CN103293314A - 一种分离鉴定核苷酰修饰的蛋白质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种分离鉴定核苷酰修饰的蛋白质的方法。具体而言，本发明涉及一种检测、分离和/或鉴定可被核苷酰修饰的蛋白质的方法，所述方法包括(a)提供包含蛋白质的样品；(b)使得所述样品与包含X-0/d/ddNTP、核苷酰转移酶、KG、ATP和Mg离子的反应体系接触，其中，X-0/d/ddNTP为连接有非同位素检测标记物的非脱氧、脱氧或双脱氧核苷三磷酸，KG为α-酮戊二酸；(c)检测、分离和/或鉴定带有非同位素检测标记物的核苷酰修饰的蛋白质。本发明的方法可用于安全、方便、有效地分离、鉴定核苷酰修饰的蛋白质，从而提供研究蛋白质翻译后修饰过程、核苷酰修饰的蛋白质及其功能的新途径。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术和蛋白质分离鉴定领域。具体而言，本发明涉及一种分离鉴定核苷酰修饰的蛋白质的方法。
背景技术
早在40年前，研究者已发现通过腺苷酰化或尿苷酰化进行的蛋白质翻译后修饰是酶活性调节的机制之一。
例如，在细菌中，氮素的代谢受到PII(GlnB/GlnK)蛋白的调节。PII蛋白在低氮条件下，被尿苷酰化，激活氮调节系统(NtrB/NtrC)，刺激固氮基因的表达，促进谷氨酰胺合成酶(GS)去腺苷酰化。具体而言，PII是一种调节蛋白，它的活性是被PII的一个Tyr残基的尿苷酰化共价修饰所调节的。腺苷酰转移酶复合物(AT)与尿苷酰化的PII结合可引起谷氨酰胺合成酶去腺苷化，激活谷氨酰胺合成酶活性，而AT与脱尿苷酰化的PII结合则可以引起谷氨酰胺合成酶的腺苷酰化，抑制谷氨酰胺合成酶活性。PII的尿苷酰化和脱尿苷酰化都是由尿苷酰转移酶(uridylyltransferase)催化的。
因此，分离和鉴定核苷酰修饰化的蛋白质，并在此基础上对其修饰过程和功能进行研究，对于研究酶活性和生物过程调节具有非常重要的意义。
直到现在，研究人员在检测腺苷酰和尿苷酰修饰的蛋白质中，仍需应用同位素标记法。然而，同位素标记法存在多种缺点：首先，其不能进行人体药物动力学研究，在动物实验中对实验人员也易产生辐射伤害；其次，随着方法的复杂化，其灵敏度、重现性和回收率受到影响，动物实验前需预先进行药物的同位素标记，试验操作相对复杂；再次，同位素标记后可能会引起药物的生物活性及其在生物体内的动力学行为发生变化。
随着化学生物学的发展，大量的非同位素连接的(非脱氧、脱氧或双脱氧)核苷三磷酸(即(0/d/dd)NTP)被合成，但是它们仅仅被应用于核酸的标记，例如其可用于DNA测序、DNA印迹法(Southern Blot)、RNA印迹法(Northern Blot)以及原位杂交等。然而，本领域中并未将(非脱氧/脱氧/双脱氧)核苷三磷酸用于蛋白质标记、分离和鉴定中。
综上所述，本领域中迫切需要开发出分离、鉴定核苷酰修饰的蛋白质的安全、方便、有效的新方法，从而提供研究蛋白质翻译后修饰过程、核苷酰修饰的蛋白质及其功能的新途径。
发明内容
本发明的主要目的就是为了提供一种检测、分离和/或鉴定可被核苷酰修饰的蛋白质的安全、方便、有效的新方法。本发明的另一个目的是为了提供一种与本发明方法相适应的检测、分离和/或鉴定可被核苷酰修饰的蛋白质的试剂盒。本发明的再一个目的是为了提供X-0/d/ddNTP在检测、分离和/或鉴定可被核苷酰修饰的蛋白质或制备相关试剂盒中的用途。
在本发明的第一方面中，提供了一种检测、分离和/或鉴定可被核苷酰修饰的蛋白质的方法，所述方法包括：
(a)提供包含蛋白质的样品；
(b)使得所述样品与包含X-0/d/ddNTP、核苷酰转移酶、核酸酶、KG、ATP和Mg离子的反应体系接触，其中，X为非同位素检测标记物，0/d/ddNTP为非脱氧、脱氧或双脱氧的UTP、ATP、GTP、CTP或TTP，X-0/d/ddNTP为连接有非同位素检测标记物的非脱氧、脱氧或双脱氧的UTP、ATP、GTP、CTP或TTP，KG为α-酮戊二酸；
(c)检测、分离和/或鉴定带有非同位素检测标记物的核苷酰修饰的蛋白质。
在本发明的一个实施方式中，若样品中存在可被核苷酰修饰的蛋白质，则步骤(b)中发生如下反应：
其中，X、0/d/ddNTP、X-0/d/ddNTP、KG如权利要求1中所定义，0/d/ddNMP为与反应前的0/d/ddNTP相对应的非脱氧、脱氧或双脱氧的UMP、AMP、GMP、CMP或TMP，蛋白质-X-0/0/d/ddNMP为带有非同位素检测标记物的0/d/ddNMP修饰的蛋白质。
在本发明的另一个实施方式中，所述包含蛋白质的样品选自：新鲜的、冷冻干燥的或固定的细胞、组织、器官、或其分离物或裂解物；合成或半合成的蛋白质样品。
在一个优选例中，所述包含蛋白质的样品是生物样品，优选血样、尿样、细胞或细胞裂解物。
在另一个优选例中，所述样品来自动物、植物或微生物，优选人、大鼠、小鼠、豚鼠、马、牛、猪、羊、拟南芥、百脉根、水稻、棉花、果蝇、大肠杆菌、苜蓿根瘤菌、大豆、苜蓿、布氏杆菌、结核杆菌、小麦或玉米。
本发明的方法可广泛应用于各种领域和各种的含蛋白质样品的检测和分析，包括(但不限于)含蛋白质的：生物样品、食品或饮料样品、药物样品、环境样品、化学样品的检测和分析。生物样品可为临床样品或实验室样品，例如血液、血浆、血清、尿液、粪便、痰液、分泌物(如汗液、泪液等)、培养物等。
在本发明的另一个实施方式中，X为选自下组的非同位素检测标记物：荧光标记物、化学发光标记物或生物发光标记物，优选X为DIG、生物素、亲和素、链霉亲和素、中性亲和素、抗生物素、凝集素或葡萄球菌A蛋白。
在一个优选例中，X为DIG、生物素、亲和素、链霉亲和素、中性亲和素或抗生物素。
在本发明的另一个实施方式中，X-0/d/ddNTP在反应体系内的浓度为1.0～5μM，优选0.5～2.5μM，更优选1μM。
在一个优选例中，在反应体系中，所述KG的浓度为5～20mM，优选8～12mM，更优选；ATP的浓度为50～200μM，优选80～150μM，更优选100μM；Mg离子的浓度为10～50mM，优选20～40mM，更优选25mM；核苷酰转移酶的浓度为0.5～5单位/μl，优选1～3单位/μl，更优选2单位/μl；核酸酶的浓度为0.5～5单位/μl，优选1～3单位/μl，更优选2单位/μl。
在一个优选例中，所述反应体系还包含：缓冲液、溶剂(优选水)、KCl和/或牛血清白蛋白(BSA)。
在另一个优选例中，所述核苷酰转移酶优选为特异性针对所加入的0/d/ddNTP的转移酶。
在另一个优选例中，所述核酸酶可购自Biolab、Tkara或Transgen。
在本发明的另一个实施方式中，所述反应体系先在适于核苷酰转移酶作用的温度下反应15～120分钟，再在适于核酸酶作用的温度下反应15～120分钟。
在另一个优选例中，所述反应体系先在25～32℃，优选28℃下反应15～120分钟，再在35～38℃，优选37℃下反应15～120分钟。
在本发明的另一个实施方式中，所述检测、分离和/或鉴定是通过选自下组的一种或多种方法进行的：免疫印迹法、亲和层析、SDS-PAGE、ELISA或免疫沉淀。
在本发明的另一个实施方式中，所述方法还包括在步骤(b)前对所述样品进行前处理。
在一个优选例中，所述前处理为选自下组中的一种或多种：洗涤、粉碎、裂解、离心、悬浮或速冻。
在本发明的第二方面中，提供了一种检测、分离和/或鉴定可被核苷酰修饰的蛋白质的试剂盒，所述试剂盒包括：
(i)容纳X-0/d/ddNTP的容器，所述容器可任选容纳KG、ATP、核苷酰转移酶、核酸酶和/或Mg离子中的一种或多种，其中X、0/d/ddNTP、X-0/d/ddNTP、KG如权利要求1中所定义；
(ii)任选的，容纳KG、ATP、核苷酰转移酶、核酸酶和/或Mg离子中的一种或多种容器；
(iii)任选的，洗液、缓冲液和/或助剂；
(iv)任选的，检测、分离和/或鉴定带有非同位素检测标记物的核苷酰修饰的蛋白质所需的试剂；以及
(iv)任选的，产品说明书。
在本发明的一些实施方式中，试剂盒中所包含的试剂、其浓度、使用条件、所针对的样品等与本发明的第一方面中所描述的相同。
在本发明的第三方面中，提供了X-0/d/ddNTP、核苷酰转移酶和/或核酸酶在检测、分离和/或鉴定可被核苷酰修饰的蛋白质中的用途，其中，X为非同位素检测标记物，0/d/ddNTP为非脱氧、脱氧或双脱氧的UTP、ATP、GTP、CTP或TTP，X-0/d/ddNTP为连接有非同位素检测标记物的非脱氧、脱氧或双脱氧核苷三磷酸。
在本发明的一些实施方式中，所述用途中所包含的试剂、其浓度、使用条件、所针对的样品等与本发明的第一方面中所描述的相同。
在本发明的另一个方面中，提供了X-0/d/ddNTP、核苷酰转移酶和/或核酸酶在制备检测、分离和/或鉴定可被核苷酰修饰的蛋白质的试剂盒中的用途，其中，X为非同位素检测标记物，0/d/ddNTP为非脱氧、脱氧或双脱氧的UTP、ATP、GTP、CTP或TTP，X-0/d/ddNTP为连接有非同位素检测标记物的非脱氧、脱氧或双脱氧核苷三磷酸。
在本发明的一些实施方式中，所述用途中所包含的试剂、其浓度、使用条件、所针对的样品等与本发明的第一方面中所描述的相同。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步说明。
图1：苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobiumn meliloti)PII蛋白的DIG-dUMP修饰，所示结果为蛋白质印迹(Western Blot)图谱；
图2：大肠杆菌中的DIG-d/ddUMP(即DIG-dUMP或DIG-ddUMP)修饰蛋白质，所示结果为蛋白质印迹图谱；
图3：拟南芥(Arabidopsis thaliana)和百脉根(Lotus japomcas)幼苗(生长2周)细胞提取物中被DIG-dUMP修饰的蛋白质，所示结果为蛋白质印迹图谱；
图4：果蝇(Drosophila melanogaster)幼虫细胞提取物中被DIG-dUMP修饰的蛋白质，所示结果为蛋白质印迹图谱(最左侧为分子量标记)。
图5：人癌细胞系293T细胞提取物中被DIG-dUMP修饰的蛋白质，所示结果为蛋白质印迹图谱。
图6：苜蓿中华根瘤菌细胞提取物中被生物素-dUMP修饰的蛋白质，所示结果为蛋白质印迹图谱。
具体实施方式
本发明人经过长期而深入的研究开发出一种可用于鉴定和分离核苷酰(如UMP、dUMP、ddUMP、AMP、dAMP、ddAMP、GMP、dGMP、ddGMP、CMP、dCMP、ddCMP、TMP、dTMP、ddTMP)修饰的蛋白质的新方法。发明人进一步发现采用本发明的方法，不仅可检测到核苷酰修饰蛋白，还可在此基础上采用本领域中的各种方法对所述修饰蛋白进行分离、纯化、鉴别和进行进一步研究。
具体而言，本发明的方法主要基于如下的反应：
其中，
X为非同位素检测标记物，例如荧光标记物、化学发光标记物、生物发光标记物等，优选DIG、生物素、抗生物素等；
0/d/ddNTP为非脱氧、脱氧或双脱氧的UTP、ATP、GTP、CTP或TTP；
X-0/d/ddNTP为连接有非同位素检测标记物的0/d/ddNTP；
KG为α-酮戊二酸；
0/d/ddNMP为与反应前的0/d/ddNTP相对应的非脱氧、脱氧或双脱氧的UMP、AMP、GMP、CMP或TMP；
蛋白质-X-0/0/d/ddNMP为带有非同位素检测标记物的0/d/ddNMP修饰的蛋白质。
通过上述反应可在本发明中创建的体外无细胞体系中，应用非同位素标记(如地高辛或生物素标记)的非脱氧、脱氧或双脱氧三磷酸核苷(如dUTP或ddUTP)，从各种生物材料(如动物、植物、微生物)或非生物材料(如人工合成的蛋白质)的样品中(例如细胞裂解物)，检测到可被核苷酰修饰的蛋白质。本发明的反应还可用于说明蛋白质的核苷酰修饰是普遍存在的，该修饰并不局限于细菌蛋白，在植物和动物细胞中也存在相关的修饰反应以及相应的转移酶。
本发明的主要优点在于：
(a)提供了一种检测、分离和/或鉴定可被核苷酰修饰的蛋白质的新方法，该方法无需使用同位素，具有安全、方便、有效的特点；
(b)为本领域中进一步研究可被核苷酰修饰的蛋白质及其功能(例如与酶的活性调节和生理过程调控等)提供了有力的途径。
实施例
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员可对本发明做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，可采用本领域中的常规方法，例如参考《分子克隆实验指南》(第三版，纽约，冷泉港实验室出版社，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)或按照供应商所建议的条件。DNA的测序方法为本领域常规的方法，也可由商业公司提供测试。
除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
材料和方法
A.反应缓冲液：
100mM Tris-HCl(pH7.5)，100mM KCl，25mM MgCl2，1mM DDT，0.1mg/mlBSA，0.1mM ATP，10mMα-酮戊二酸，核酸酶2u/μl(用于降解修饰的核酸)；
B.反应条件：先在28℃温育30分钟，然后在37℃再次温育30分钟；
C.具体步骤：
1)用反应缓冲液洗涤新鲜的细菌、植物或者动物细胞，13000rpm/min离心1min，倒掉上清，液氮冷冻研磨；
2)加入50μl反应缓冲液重悬，13000rpm/min离心10min，收集上清；
3)分别吸取20μl上清，加入1.5ml微量离心管中，按不同试验的要求分别加入1μM的DIG-dUTP、DIG-ddUTP、生物素-dUTP或生物素-ddUTP，再分别加入2个单位/μl的蛋白酶K或者1μM PMSF(在反应前加入，作为对照处理)；
4)将反应混合物先在28℃孵育30分钟，再在37℃温育30分钟；
5)表征、检测和分离UMP修饰的蛋白质，例如SDS-PAGE、免疫检测(如蛋白质印迹)或者亲和层析。
实施例1.DIG-dUTP对细菌PII蛋白的体外标记
PII蛋白是本领域中第一个被鉴定的UMP修饰蛋白。
本实验中使用的抗-PII的多克隆抗体由Dr.Roberts赠送，抗原蛋白为深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)的PII蛋白(这些材料均可由本领域普通技术人员根据本领域公知的常规多克隆抗体制备方法或蛋白质分离方法制备而得或通过市售购得)。
本试验中使用了苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizbium meliloti)的细胞裂解物。DIG-dUTP，即DIG-11-dUTP，购于Roche(罗氏)。PMSF为蛋白酶抑制剂，用于防止蛋白质降解(购于Sigma)。蛋白酶K被用作负对照，说明被修饰的是蛋白质，而不是核酸(购于TAKARA)。
根据如上所述的具体步骤，用DIG-dUTP体外标记PII蛋白，并用免疫印迹方法检测体外标记的PII蛋白的存在(结果如图1所示)。
结果显示：采用抗-PII的多克隆抗体可以检测出多个蛋白质条带(左图)，其中未被修饰的PII蛋白在15KD左右，经UMP修饰后的PII蛋白在16KD左右出现条带。该结果与报道的大小对应。
而在采用抗DIG测试的结果(右图)中发现其中一个条带与左图中经UMP修饰后的PII蛋白的蛋白质条带一致，即被DIG-dUMP修饰的PII，这与前人发表的同位素标记结果吻合。
此外，本实验结果还发现了可被UMP修饰的其它多种蛋白质，为进一步研究提供了有力的工具。
该研究结果证明：采用本发明方法可在体外用DIG-dUTP修饰和标记苜蓿中华根瘤菌的PII蛋白，即证实了DIG-UTP可以体外标记UMP修饰的蛋白质，从而使得该蛋白可采用本领域中常规检测DIG的方法被检测到。
实施例2.细菌中被UMP修饰的其它蛋白质
本试验中所用生物材料为大肠杆菌(E.Coli)BL21。抗-DIG抗体购自罗氏。
将大肠杆菌BL21接种至5ml LB液体培养基，37℃过夜培养，收集细菌细胞。其它操作步骤见材料和方法部分。
试验结果如图2所示。结果显示：加入DIG-dUTP和DIG-ddUTP的大肠杆菌细胞裂解液反应后，采用抗-DIG抗体进行免疫印迹检测，出现多达7个蛋白条带，其中最大和最小条带与已知的GlnD和GlnB大小吻合。另外，相同浓度的DIG-ddUTP具有更好的标记效果。GlnD，为已知的尿苷酰转移酶，GlnB即PII，其它条带为新的被修饰蛋白。
该结果表明：细菌中除了尿苷酰转移酶和PII蛋白可被dUMP体外修饰以外，还存在其它可被修饰的蛋白质，可采用DIG-dUTP或DIG-ddUTP检测这些被UMP体外修饰的蛋白。
实施例3.在植物中被UMP修饰的蛋白质
本试验所用生物材料为：拟南芥(Arabidopsis thaliana)和百脉根(Lotusjaponicas)幼苗(生长2周)。
收取在MS培养基上生长2周的拟南芥和百脉根的整个植株100mg，液氮冷冻/研磨，3次，加入反应缓冲液。其它步骤见材料和方法部分。
试验结果如图3所示。结果显示：加入DIG-dUTP的两种植物组织细胞裂解液中反应后，采用抗-DIG抗体进行免疫印迹检测，出现多达7个蛋白条带，其中两个条带非常之强。
该结果表明：植物中存在可被dUMP体外修饰的蛋白质，采用本发明的方法可有效检测所述修饰蛋白，并且在本实施例的基础上，可对所述修饰蛋白进行分离、纯化、鉴别和进一步研究。
实施例4.在果蝇中被dUMP修饰的蛋白质
本试验所用生物材料为：果蝇(Drosophila melanogaster)幼虫细胞。
收集果蝇7天幼虫，液氮冷冻/研磨，3次，加入反应缓冲液洗涤，离心，保存上清。其它操作步骤见材料和方法部分。
试验结果如图4所示。结果显示：加入DIG-dUTP的果蝇细胞裂解液反应后，采用抗-DIG抗体进行免疫印迹检测，出现多达5个蛋白条带。
该结果表明：果蝇中存在可被dUMP体外修饰的蛋白质，采用本发明的方法可有效检测所述修饰蛋白，并且在本实施例的基础上，可对所述修饰蛋白进行分离、纯化、鉴别和进一步研究。
实施例5.在癌细胞中被dUMP修饰的蛋白质
本试验所用生物材料为：人的癌细胞系293T细胞。
收集人的癌细胞系293T细胞50mg，液氮冷冻/研磨，3次，加入反应缓冲液洗涤，离心，保存上清。其它操作步骤见材料和方法部分。
试验结果如图5所示。结果显示：加入DIG-dUTP的人癌细胞系293T细胞裂解液反应后，采用抗-DIG抗体进行免疫印迹检测，出现2个蛋白条带。
该结果表明：人的癌细胞系293T裂解物中存在被UMP修饰的蛋白质，采用本发明的方法可有效检测所述修饰蛋白，并且在本实施例的基础上，可对所述修饰蛋白进行分离、纯化、鉴别和进一步研究。
实施例6.采用生物素-11-dUTP标记物标记UMP修饰蛋白
本试验所用生物材料为：苜蓿中华根瘤菌细胞裂解物。生物素-11-dUTP购自Fermentas。
将苜蓿中华根瘤菌接种至5ml LB/MC液体培养基，30℃过夜培养，收集细菌细胞。其它操作步骤见材料和方法部分。
试验结果如图6所示。结果显示：加入生物素-dUTP的苜蓿中华根瘤菌细胞裂解液，采用EMSA化学发光法(LightShift Chemiluminescent EMSA试剂盒，购自Thermo Scientific)检测，出现5个蛋白条带。
该结果表明：采用生物素-11-dUTP作为标记物，也可检测到细菌细胞裂解物中UMP修饰的蛋白质。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
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Claims (10)
1.一种检测、分离和/或鉴定可被核苷酰修饰的蛋白质的方法，所述方法包括：
(a)提供包含蛋白质的样品；
(b)使得所述样品与包含X-0/d/ddNTP、核苷酰转移酶、核酸酶、KG、ATP和Mg离子的反应体系接触，其中，X为非同位素检测标记物，0/d/ddNTP为非脱氧、脱氧或双脱氧的UTP、ATP、GTP、CTP或TTP，X-0/d/ddNTP为连接有非同位素检测标记物的非脱氧、脱氧或双脱氧的UTP、ATP、GTP、CTP或TTP，KG为α-酮戊二酸；
(c)检测、分离和/或鉴定带有非同位素检测标记物的核苷酰修饰的蛋白质。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，若样品中存在可被核苷酰修饰的蛋白质，则步骤(b)中发生如下反应：
其中，X、0/d/ddNTP、X-0/d/ddNTP、KG如权利要求1中所定义，0/d/ddNMP为与反应前的0/d/ddNTP相对应的非脱氧、脱氧或双脱氧的UMP、AMP、GMP、CMP或TMP，蛋白质-X-0/0/d/ddNMP为带有非同位素检测标记物的0/d/ddNMP修饰的蛋白质。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述包含蛋白质的样品选自：新鲜的、冷冻干燥的或固定的细胞、组织、器官、或其分离物或裂解物；合成或半合成的蛋白质样品。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，X为选自下组的非同位素检测标记物：荧光标记物、化学发光标记物或生物发光标记物，优选X为DIG、生物素、亲和素、链霉亲和素、中性亲和素、抗生物素、凝集素或葡萄球菌A蛋白。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，X-0/d/ddNTP在反应体系内的浓度为1.0～5μM，优选0.5～2.5μM，更优选1μM。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应体系先在适于核苷酰转移酶作用的温度下反应15～120分钟，再在适于核酸酶作用的温度下反应15～120分钟。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测、分离和/或鉴定是通过选自下组的一种或多种方法进行的：免疫印迹法、亲和层析、SDS-PAGE、ELISA或免疫沉淀。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在步骤(b)前对所述样品进行前处理。
9.一种检测、分离和/或鉴定可被核苷酰修饰的蛋白质的试剂盒，所述试剂盒包括：
(i)容纳X-0/d/ddNTP的容器，所述容器可任选容纳KG、ATP、核苷酰转移酶、核酸酶和/或Mg离子中的一种或多种，其中X、0/d/ddNTP、X-0/d/ddNTP、KG如权利要求1中所定义；
(ii)任选的，容纳KG、ATP、核苷酰转移酶、核酸酶和/或Mg离子中的一种或多种容器；
(iii)任选的，洗液、缓冲液和/或助剂；
(iv)任选的，检测、分离和/或鉴定带有非同位素检测标记物的核苷酰修饰的蛋白质所需的试剂；以及
(iv)任选的，产品说明书。
10.X-0/d/ddNTP在检测、分离和/或鉴定可被核苷酰修饰的蛋白质中的用途，其中，X为非同位素检测标记物，0/d/ddNTP为非脱氧、脱氧或双脱氧的UTP、ATP、GTP、CTP或TTP，X-0/d/ddNTP为连接有非同位素检测标记物的非脱氧、脱氧或双脱氧核苷三磷酸。
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| CN111781178A (zh) * | 2020-06-29 | 2020-10-16 | 山东省医学科学院基础医学研究所 | 一种基于荧光标记的单磷酸尿苷酸化检测方法 |
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