNF-a)、肿瘤坏死因子8(TNF-β)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)组成的组合中选择的基因及表4、5、6、8中所列基因的表达产物。
可以运用本领域已知的任何一种合适的免疫结合试验来检测和/或定量中风生物标记。有用的化验包括，例如，如酶联免疫吸附试验(ELlSA)的酶免疫吸附试验(ElA)，放射免疫检定法(RlA)，蛋白质印迹试验，狭缝印迹法或快速试纸法。
通常可以将来自受试者的样品与特异结合中风生物标记的抗体接触。可选择地，抗体可以固定在载体上，从而在抗体接触样品之前促进冲洗以及随后的复合物分离。载体的例子色括微量滴定板、棍、珠或微珠形式的玻璃或塑料。包含于此的载体的例子包括玻璃的部分或完全成形(例如可控多孔玻璃)、多糖(例如琼脂糖)、聚丙烯酰胺、硅酮以及诸如聚苯乙烯、聚丙烯及聚乙烯醇的塑料。样品在接触抗体之前可以用合适的稀释剂或洗提液稀释。
在孵育样品和抗体之后，冲洗混合物后可以检测形成的抗体-生物标记复合物。这可以通过孵育洗过的混合物和检测试剂来实现。所述检测试剂可以是，例如，贴有可检测标签的第二抗体。典型的检测标签包括磁珠(例如DYNABEADSTM)、荧光染料、放射性同位素标记、酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和其它常用于酶联免疫吸附试验(ELlSA)的酶类)以及诸如胶体金或有色玻璃或塑料珠的比色标签。作为选择，样品中的生物标记可以用间接法检测，其中，例如，用于检测结合的生物标记特异性抗体的第二标签抗体，和/或在竞争法或抑制法中检测，其中，例如，与标记的不同表位结合的单克隆抗体同时与混合物孵育。
免疫测定可以用于确定样品中中风的存在与否以及样品中生物标记的数量。首先，样品中的生物标记的试验数量可以用上述的免疫测定方法检测。如果标记存在于样品中，那么它将形成含有在上述合适的孵育条件下特异结合标记的抗体的抗体-标记复合物。抗体-标记复合物的数量可以通过与标准比较来确定。标准可以是，例如，已知的复合物或样品中存在的另一种蛋白。如上所述，标记的试验数量不需要以绝对单位制测量，只要测量单位可以与对照进行比较。
酶联免疫吸附试验(ELlSA)
在某些实施例中，采用通常使用抗体包被的试验板或孔迸行的酶联免疫吸附试验(ELlSA)来检测中风生物标记。常用的ELlSA法使用夹心免疫测定法或竞争结合免疫测定法。
简言之，夹心免疫测定法是使用结合在抗原或配体不同位点的两种抗体的方法。与抗原高度特异性结合的第一抗体附着在固体表面上。加入抗原后再加入作为检测抗体的第二抗体。与第一抗体相比，检测抗体结合在抗原不同的表位上。因此，抗原被两个抗体夹在中间。抗体结合抗原的亲和力通常是免疫测定灵敏度的主要决定因素。当抗原浓度升高时，检测到的抗体数量也增加，从而导致更高的测量响应。夹心结合试验的标准曲线具有正斜率。可以使用不同的指示器来定量结合程度。通常把酶结合在第二抗体上，与第一抗体相比，第二抗体必须在不同的物种中产生(即，如果第一抗体是兔抗体，那么第二抗体可以是来自山羊、鸡等的抗兔的抗体，但不能来自兔)。将酶的底物加入反应便形成了作为检测信号的比色读出器。产生的信号与样品中存在的靶标抗原数量是成比例的。
用于测量结合结果的连接抗体的指示器决定了检测方式。光谱光度测量板读出器可以用于比色检测。为提高免疫测定中的灵敏度，多种指示器类型得到改良。例如，己经发展出进一步扩大信号并且可以在发光板读出器上读出的化学发光底物。此外，用荧光标记抗体代替试验的酶标步骤的荧光读出器变得十分流行。然后再用荧光板读出器测量读出。
竞争结合试验基于标记的和未标记的配体竞争数量有限的抗体结合位点。竞争抑制试验通常用于测量小的分解物。这些试验也用于分解物的配对抗体不存在的情况下。在竞争结合ELlSA试验中只用一种抗体。其原因是，如果两种抗体试图结合非常小的分子时会产生位阻现象。固定数量的标记配体(示踪物)和可变数量的未标记配体与抗体一起孵育。根据质量作用定律，标记配体的数量是标记和未标记配体总浓度的应变量。当未标记配体的浓度升高时，较少的标记配体可以结合在抗体上并且测量的反应降低。因此信号越低，样品中的未标记分解物越多。竞争结合试验的标准曲线只有负斜率。
微珠
在某些其它的实施例中，使用抗体包被的微珠检测中风生物标记。在一些实施例中，微珠是磁珠。在其它的实施例中，微珠内部用荧光染料迸行色标，并且其表面加上了可以在实验样品中结合中风生物标记的抗中风生物标记抗体的标签。相应地，中风生物标记可以被直接贴上荧光标签或间接地标记上连接着荧光标签的抗标记抗体。因此，有两种颜色来源，一是来自微珠，二是来自荧光标签。作为选择，可以按照不同的大小内部标记标签。
通过对来自两种染料的不同荧光强度以及不同大小的微珠的组合，所述试验可以测量多达成百上千的不同的中风生物标记。在试验过程中，包含颜色/大小标记的磁珠、荧光标记的抗标记抗体以及样品的混合物被组合并注入到使用精确流控技术排列微珠的仪器中。然后微珠通过激光器，基于其颜色或大小而得到分选或测量颜色强度，从而生成每个反应的定量数据。
当样品直接用荧光团标记时，系统只能读出和定量微珠上的荧光而不除去溶液中未结合的荧光团。所述试验可以通过区分不同颜色和大小的微珠而被多路复用。当样品直接需要未标记样品时可以实现实时测量。
标准试验步骤包括样品与抗标记抗体包被微珠的孵育、与生物素或荧光标记二抗的孵育以及荧光信号的检测。荧光信号可以结合在微珠上(通过给生物素化二抗添加链霉亲和素荧光结合物)并通过微珠分析器读出。取决于固定在微珠表面的抗标记，基于微珠的免疫测定可以是夹心型或竞争型的免疫测定。
测试棒
在一些另外的实施例中，液体生物样品中的中风生物标记采用测试棒或试纸来检测。所述测试棒通常包括一个液体不可渗透的壳体和一个具有一个或多个检测区的液体可渗透的棒。在一个实施例中，每个检测区包括一个结合生物样品中的中风生物标记的干燥结合剂。在另一个实施例中，所述干燥结合剂是一种标记结合剂。在另一个实施例中，所述测试棒还可包括一个指示所述化验测试己经满意执行的对照区，即所述结合剂存在于所述测试棒中并且在检测过程中能流动起来并沿着流动通道运输。所述对照区也可以指示上述装置中的所述结合剂有免疫化学反应的能力，确认所述装置的化学完整性。当考虑到所述装置在一定温度范围内的干燥条件下时，这是非常重要的。所述对照区通常置于所述检测区的下游并且，例如可以包括一个用于标记结合剂的固定结合剂。所述标记结合剂可以在所述对照区和检测区的上游旁边以可活动的形式存在。所述标记结合剂可以与用于所述中风生物标记的标记结合剂相同或不同。
在一个实施例中，所述测试棒包括一个处于一个或多个流动通道的上游并与其可变连接的多孔样品接收器。所述多孔样品接收器可以通用于所有化验。这样，加入所述装置的通用样品施加区域的液体样品可以沿着一个或多个流体通道流到各自的检测区。多孔样品接收器可以在壳体中或者至少部分地伸出所述壳体，并且可用来例如收集体液。所述多孔样品接收器也可以作为液体储存器。所述多孔样品接收膜可以由具有快速吸收液体能力的吸水、多孔或纤维材料制成。所述材料的孔隙可以是单向的(即孔或纤维方向全部或部分地与所述膜的轴向平行)或多向的(全方位的，以便于所述膜只有海绵状的无定型结构)。多孔塑料材料，例如聚丙烯，聚乙烯(优选非常高的分子量的)，聚偏二氟乙烯，乙烯乙酸乙烯酯，丙烯腈，聚四氟乙烯-乙烯都可以使用。其它合适的材料包括玻璃纤维。
如果需要，可以在载体材料的远端提供一个吸收"槽"。所述吸收槽可以包括，例如，Whatman3MM层析纸，并且应该提供足够的吸收能力以保证任何未结合的标记的结合试剂冲出所述检测区。作为这个槽的替代方案，具有超出所述检测区的长度的多孔固相材料就足够。
随着检测区的结合剂的应用，可以对所述多孔固相材料的多余部分进行处理以用来阻断任何剩下的结合位点。通过例如蛋白(例如牛血清白蛋白或牛奶蛋白)、或者聚乙烯醇、乙醇胺，或它们的组合治疗能够实现阻断。为了协助标记的结合剂在多孔载体被样品润湿时自由移动，所述多孔载体可以进一步包含一种糖，例如蔗糖或乳糖和/或其他物质，例如聚乙烯醇(PVA)或聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)。这样的材料可能，例如在标记结合剂被应用的区域作为水溶液保存。这样的材料可以先用于多孔载体，接着用于所述标记;或者，这些材料可以与所述标记混合并用于所述多孔载体或两者的组合。这样的材料可以置于所述标记结合剂的上游相邻或旁边。
或者，所述多孔载体在制备环带可以不被堵塞，相反，用于堵塞所述多孔载体的物质包含在所述多孔载体的上游的材料中。在潮湿的试片上，用于堵塞所述多孔载体的物质被驱动并且所述堵塞物流进并穿过所述多孔载体，在流动过程中堵塞。所述堵塞物包括蛋白，例如牛血清白蛋白和酪蛋白，以及如PVP，PVA等聚合物以及糖和如Triton-XlOO的洗涤剂。所述堵塞物可以存在于大孔载体材料中。
所述干燥的结合剂可以设在包含检测区的多孔载体材料的上游的多孔载体材料上。所述上游的多孔载体材料可以是大孔的。所述大孔载体材料应该是低的或非蛋白结合的，或应该是易于用如BSA或PVA等试剂堵塞的，以使非特异结合最小化，并且促进在大孔载体材料被液体样品润湿后所述标试剂的自由流动。如果必要，所述大孔载体材料可以采用表面活性剂或溶剂预处理，赋予其更好的亲水性并促进液体样品的快速吸收。大孔载体的合适材料包括塑料材料如聚乙烯和聚丙烯等，或其它材料如纸或玻璃纤维。在标记结合剂用可检测颗粒标记的情况下，所述大孔载体材料可以具有比所述颗粒标签的最大颗粒尺寸大至少十倍的孔径大小。孔径越大越好释放所述标记试剂。作为大孔载体的替换方案，标记结合剂可被放在所述检测区的上游的非多孔底板上，所述非多孔底板形成所述流动通道的一部分。
在另外一个实施例中，所述测试棒还可以包括用于接收液体样品的样品接收膜。所述样品接收膜可以伸出所述壳体。
所述壳体可以由液体不可渗透材料构成。所述壳体希望是排除环境光的。如果少于10％，优选少于5％，并且最优选少于1％的可见光由所述装置的外部穿透到其内部的话，所述壳体将被认为是基本上排除环境光线的。不透光的合成塑料材料例如聚碳酸酯，ABS，聚苯乙烯，聚苯乙烯，高密度聚乙烯，或包含适当阻光颜料的聚丙烯，是用于制造所述壳体的合适选择。可以往所述壳体的外面设置孔隙，与在壳体中的内部空间的试验相通。或者，所述孔隙的作用是允许多孔样品接收器从所述壳体伸出到壳体外的位置。
微阵列
在另外的实施例中，所述中风生物标记采用在其表面色含有固定的中风生物标记特异抗体的蛋白质微阵列来检测。所述微阵列可用于免疫夹心实验法，其中所述微阵列上的所述抗体捕获测试样品中的中风生物标记并且所述捕获的标记通过特异性结合所述捕获的标记的第二抗体所检测。在优选实施例中，所述第二抗体是生物素化的或酶标记的。所述检测通过随后与链霉亲和荧光共轭(用于荧光检测)或酶底物(用于比色检测)的孵育来完成。
通常微阵列试验包含多个孵育步骤，包括与样品的孵育和与多种试剂(例如:第一抗体、第二抗体、报告试剂等)的孵育。在孵育步骤之间需要重复冲洗。在一个实施例中，所述微整列是采用仅仅需要一个或两个孵育步骤的快速分析模式进行的。可以想像出，通过将蛋白微阵列曝露到一个样品和所有必须试剂的混合物中可以在一个单个孵育步骤中形成一个可检测的免疫复合物(例如:捕获的中风生物标记/抗标签抗体/标签复合物)。一个实施例中，所述第一抗体和第二抗体是相同的抗体。
在另一个实施例中，所述蛋白微阵列提供一种竞争性免疫检测。简要地，一个包括有固定的抗标记抗体的微阵列在标记的中风生物标记标准品存在的情况下与测试样品孵育。所述标记的中风生物标记与样品中未标记的中风生物标记竞争性结合所述固定的抗原特异性抗体。在这样的竞争性反应中，测试样品中所述特异性中风生物标记的浓度增加会导致所述标记的中风生物标记标准品与所述固定的抗体的结合减少以及因此降低标签信号强度。
所述微阵列能够以手动、半自动或全自动的模式进行。手动模式指手动操作所有试验步骤包括试剂和样品到微阵列的转移、样品孵育和微阵列冲洗。半自动模式指手动操作样品和试剂到微阵列的转移，而自动地进行孵育和冲洗步骤。在全自动模式中，三个步骤(样品/试剂转移，孵育和冲洗)可以通过计算机或者具有键盘的集成线路板单元控制。例如，所述微阵列可以采用蛋白分析工作站(PerkinElmerLifeSciences，Boston，Mass.)或分析1200TM.T作站(ZyomyX，Hayward，Calif.)来进行处理。荧光、比色和化学发光的扫描仪可用于检测微阵列信号和捕获微阵列图像。基于微阵列分析的定量也可以通过其它方式实现，例如质谱分析和表面等离子体共振。捕获的微阵列图像可以通过独立的图像分析软件分析或采用图像采集和分析软件包进行分析。例如，抗原微阵列的定量可以采用基于PMT荧光扫描仪一ScanArray3000(GeneralScanning，Watertown，Mass.)或基于CCD的比色扫描仪-VisionSpot(AlliedBiotech，ljamsville，Md.)来实现。通常，图像分析可以包括通过单独的软件包进行的数据获取和分析报告的制作。为了加快从图像获取到生成分析报告的整个分析过程，所有分析步骤包括图像捕获、图像分析和报告生成，可以限于一个软件包和/或由一个软件包控制。这样一个统一的控制系统可以以用户友好的方式提供图像分析和分析报告的生成。
植入式生物传感器
对于危险状况下的实验对象，中风生物标记可以采用植入式生物传感器检测。生物传感器是以产生电信号为生物反应结果的电子装置。在一个实施例中，所述生物传感器采用抗体、受体、核酸或一个结合对的其它成员去结合中风生物标记，通常是结合对中的另一个成员。生物传感器可在不需要自动免疫分析系统通常所要求的样品制备和/或样品分离步骤的情况下，用于检测血液样品中中风生物标记的存在。
在一个实施例中，所述传感器是一个纳米设备。所述纳米传感系统包括附着在纳米线上的生物识别元件和能够检测所述纳米线相关属性的探测器。所述生物识别元件是识别对中的一个成员(例如所述中风生物标记的受体或抗中风生物标记抗体)而被测量的中风生物标记是所述识别对中的另一个成员。优选地，所述纳米线传感器包括其上形成用于产生栅电极的外表面的半导体纳米线，和与导体电接触以形成源极电极的第一端部以及与导体电接触以形成漏极电极的第二端部。在一个实施例中，所述传感器是包括由绝缘材料制成的基片、源电极，漏电极和排列在那里并且其间具有附着在纳米线表面的生物识别元件的半导体纳米线的场效应晶体管。当在生物识别元件和它的特异性结合配体之间发生结合时，将在场效应晶体管的电流电压特性上产生可检测的变化。
在另一个实施例中，所述传感系统包括传感器阵列。所述阵列中的一个或多个传感器与防止相关联的传感器与周边环境发生相互作用的保护膜相连。在检测时，所述保护膜可能会被禁用，以允许所述传感器开始运行从而与周围的液体或组织相互反应以便于所述生物识别元件能够与它的结合对中的另一个成员相互作用，如果所述识别对成员存在的话。
在另一个实施例中，所述保护膜由能够氧化的导电性物质形成，是生物兼容性的，生物可吸收的，并且可以在溶液例如一定电势下的血液中能够溶解的。例如，传感器可以在被导电材料例如生物相容性金属或电腐蚀聚合物覆盖的基片的孔中形成。在另一个实施例中，所述保护膜采用在预定时间段之后溶解的材料制成。可植入生物传感器在例如，美国专利申请公开号N0.20050049472中有描述，在此引入本文作参考。
标准值的特异性和灵敏性的测定
在本发明中，中风生物标记的标准表达水平，例如生物样品中中风生物标记的浓度，可以统计地确定。例如，可以测量健康个体的生物样品中的中风生物标记的浓度来统计地确定所述中风生物标记的标准浓度。当可以收集到统计学上足够的样本，在平均值的两次或三次标准偏差(S.D.)范围内的值通常被用作标准值。因此，对应于平均值+2X.S.D.或平均值+3XS.D的值可以用作标准值。所述标准值设置理论上分别包括90％和99.7％的健康个体。
可选地，标准值也可以基于中风患者的实际表达水平(例如中风生物标记的血浓度)来设定。一般地，这种方式设定的标准值最小化假阳性百分比，并且选自满足能够最大化检测灵敏度的条件的值域。这里，假阳性百分比指在健康个体中，其生物样品中的中风生物标记的浓度被判断为高于或低于标准值的患者所占的百分比，。相反地，在在康个体中，其生物样品中所述中风生物标记物的浓度被判断分别低于或高于标准值的患者所占的百分比，表明了特异性。即，假阳性百分比和特异性百分比总和总是1。所述检测灵敏性是指，在已确定存在中风的群体内的所有中风患者中，其生物样品中的中风生物标记浓度被判断为偏离标准值的患者所占的比例
如本文所用，术语"测试灵敏性"是指确定中风的筛选试验的能力，其特征在于是具有高灵敏性无假阴性的测试，也是与中风患病率无关的测试。所述测试灵敏性的计算公式为真阳性测试除以总的受影响的受试患者，以百分数表示。"测试特异性"是指筛选测试，其在没有中风的情况下实际上是负的，具有高特异性和低假阳性，并且与中风患病率无关。所述测试特异性的计算公式是真阴性测试除以没有受影响的受试者，以百分数表示。
术语"ppV"(阳性预测值)是通过阳性测试为中风的患者百分数，从而评估阳性测试的可靠性。计算公式:
1.ppV=(真阳性值)/真阳性值+假阳性值).
术语"NPV"(阴性预测值)指通过阴性测试确定没有中风的患者，从而评估阴性测试的可靠性。计算公式:
2.NPV=（真阴性值)/(真阴性值加上假阴性值).
如上述关系表明，作为评价诊断准确性的指标的每一个灵敏性值、特异性值、阳性预测值和阴性预测值，都随着用于判断生物样品中中风生物标记的浓度水平的标准值而变化。
标准值通常被设定使得假阳性比例低而灵敏性高。尽管如此，显然正如上述关系，在假阳性比例和灵敏性之间存在权衡。就是说，如果所述标准值降低，所述检测灵敏性增加。尽管如此，由于假阳性比例也在增加，很难满足获得低假阳性比例的条件。考虑到这种情况，例如给出后续预测结果的值可以选作本发明的优选标准值:(1)假阳性比例是50％或更低(也就是说特异性不低于50％的标准值)的标准值，以及(2)灵敏性不低于20％的标准值。
所述标准值可以采用受试者工作特征(ROC)曲线来设定。ROC曲线是在纵坐标上显示检测灵敏度在横坐标上显示假阳性比例的曲线图。ROC曲线可通过绘制灵敏性和假阳性比例的变化来获得，其通过不断改变用于检测生物样品中中风生物标记的浓度高/低程度的标准值之后获得。
所述用于获得ROC曲线的"标准值"是暂时用于统计分析的值。所述用于获得ROC曲线的标准值通常可以在允许覆盖所有可检测标准值的范围内连续变化。例如，所述标准值可以往来源于分析样本的生物样品中的中风生物标记的最小和最大测量值之间变化。
基于获得的ROC曲线，优选的用于本发明的标准值可选自满足上述条件的范围。或者，标准值可基于ROC曲线来选取，所述ROC曲线通过在包括大多数在生物样品中测量的中风生物标记水平的范围内改变标准值而产生。
试剂盒
在又一个方面，本发明提供用于检测本发明中所述中风生物标记的试剂盒。例如，所述试剂盒可以包括用于检测一个或多个生物标记和一个或多个生物标记的一系列参考水平的试剂。
在某些实施例中，所述生物标记是从由白细胞介素-la(lL-la)、白细胞介素-lβ(lL-lβ)、白细胞介素lra(lL-lra)、白细胞介素3(lL-3)、白细胞介素2(lL-2)、白细胞介素4(lL-4)、白细胞介素5(lL-5)、白细胞介素6(lL-6)、白细胞介素7(lL-7)、白细胞介素8(lL-8)、白细胞介素9(lL-9)、白细胞介素10(lL-10)、白细胞介素12(P40)(lL-12(P40))、白细胞介素12(P70)(lL-12(P70))、白细胞介素13(lL-13)、白细胞介素15(lL-15)、白细胞介素11(lL-17)、表皮生长因子(EGF)、嗜酸细胞活化趋化因子(EotaXin)、成纤维细胞生长因子2(FGF-2)、铁蛋白轻链3配体(FTL-3ligand)、趋化因子叶actalkine、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、生长调节致癌基因(GRO)、干扰素a2(lFN-a2)、干扰素Y(lFN-Y)、干扰素诱导蛋白10(lP-10)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、单核细胞趋化蛋白3(MCP-3)、MCD、巨噬细胞炎症蛋白la(MlP-la)、巨噬细胞炎症蛋白lβ(MlP-lβ)、血小板衍生生长因子aa(PDGF-aa)、血小板衍生生长因子-aabb(PGDF-aabb)、调节活化正常T细胞表达和分泌的趋化因子(RANTES)、可溶性CD40配体(sCD4OL)、可溶性白细胞介素2-ra(slL2-ra)、肿瘤坏死因子a(TNF-a)、肿瘤坏死因子8(TNF-β)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)和表4、5、6、8中列出的基因组成的组中所选出的基因表达的基因产物。
在另外的实施例中，所述试剂盒包括用于生物标记板的检测试剂。在某些实施例中，所述生物标记板包括两种或更多种生物标记。在某些另外的实施例中，所述生物标记板包括五种或更多种生物标记。在某些另外的实施例中，所述生物标记板包括十种或更多种生物标记。在某些另外的实施例中，所述生物标记板包括二十种或更多种生物标记。
本发明所述试剂盒具有很多应用。例如，所述试剂盒可用于诊断受试者是否患有中风，中风有多严重，并且该受试者是多久前患上中风的。在另一个实施例中，所述试剂盒可用于测定受试者正经受的中风的类型。例如，在中风生物标记的类型上，和/或在所述受试者的特定生物标记的数量上的不同可以说明所述受试者是否经受了出血性中风或缺血性中风，或缺血性中风是否是大血管缺血性中风。又在另一个例子中，所述试剂盒可用于监测受试者的中风进展或者受试者对于治疗的反应，或确定应该用于该受试者的治疗类型。
在一个实施例中，试剂盒包括(a)特异性结合中风生物标记的抗体;和(b)检测试剂。所述试剂盒能够从上述材料中配制而成，并且之前关于所述材料的讨论(例如，抗体，检测试剂，固定的支撑物等)完全适用于此。在特定的实施例中，所述抗体是单克隆抗体。所述试剂盒的检测试剂可以包括第二标记的单克隆抗体。或者，此外，所述检测试剂可以包括标记的竞争性抗原。在某些实施例中，所述试剂盒还可以包括提供合适的操作参数的以标签或单独插页为形式的用法说明。
可选地，所述试剂盒还可以包括标准品或对照信息，以便于测试样品可通过与对照信息标准相比来确定在样品中检测到的标记测试量是否符合通常的中风诊断、中风类型、中风严重程度、自中风发生后消逝的时间、中风进展、和/或受试者的治疗效果的诊断值。
可选地，所述试剂盒还包括提供合适的操作参数的以标签或单独插页为形式的用法说明。例如，所述试剂盒可以具有告知消费者在样品接触到探针上之后如何冲洗探针的标准的用法说明书。在另一个实施例中，所述试剂盒可以具有为降低样品中蛋白复杂性而对样品进行预分馏的用法说明。在另一个例子中，所述试剂盒可以包含用于自动分馏或其他步骤的用法说明。
通过以下例子进一步阐明本发明，所述例子不应该被理解为限制。本发明中引用的所有参考文献，专利和公开的专利申请的内容，包括附图和表格，都引入本文作为参考。
实施例1.在非人类灵长类动物中风模型中生物标记的测定
三只幼年健康的无特定病原(SPF)猕猴(Macaco，mulata)，体重4.5～6.5公斤，通过全血血球计数和血清化学分析避行代谢疾病筛查。还进行了凝结评价试验。动物于手术前12个小时被禁食。通过氯胺酮(10-2Omg/kglM)诱导麻醉。阿托品(O.Q4mg/kg)作为麻醉预先服药的部分经肌肉注射给药。向大隐静脉恒速注入异丙酚(0.3-0.4mg/千克/分钟)来维持麻醉。放置了3.0-3.5mm直径的气管导管。动物连接着包括心电图、脉冲血氧、capnographer、RR、HR、RR，肛温仪的监测设备(BM5VET，BionetAmerica，CA)，并置于空气加热器上(BairHUggeCArizant，EdenPrairie，MN)。生理变化被保持在正常范围内。采用优碘和酒精无菌擦洗猴子的腹股沟区域之后，采用2％的利多卡因浸润该区域以防止股动脉的血管痉挛并进行局部麻醉。采用了由腹股沟股动脉的脉动波附近的缺口构成的Seldinger技术。采用MicropUnctUrelntrodUcerSet21G造影穿刺针(CookMedical，Bloomington，lN)，导线被引入并且设置了4fr.股鞘，同时采用普通的生理盐水压力袋冲洗。4fr.的诊断导管(TerUmo，Somerset，NJ)被引入在a0.035fr.导线上方(Terumo，Somerset，NJ)，并且引导腹主动脉直至主动脉弓，并且从那儿给所述头臂动脉干、颈总动脉和颈内动脉干插上导管。导管位置的确认通过采用C型臂透视系统在数码血管造影控制下注射造影剂(Conray;Covidien，Hazelwood，MO)来实现。具有Traxcess0.014导线(Terumo，Somerset，NJ)的快速运输微导管(Cordis，Bridgewater，NJ)被引入并引导进入到所述右侧大脑中动脉(MCA)的Ml段，所述右侧大脑中动脉(MCA)的Ml段的闭塞采用3cc注射器经由处于生理盐水中的所述导管向所述右侧大脑中动脉(MCA)注入6至8(2mm长)的血栓丝线来实现。所述切口采用非吸收性的无菌缝合进行封口，并将所述猴子转移到核磁共振成像(MRl)设备处成像。核磁共振成像后，动物被运回至康复室并由兽医人员密切监控。当吞咽反射恢复后移除所述气管导管。它们一恢复至能够坐立，即被放回至它们的笼子中。
在中脑动脉闭塞(MCAO)后立即(核磁共振成像后的1～3小时当动物仍处于手术麻醉状态下时)及24小时后进行核磁共振成像。使用具有8通道感应头线圈的飞利浦Achieva1.5-T扫描仪(PhilipsMedicalSystems，Best，Netherlands)采集图像。垂直于膝下表面与胼服体的压部之间的交接线获取冠状切片，这有利于第二成像时段同类切片的重新获取。T2加权图像采用具有0.76×0.76×3mm三维像素分辨率(TE=110毫秒，TR=2316至2322年毫秒，涡轮增压系数=10，NSA=2，FOV=17厘米，矩阵==224×222，30片，无间隙)的涡轮自旋回波序列获得。扩散加权图像采用只有1.72×1.72×2mm分辨率(b值=0和1000s/mm2时，TE=58毫秒，TR=9，977-10，047毫秒，SENSE=2，NSA=6，FOV=11厘米，矩阵=64X64，41片，无间隙)的单杆自旋回波EPl序列获得。在采用扫描仪的扩散分析软件生成表观扩散系数(ADC)图之前，先注册所述扩散加权图。梗塞体积近似于ADC图和T2加权图像。兴趣区域(ROl)由放射科医生采用OsiriX软件包(Rossetetal.，2004)在一片片切片的基础上手工绘出。所述兴趣区域沿着损伤边沿绘出。总的损伤体积约等于通过所有切片的总兴趣区域乘以相应的切片厚度。
自发行为同时在两个不同的神经量表上记录:标准神经量表(Spetzleretal.1980;Macketal.2003;andD'Arceuiletal.2006)和面向任务的神经量表(Macketal.2003)。每个受试者被观察两次:MCAO前一天或两天以建立基线行为，MCAO后20～23小时测试梗塞结果。在每一阶段中，通过事先未被告知哪一边的大脑被实施MCAO的一个观察者记录行为30分钟。除了人工记分，每阶段中的试验动物还通过视频记录。由于通过标准神经量表获得的分数在顺序量表中计算，因此采用nonpar回归Wilcoxon秩和检验进行分析。另一方，通过面向任务的量表获得的分数在数字量表中计算，因此这些数据采用配对t测验进行分析。
进行最后一次核磁共振之后，动物在深度麻醉下用pbs灌注。迅速取出大脑，连续切割成2cm的冠状切片，并根据核磁共振成像数据从梗塞周围区域取走活检穿孔器。为了测量梗塞，切片用2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色然后直接放置于10％福尔马林中。冠部2Omm被固定，冰冻的切片用于组织化学。根据制造商的用法说明进行FlUorojadeB。切片采用抗卒灭介质固定。
静脉血样品在预封闭时，以及封闭后的1小时，2小时和24小时时间点收集。血清和外周血单核细胞(PBMCs)被分离并存于-80℃用于蛋白和RNA分析。脑脊液(CSU按照成熟的方法收集。
图1的A-D通过扩散加权(DWl)和T2加权图显示了其中一只猴子的脑梗塞演变的典型核磁共振图像。在MCAO之后立即在被观察的三子只猴子中的两只中观察了梗塞组织中的限制性扩散(图1A和1E)。就如在人类中风患者中所见，任一个猴子的T2加权图中(图1B)都出现最小或无明显异常。如扩散加权成像所示，所有猴子的梗塞在MCAO之后的24小时扩散开(图1C)。24小时时(图1D)也出现相应增强的T2信号。同时，梗塞的大小在动物间存在差异，与前一天获得的测量值相比计算得到的梗塞体积有所增加(图lE)。采用面向任务神经量表，MCAO前及后获得的评分比较显示出在肢端力量以及协调性方面的选择性和显著性(P＜0.05)的损伤，但没有观察到测量意识和自我意识(行为)或语气和姿势上的差异。面向任务的神经量表反映出动物的左臂运动神经功能的强烈损伤和一般神经行为状态微小的或无损伤。
例2.在中风的非人类非人类灵长类动物模型中的RNA/蛋白分离和微阵列分析
外周血单核细胞(PBMCs)和脑活检穿孔器的RNA和蛋白采用TRlZOL(lnVitrogen，lnc.，Carlsbad，CA)根据厂商用法说明进行分离。对于微阵列分析而言，外周血单核细胞的总RNA被反转录成为双链的cDNA。cRNA采用RNA反转录标签试剂盒（EnzoDiagnostics，Farmingdale，NY，USA)合成。生物素标记的cRNA采用GeneChipSampleCleanUpModUle(Affymetrixlnc，SantaClara，CA，USA)纯化。将2Oug所述体外转录产物置于片段化缓冲液中于94℃条件下进行35分钟的片段化，片段化之后，15μg生物素化的cRNA被杂交到
Figure GDA00003505028000201
RhesUs MacaqUe Genome AWay(Affymetrix，lnc.SantaClara，CA)上。所述芯片在45℃杂交16小时，然后冲洗，采用链霉亲和素藻红蛋白染色，并根据产品指南扫描(
Figure GDA00003505028000202
30007GScanner)。
采用支持探针集汇总和支持3'表达产物的CHP文件生成的AffymetrixExpressionConsoleTM软件进行数据分析。产生的CHP数据采用GenespringGX1O(AgilentTechnologies，SantaClara，CA)和Genesis(lnstitute for Biomedical Engineering，GrazUniversity of Technology(lBMT-TUG)，AUstria)软件进行修正和进一步分析。采用双向方差分析(2-wayANOVA)的各个时间点之间升高或降低两倍或更多的基因表达值在统计学上具有显著性(P＜O.005)。数据分析采用ExpressionConsole(Affymetrixlnc，SantaClara，CAUSA)和GenespringGX-1O(Agilent Technologies，Santa Clara，CA)软件进行初步分析，修正和重复分析。lngenuity Pathway Analysis工具(lngenuity Systems，www.ingenuity.com)用于分析基因网络、生物功能和一般途径。包括基因标识符和相应表达值的数集被上传到该应用中。每个基因标识符映射新颖途径知识库中对应的基因对象。单个阵列分析用于建立基因表达谱数据库。表达控制板对每个芯片进行修正。p值检验(设定p＜O.5)用于统计确定转录于是否在芯片上表达。该软件基于p值为每个转录本生成存在(P)命令，临界(M)命令或缺失(A)命令。如果统计逻辑产生了存在命令，就认为转录产物差异表达，然后归类为"已知基因"或"未知基因"。在表1～3中显示了那些在所有对照中(闭塞前)中缺失而在任何其它时间点存在的基因。自组织映射聚类和分类聚类被用于鉴定不存在于中风前的血液中而是在MCAO之后以特定形式被诱导出的候选物。在基因组和蛋白质组分析中都出现的生物标记被鉴定出来。lPA被用于预测这些蛋白在血液中是否正常表达或者也许在对缺血和神经元损伤的反应中从大脑中释放出来。
图2是具有代表性的图像，显示了与在基线处不表达或低表达相比(绿色条)，在非人类灵长类(NHP)中风模型中风之后在PBMCs(红色条)中数种基因被诱导。在非人类灵长类(NHP)中风模型中差异调控的基因列于表1-3中。相应的人类基因列在表4～6中。这些基因产物可以用作中风的即时早期生物标记(中风后1小时)、早期生物标记(中风后2小时)或晚期生物标记(中风后24小时)。
例3.对局部缺血后的猴子的血液、脑脊髓液和脑组织进行的高通量蛋白质组学分析
采用流式荧光检测技术、蛋白质印迹、多肽组学和质谱法对从基因组学分析中鉴定出来的中风生物标记候选和新蛋白进行检验。
在MCAO前以及中风后1，2和24小时收集动物血液。采用多重磁珠免疫分析(LUMlNEX1OO，LUminexCorporation，AUstin，TX，USA)按照产品说明书并采用BiosoUrce的试剂盒(Cat.No.;LHC0001，LHCO151，LHC9121，LHC0171，lnvitrogen，Carlsbad，CA，USA)对血清中的细胞活素、趋化因子和生长因子，脑脊液和脑提取物进行分析。采用基于磁珠的多种比色细胞活素免疫分析结合流式荧光检测技术以及人类特异性磁珠组(BioRad，SanDiego，CA)，根据产品说明书对三只猕猴梗塞前以及1，2和24-小时血清样品，同时评估循环细胞活素，趋化因子和生长因子{白细胞介素-la(lL-la)、白细胞介素-β旧(lL-lβ)、白细胞介素lra(lL-lra)、白细胞介素3(lL-3)、白细胞介素2(lL-2)、白细胞介素4(lL-4)、白细胞介素5(lL-5)、白细胞介素6(lL-6)、白细胞介素7(lL-7)、白细胞介素8(lL-8)、白细胞介素9(lL-9)、白细胞介素10(lL-10)、白细胞介素12(P40)(lL-12(P40))、白细胞介素12(P70)(lL-12(P70))、白细胞介素13(lL-13)、白细胞介素15(lL-15)、白细胞介素17(lL-17)、表皮生长因子(EGF)、嗜酸细胞活化趋化因子(EotaXin)、成纤维细胞生长因子2(FGF-2)、铁蛋白轻链3配体(FTL-3ligand)、趋化因子Fractalkine、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、生长调节致癌基因(GRO)、干扰素a2(lFN-a2)、干扰素Y(lFN-Y)、干扰素诱导蛋白10(lP-10)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、单核细胞趋化蛋白3(MCP-3)、MCD、巨噬细胞炎症蛋白la(MlP-la)、巨噬细胞炎症蛋白lβ(MlP-lβ)、血小板衍生生长因子aa(PDGF-aa)、血小板衍生生长因子aabb(PGDF-aabb)、调节活化正常丁细胞表达和分泌的趋化因子(RANTES)、可溶性CD40配体(sCD4OL)、可溶性白细胞介素2-ra(slL2-ra)、肿瘤坏死因子a(TNF-a)、肿瘤坏死因子8(TNF-β)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)}。其结果由采用相关重组人类蛋白(BioRad)生成的五参数适合标准曲线进行类推。蛋白也采用蛋白印迹和斑点杂交分析中的抗体进行验证。除了上述提到的循环细胞活素、趋化因子和生长因子，通过微阵列图像和与其它公开文献中的中风生物标记相比而鉴定的蛋白表达也被检测（Foerchetal.，2009)。图3A显示了非人类非人类灵长类动物MCAO后血清中的细胞因子单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的蛋白水平。采用流式荧光检测技术分析，MCP-1在MCAO后1～2小时明显增加然后在中风24小时后回落至基线。对PBMCs中蛋白的蛋白印迹分析表明在血清中发现的增加的MCP-1在非人类灵长类动物中风后的细胞中被诱导出(图3B).
血浆或血清样品(～0.5μl)首先按所述的在20，0OO×g条件下离心20分钟通过Microcon(Milliporecat#42406)YM-10滤膜来除去较大的蛋白(Faith Maria，etal.MCP2006;5(6):998-1005)。在分离之前将滤液酸化至乙酸终浓度为0.25%。产生的多肽随后采用5%至35%的线性梯度乙腈(Sigma)水溶液(BUrdickandJackson)在0.1X5OmmC18柱(MichromBioresources)上分离30分钟以上。该柱然后用80％乙腈冲洗10分钟，接着用2%乙腈再重新平衡10分钟。采用Excalibur2.2软件在LTQ质谱仪(ThermoScientific)上收集光谱。DTA生成的最小信号设置为200.0，隔离宽度为2.00，修正的碰撞能量35.0。前体扫描后进行三种最强离子的MS/MS扫描。采用BioWorks3.3软件在人类数据库中搜索原始材料。每个样品重复一次并且所有的由BioWorks生成的SRF文件都采用ProteolQ(Bioinquire，AthensGA)进行比对。
每个样品的置信水平从基于诱饵数据库搜索决定的0.05的错误发现率开始设定。图4代表性地显示了非人类非人类灵长类动物中风模型中风后血清中几种蛋白增加(红色栏)和降低(绿色)。其中的数字表示血清中与特异蛋白的存在相对应的单个肽的数量。蛋白质组学分析的结果归纳在表7和8中。
以上描述是为了教导本领域普通技术人员如何实施本发明，并且不想详细描述那些对于本领域技术人员在读到本发明书时能想到的所有的显而易见的修改和变形。尽管如此，所有那些显而易见的修改和变形都被包括在本发明的范围中，这将在以下权利要求中被限定。所述权利要求意在覆盖任何有效达到预期目标的顺序中的步骤和元素，除非文中有明确相反的指示。
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Figure GDA00003505028000241
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Figure GDA00003505028000371
Figure GDA00003505028000381
Figure GDA00003505028000391
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Figure GDA00003505028000781
表4.通过RNA分析鉴定的立即早期(中风1-hr后)生物标记
基因识别符号 基因名称 氨基酸序列
NP_006546.1 突触小泡蛋白同源物YKT6 SEQIDNO:1
NP_001776.1 胞苷脱氨酶 SEQIDNO:2
EAW60338.1 假定蛋白FLJ20232 SEQIDN0:3
EAW67321.1 中心体蛋白164kDa SEQIDNO:4
EAW71459.1 WD重复结构域8 SEQIDNO:5
EAW85140.1 锌指CCCH-型蛋白7A SEQIDNO:6
EAW89539.1 TIMP金属肽酶抑制脐2 SEQIDNO:7
EAW96888.1 锌指CCCH-型蛋白10 SEQIDNO:8
BAB47442.1 KLAA1813蛋白 SEQIDNO:9
BAB59061.1 PexlP-634del690 SEQIDNO:10
AAH09411.1 WDR77蛋白 SEQIDNO:11
NP_001078929.1 连环蛋白δ-1异构体1A SEQIDNO:12
NP_071426.1 富含亮氨酸重复序列蛋白4前体 SEQIDNO:13
NP_001099038.1 驱动蛋白样蛋白KIFl3A异构体d SEQIDNO:14
BAG53572.1 未命名蛋白产物 SEQIDNO:15
BAG54027.1 未命名蛋白产物 SEQIDNO:16
BAG57307.1 未命名蛋白产物 SEQIDNO:17
BAG63947.1 未命名蛋白产物 SEQIDNO:18
BAG64130.1 未命名蛋白产物 SEQIDNO:19
BAG58900.1 未命名蛋白产物 SEQIDNO:20
NP_148978.2 细胞周期蛋白依赖性激酶16异构体2 SEQIDNO:21
NP_001135741.1 维他命k依赖性γ-羧化酶异构体2 SEQIDNO:22
NP631981.2 核仁蛋白6γ异构体 SEQIDNO:23
AAM94901.1 AF311906_1LIR-D1前体 SEQIDNO:24
AAH35404.1 PTK2蛋白 SEQIDNO:25
NP_733840.1 MLR家族成员X1异构体2 SEQIDNO:26
AAN75525.1 Rap1-相互作用配体分子 SEQIDNO:27
NP_001171187.1 灼u叩pel-样因于11异构体b SEQIDN0.28
NP_001171726.1 三甲基赖氨酸双加氧酶，线粒体异构体2前体 SEQIDNO.29
CAD91343.1 细胞色素P450 SEQIDNO:30
NP_115652.2 长斜方莆结构域恒白1 SEQIDNO:31
NP_079480.2 traB结构域蛋白 SEQIDNO:32
NP_954574.1 组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶setd3异构体b SEQIDNO:33
NP_000112.1 促红胞生成素受体前体 SEQIDNO:34
NP_001453.1 N-甲酰肽受体2 SEQIDNO:35
NP_0024201 基质金属蛋白酶-19异构体rasi-1前蛋白原 SEQIDNO:36
NP_003098.1 转录因子SOX-4 SEQIDNO:37
NP_003134.1 单链DNA结合蛋白，线粒体前体 SEQIDBO:38
AAH16977.2 PBX3蛋白 SEQIDNO:39
NP_001973.2 受体酪氨酸蛋白激酶erbB-3异构体1前体 SEQIDNO:40
CAH72013.1 RIO激酶1(酵母) SEQIDNO:41
2IRT A链，重组白细胞介素-1受体括抗剂蛋白的初始晶体学分析 SEQIDNO:42
BAA91249.1 未命名蛋白产物 SEQIDNO:43
NP_0004472 亚硫酸盐氧化酶，线粒体前体 SEQIDNO:44
CAB8661。1 xce SEQIDNO:45
NP_057692.1 含armadillo重复的X-连锁蛋白1 SEQIDNO:46
NP_057696.2 线粒体铁转运蛋白1(mitoferrin-1) SEQIDNO:47
NP_064530.1 内吞蛋白-B2 SEQIDNO:48
表5.通过RNA分析鉴定的早期(中风2小时后)生物标记
基因识别符号 基因名称 氨基酸序列
NP_060288.3 含WD重复序列的蛋白WRAP73 SEQIDNO:49
NP_001776.1 胞嘧啶核甘脱氨酶 SEQIDNO:50
NP_001128651.1 棕榈酰转移酶ZDHHC3异构体1 SEQIDNO:51
NP_004197.1 囊泡转移蛋白SEC22c异构体b SEQIDNO∶52
NP_001001890.1 矮小相关转录因子1异构体AML1b SEQIDNO∶53
NP_000457.1 过氧化物酶体生源因子1 SEQIDNO∶54
NP_071426.1 富亮氨酸重复序列蛋白4前体 SEQIDNO:13
NP_003134.1 单链DNA结合蛋白，线粒体的 SEQIDNO∶55
NP_001003700.1 ras-应答元件结合蛋白1异构体3 SEQIDNO∶56
NP_001099038.1 驱动蛋白样蛋白KIF13A异构体d SEQIDNO∶57
NP_877434.2 E3泛素蛋白连接酶RNF144B SEQIDNO∶58
NP_O31381.2 热休克蛋白HSP90-β SEQIDNO∶59
NP_001011516.1 PDZ和LIM结构域蛋白5异构体e SEQIDNO∶60
NP_000815.1 甘氨酸受体亚基β异构体A前体 SEQIDNO∶61
NP_060516.2 具有G补丁和RHA结构域的血管生成因子1 SEQIDNO∶62
NP_057113.1 脱氧酶/还原酶SDR家族成员7前体 SEQIDNO∶63
NP_954574.1 组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶setd3异构体b SEQIDNO∶33
NP_057696.2 线粒体铁转运蛋白1(mitorferrin-1) SEQIDNO∶47
NP-039Z58.1 神经调节蛋白1前体，膜结合异构体异构体HRG-α SEQIDNO∶64
NP_005598.3 粘着斑激酶1异构体b SEQIDNO∶65
表6.通过RNA分析鉴定的晚期(中风24-hr后)生物标记
Figure GDA00003505028000801
Figure GDA00003505028000811
Figure GDA00003505028000821
Figure GDA00003505028000831
Figure GDA00003505028000841
表8通过蛋白质组学研究鉴定的生物标记
Figure GDA00003505028000851
Figure GDA00003505028000861
Figure IDA00003052169700011
Figure IDA00003052169700031
Figure IDA00003052169700041
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Figure IDA00003052169700301

Claims (20)

1.确定受试者中风的方法包括:
（a）从受试者样品中测量一种或多种生物标记的水平；
（b）将所述一种或多种生物标记的水平与所述一种或多种生物标记的参考水平进行比较；
所述一种或多种生物标记包括从白细胞介素-la（IL-la）、白细胞介素-Ιβ（IL-Ιβ）、白细胞介素lra（IL-lra）、白细胞介素3（IL-3）、白细胞介素2（IL-2）、白细胞介素4（IL-4）、白细胞介素5（IL-5）、白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素7（IL-7）、白细胞介素8（IL-8）、白细胞介素9（IL-9）、白细胞介素10（IL-10）、白细胞介素12(p40)（IL-12(p40)）、白细胞介素12(p70)（IL-12(p70)）、白细胞介素13（IL-13）、白细胞介素15（IL-15）、白细胞介素17（IL-17）、表皮生长因子（EGF）、嗜酸细胞活化趋化因子（Eotaxin）、成纤维细胞生长因子2（FGF-2）、铁蛋白轻链3配体（FTL-3ligand）、趋化因子Fractalkine、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、生长调节致癌基因（GRO）、干扰素a2（IFN-a2）、干扰素γ（IFN-γ）、干扰素诱导蛋白10（IP-10）、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）、单核细胞趋化蛋白3（MCP-3）、MCD、巨噬细胞炎症蛋白la（MIP-la）、巨噬细胞炎症蛋白Ιβ（ΜΙΡ-Ιβ）、血小板衍生生长因子aa（PDGF-aa）、血小板衍生生长因子aa bb（PGDF-aa bb）、调节活化正常T细胞表达和分泌的趋化因子(RANTES)、可溶性CD40配体（sCD40L）、可溶性白细胞介素2-ra（sIL2-ra）、肿瘤坏死因子a（TNF-a）、肿瘤坏死因子β（TNF-β）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）所组成的组合中选择的基因和表4、5、6、8中列出的基因的表达产物。
2.根据权利要求1的方法，所述一种或多种生物标记是多聚核苷酸。
3.根据权利要求1的方法，所述一种或多种生物标记是肽。
4.根据权利要求1的方法，所述步骤（a）包括在受试者样品中测量三种或多种生物标记组。
5.根据权利要求4的方法，所述三种或多种生物标记包括至少一个表4中所列基因的表达产物、至少一个表5中所列基因的表达产物以及至少一个表6中所列基因的表达产物。
6.根据权利要求4的方法，所述三种或多种生物标记包括从CD163、δ型蛋白激酶C（PKCdelta）、丙酮酸激酶、肌肉（丙酮酸激酶M2）、甲状腺激素受体相关蛋白2、甲状腺激素受体相关蛋白5、Nod样受体家族蛋白、含pyrin域1蛋白（pyrin domain containing1）、胰核糖核酸酶（Rnase1）以及细胞色素b-245、β多肽组成的组合中选择的至少一个基因的表达产物，
从CD163、蛋白激酶C亚型D（PKC delta）、蛋白激酶AKT1底物1（富含脯氨酸）异构体1、Cmtm3、WD重复蛋白19（WDR19）、α-2型FX胶原蛋白、甲状腺激素受体相关蛋白2、甲状腺激素受体相关蛋白5、Nod样受体（NLR）家族蛋白、含pyrin域1蛋白（pyrindomain containing1）、胰核糖核酸酶（Rnase1）以及补体因子H异构体前体组成的组合中选择的至少一个基因的表达产物，以及
从NOD9（NLRK1）、天门冬氨酰-tRNA合成酶、淋巴细胞质蛋白1（L-plastin）、几丁质酶1（壳三糖酶）、蛋白酶体α1亚基（PSMA4）、δ型蛋白激酶C（PKC delta）、Cmtm3、WD重复蛋白19、α-2型IX胶原蛋白、丙酮酸激酶M2（PKM2）、甲状腺激素受体相关蛋白2、甲状腺激素受体相关蛋白5、Nod样受体家族蛋白、含pyrin域1蛋白（pyrin domaincontaining1）、胰核糖核酸酶（Rnase1）、细胞色素b-245、β多肽以及补体因子H异构体前体组成的组合中选择的至少一个基因的表达产物。
7.根据权利要求1的方法，所述步骤（a）包括在受试者样品中测量六种或多种生物标记组。
8.根据权利要求7的方法，所述六种或多种生物标记包括表4所列至少两个基因的表达产物、表5所列至少两个基因的表达产物以及表6所列至少两个基因的表达产物。
9.根据权利要求1的方法，所述步骤（a）包括在受试者样品中测量九种或多种生物标记组。
10.根据权利要求9的方法，所述九种或多种生物标记包括表4所列至少三个基因的表达产物、表5所列至少三个基因的表达产物以及表6所列至少三个基因的表达产物。
11.根据权利要求1的方法，所述步骤（a）包括在受试者样品中测量二十种或多种生物标记组。
12.根据权利要求1的方法，还包含基于所述比较步骤（b）的结果确定所述受试者是否患有中风的步骤（c）。
13.根据权利要求1的方法，所述样品为体液样品或组织样品。
14.根据权利要求13的方法，所述体液样品为血液样品。
15.根据权利要求13的方法，所述体液样品为血浆或血清样品。
16.根据权利要求13的方法，所述体液样品为脑脊髓液样品。
17.根据权利要求1的方法，所述样品为外周血单核细胞（PBMCs）。
18.确定患者中风后疾病进展的方法，包括：
（a）在第一时间点从受试者获得的第一样品中测量一种或多种生物标记的水平；
（c）将第一时间点的一种或多种生物标记的水平与第二时间点的一种或多种生物标记的水平进行比较；以及
（d）基于步骤（c）的结果确定第一时间点和第二时间点之间的疾病进展，
所述一种或多种生物标记包括从白细胞介素-la（IL-la）、白细胞介素-Ιβ（IL-Ιβ）、白细胞介素lra（IL-lra）、白细胞介素3（IL-3）、白细胞介素2（IL-2）、白细胞介素4（IL-4）、白细胞介素5（IL-5）、白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素7（IL-7）、白细胞介素8（IL-8）、白细胞介素9（IL-9）、白细胞介素10（IL-10）、白细胞介素12(p40)（IL-12(p40)）、白细胞介素12(p70)（IL-12(p70)）、白细胞介素13（IL-13）、白细胞介素15（IL-15）、白细胞介素17（IL-17）、表皮生长因子（EGF）、嗜酸细胞活化趋化因子（Eotaxin）、成纤维细胞生长因子2（FGF-2）、铁蛋白轻链3配体（FTL-3ligand）、趋化因子Fractalkine、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、生长调节致癌基因（GRO）、干扰素a2（IFN-a2）、干扰素γ（IFN-γ）、干扰素诱导蛋白10（IP-10）、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）、单核细胞趋化蛋白3（MCP-3）、MCD、巨噬细胞炎症蛋白la（MIP-la）、巨噬细胞炎症蛋白Ιβ（ΜΙΡ-Ιβ）、血小板衍生生长因子aa（PDGF-aa）、血小板衍生生长因子aa bb（PGDF-aa bb）、调节活化正常T细胞表达和分泌的趋化因子(RANTES)、可溶性CD40配体（sCD40L）、可溶性白细胞介素2-ra（sIL2-ra）、肿瘤坏死因子a（TNF-a）、肿瘤坏死因子β（TNF-β）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）所组成的组合中选择的基因和表4、5、6、8中列出的基因的表达产物。
19.用于确定受试者中风治疗效果的方法，包括：
（a）在第一时间点从受试者获得的第一样品中测量一种或多种生物标记的水平；
（b）在第二时间点从受试者获得的第二样品中测量一种或多种生物标记的水平，所述受试者在第二时间点处于治疗中；
（c）将第一时间点的一种或多种生物标记的水平和第二时间点的一种或多种生物标记的水平进行比较；以及
（d）基于步骤（c）的结果确定治疗效果，所述一种或多种生物标记包括从白细胞介素-la（IL-la）、白细胞介素-Ιβ（IL-Ιβ）、白细胞介素lra（IL-lra）、白细胞介素3（IL-3）、白细胞介素2（IL-2）、白细胞介素4（IL-4）、白细胞介素5（IL-5）、白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素7（IL-7）、白细胞介素8（IL-8）、白细胞介素9（IL-9）、白细胞介素10（IL-10）、白细胞介素12(p40)（IL-12(p40)）、白细胞介素12(p70)（IL-12(p70)）、白细胞介素13（IL-13）、白细胞介素15（IL-15）、白细胞介素17（IL-17）、表皮生长因子（EGF）、嗜酸细胞活化趋化因子（Eotaxin）、成纤维细胞生长因子2（FGF-2）、铁蛋白轻链3配体（FTL-3ligand）、趋化因子Fractalkine、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、生长调节致癌基因（GRO）、干扰素a2（IFN-a2）、干扰素γ（IFN-γ）、干扰素诱导蛋白10（IP-10）、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）、单核细胞趋化蛋白3（MCP-3）、MCD、巨噬细胞炎症蛋白la（MIP-la）、巨噬细胞炎症蛋白Ιβ（ΜIΡ-Ιβ）、血小板衍生生长因子aa（PDGF-aa）、血小板衍生生长因子aa bb（PGDF-aa bb）、调节活化正常T细胞表达和分泌的趋化因子(RANTES)、可溶性CD40配体（sCD40L）、可溶性白细胞介素2-ra（sIL2-ra）、肿瘤坏死因子a（TNF-a）、肿瘤坏死因子β（TNF-β）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）、N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDA receptor）、神经元特异性烯醇化酶、神经胶质酸性蛋白（GFAP）、载脂蛋白C-III（Apo C-III）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）、D二聚体（D-dimer）、C反应蛋白（CRP）、脑钠素、S100B所组成的组合中选择的基因和表4、5、6、8中列出的基因的表达产物。
20.用于检测生物样品中中风生物标记的试剂盒包括：
（a）用于检测中风生物标记组的试剂；和
（b）列出每一种生物标记的参考值范围的操作指南，
所述生物标记组包括两种或多种生物标记，所述两种或多种生物标记包括从白细胞介素-la（IL-la）、白细胞介素-Ιβ（IL-Ιβ）、白细胞介素lra（IL-lra）、白细胞介素3（IL-3）、白细胞介素2（IL-2）、白细胞介素4（IL-4）、白细胞介素5（IL-5）、白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素7（IL-7）、白细胞介素8（IL-8）、白细胞介素9（IL-9）、白细胞介素10（IL-10）、白细胞介素12(p40)（IL-12(p40)）、白细胞介素12(p70)（IL-12(p70)）、白细胞介素13（IL-13）、白细胞介素15（IL-15）、白细胞介素17（IL-17）、表皮生长因子（EGF）、嗜酸细胞活化趋化因子（Eotaxin）、成纤维细胞生长因子2（FGF-2）、铁蛋白轻链3配体（FTL-3ligand）、趋化因子Fractalkine、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、生长调节致癌基因（GRO）、干扰素a2（IFN-a2）、干扰素γ（IFN-γ）、干扰素诱导蛋白10（IP-10）、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）、单核细胞趋化蛋白3（MCP-3）、MCD、巨噬细胞炎症蛋白la（MIP-la）、巨噬细胞炎症蛋白Ιβ（ΜΙΡ-Ιβ）、血小板衍生生长因子aa（PDGF-aa）、血小板衍生生长因子aa bb（PGDF-aa bb）、调节活化正常T细胞表达和分泌的趋化因子(RANTES)、可溶性CD40配体（sCD40L）、可溶性白细胞介素2-ra（sIL2-ra）、肿瘤坏死因子a（TNF-a）、肿瘤坏死因子β（TNF-β）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）、N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDA receptor）、神经元特异性烯醇化酶、神经胶质酸性蛋白（GFAP）、载脂蛋白C-III（Apo C-III）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）、D二聚体（D-dimer）、C反应蛋白（CRP）、脑钠素、S100B组成的组合中选择的基因以及表4、5、6、8列出的基因的表达产物。
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