CN103289468A - 一种dna明胶纳米微凝胶防伪涂料制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种DNA明胶纳米微凝胶防伪涂料制备方法，先将DNA与明胶溶液混合，使用沉淀剂沉淀，再交联固化得到微凝胶使DNA包裹在含水的明胶纳米微凝胶网格中，然后将此明胶纳米微凝胶按照一定比例混入涂料中，制备得到一种保存周期长、结构稳定、易于检测、天然无毒的防伪涂料；由于DNA的未知性和扩增性，根据特定的DNA组成设计出引物，通过聚合酶链式反应（以下简称PCR）扩增放大数百万倍，通过电泳分析便可将所含DNA检测出来，达到防伪的目的。
Description
技术领域
本发明涉及一种防伪涂料制备方法，具体涉及一种DNA明胶纳米微凝胶防伪涂料制备方法。
背景技术
制假是当今世界上增长最快的经济犯罪活动之一，给正当的商务活动及各种社会活动带来了极大的危害。传统的防伪技术包括：电码防伪、条码标签、变彩防伪、荧光防伪、激光防伪等等，但随着造假技术的不断提高，以上的防伪技术防伪功效日渐降低。因此，一种新型的防伪技术——DNA防伪技术，受到了人们的重视。DNA防伪产品具有4个突出特点：
1、DNA序列作为密码标志，只要将此密码标志应用于被保护对象上，则可赋予非生物品一个生物的基因标志，选择极富变化性，大幅增加了密码标志的安全性，具有高度保密性与独特性，几乎无法模仿；
2、现阶段的生物技术还无法人工准确合成长度较长的DNA分子，而且混入介质的DNA浓度极低，无法得知放入DNA的序列及分子量大小，故而保密性及独特性都极高；
3、保存期长，有报道称经保护处理的DNA可在正常光照中保存100年以上；
4、使用范围广，DNA防伪可以用于各种场合，包括食品、药品、烟酒、各类金融相关磁卡或IC卡、古董艺术品等等。
早在2001年英国Bath大学的Cox教授课题组进行了DNA防伪尝试。他们将DNA密码作为一种重要信件的标签。具体方法是：在一封已经用普通信纸写就的信上，选取合适的部位，将极少量的编码DNA溶液标记在上面。由于通常的A4纸浸润性较差，水溶液不容易浸透，需要使用酒精助溶。他将编码DNA的水溶液混入酒精后点在信纸上，待其干后即成为一份加密的信件。
近年来DNA防伪技术发展迅速。DNA Technologies公司最早推出了DNA防伪产品，而国内的陆博生物科技公司、南开大学戈德集团公司及台湾博微公司等均已推出了类似的产品用于防伪。目前已经有一些DNA防伪产品上市，包括DNA防伪标签、DNA防伪涂料、DNA防伪油墨等等。赵利水使用DNA防伪技术制备出了一种微型DNA防伪标签（专利号：CN201020121855.7），该专利所述微型DNA防伪标签由粘结层、保护膜层、以及位于所述粘结层与所述保护膜层之间的隐形变色层组成，该防伪标签适合于粘贴在贵重金属制品等微小型的物品表面。田辰远等人设计了一种DNA油墨防伪包装盒（专利号：CN201120292067.9），该方法由DNA油墨印刷层、荧光层、保护层三部分组成。叶欣制备了一种利用个人遗传信息进行防伪的印泥（专利号CN201010206661.1），该专利将个人DNA的PCR产物与普通印泥以及DNA酶抑制剂混合制备而成。目前流行的技术中DNA均直接混入介质中，未考虑DNA保存所需生物环境。要提高防伪性能，需要对DNA进行仿生学保护处理。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种DNA明胶纳米微凝胶防伪涂料制备方法，将DNA包裹在含水的明胶纳米微凝胶网格中，模仿细胞结构，阻止了涂料与DNA的直接接触，使得DNA分子能够长久保存，利用明胶纳米微凝胶有效保护、成本低廉、技术简单的优点，通过共沉淀法，在不同的条件下制备出了性能优异的DNA明胶纳米微凝胶防伪涂料；本方法使用的材料为天然产物，健康、环保、成本低廉，适用于包括食品、药品在内的各类商品的防伪。
为了达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种DNA明胶纳米微凝胶防伪涂料制备方法，包括以下步骤：
步骤一、从泡桐树叶、小牛胸腺或大肠杆菌DH5αDNA中，通过聚合酶链式反应（PCR），扩增一段长度为400-900bp的DNA片段；
步骤一具体为：从已知泡桐树叶树、小牛胸腺或大肠杆菌DH5α基因序列，使用Primer Pemier5.0软件设计对应引物，Oligo6.0软件评价引物质量并计算其退火温度值，按照下述体系以及热循条件，进行聚合酶链式反应（以下简称PCR）。扩增条件：50μL体系，其中包括10×PCR缓冲液5μL、1.0g/L模板DNA1μL、5.0U/μL TaqDNA聚合酶0.25μL、2.5mmol/L dNTP4μL、20μmol/L引物上下游各1μL；扩增程序：95℃变性10分钟；95℃变性60秒，55.2℃退火60秒，72℃延伸60秒，共25个循环；72℃再延伸5分钟反应终止；
步骤二、将5-10%（w/v）的明胶溶液，45℃条件下加入体积比1：1-1：5的丙酮中，弃掉上清，冷冻干燥，得到纯化明胶，并配成5%（w/v）纯化明胶溶液；
步骤三、取1-2mL步骤二中所得纯化明胶溶液于50mL烧杯中，在50℃，200-600转/分钟的搅拌速度下，加入50-500μL步骤一所得DNA溶液，按照0.5mL/s的速率滴加2-5mL浓度为2mol/L醋酸钠溶液，并补加蒸馏水使溶液的总体积为10mL，继续搅拌10分钟；加入0.5mL表面活性剂，并将体系温度降到15-30℃，继续搅拌30分钟；
所述步骤三中的表面活性剂包括吐温-20、吐温-40、吐温-60、吐温-65、吐温-80、吐温-85、司盘-20、司盘-40、司盘-60、司盘-80中的一种；
步骤四、逐滴滴加蛋白沉淀剂，至溶液浑浊，并在1分钟内不再澄清，加入溶剂化试剂至溶液澄清，搅拌30分钟；
所述的蛋白沉淀剂为硫酸钠、硫酸铵或氯化钠中的一种，或者其中两种任意比例的混合物；
所述的溶剂化试剂为乙醇、异丙醇中的一种或这两种任意比例的混合物；
步骤五、加入50-100μL的交联剂交联0-90秒，随后加入2.0-5.0mL浓度12%(w/v)偏重亚硫酸钠溶液终止交联反应，持续搅拌10h后，4℃静置过夜；
所述交联剂为甲醛、戊二醛、甘油醛、表氯醇、氰酸酯、氧化葡聚糖中的一种或者其中两种混合物；
步骤六、透析72小时，真空冷冻干燥12小时得到白色粉末即DNA明胶纳米微凝胶；取0.005-0.05g该粉末溶解到10mL酯胶清漆中，混匀，即可制成DNA明胶纳米微凝胶的防伪涂料。
检测时取1.0mL防伪涂料均匀涂于直径为110mm滤纸片上，自然挥发干。将该纸片投入烧杯中并加入体积比为1：1的正己烷与水混合溶液中，萃取微凝胶。针对第一步所得扩增产物，设计一对能够扩增200bp长度的引物并计算其退火温度值。按照如下体系和热循条件，进行PCR扩增：
50μL体系，其中包括10×PCR缓冲液5μL、1.0g/L模板DNA1μL、5.0U/μL TaqDNA聚合酶0.25μL、2.5mmol/L dNTP4μL、20μmol/L引物上下游各1μL。
扩增程序：95℃变性5分钟；95℃变性30秒，55.2℃退火30秒，72℃延伸30秒，共25个循环；72℃再延伸5分钟反应终止，得到扩增产物。
配制1%琼脂糖，煮沸三次冷却至60℃左右，进入1.0μL溴化乙锭混合均匀，灌入胶板，冷却制得琼脂糖凝胶。将扩增产物以体积比为6：1的电泳上样缓冲液混合均匀后加入到胶孔中，80V电泳30分钟，电泳完毕，将胶块放置于凝胶成像仪中，成像拍照，观察其是否出现目标条带。
本发明所述的一种DNA明胶纳米微凝胶防伪涂料制备工艺：利用天然产物明胶，制备出含DNA的明胶纳米微凝胶，并混入涂料中，制得防伪涂料。具体是将DNA与明胶混合，使用沉淀剂沉淀出纳米微凝胶，使用交联剂交联得到球形结构，将该纳米微凝胶混入涂料中，即可制成DNA明胶纳米微凝胶防伪涂料，明胶纳米微凝胶能够有效的保护DNA使其免受环境中有害因子的损害，从而有效延长防伪周期；另外本方法使用材料均为天然产物，绿色、健康、环保，适用于包括食品在内的各种商品的防伪。
附图说明
图1为一种DNA明胶纳米微凝胶防伪涂料制备流程图。
图2为从小牛胸腺基因中扩增的720bp的基因序列电泳检测结果，其中M为对照用的标准品，1-6泳道是样品电泳检测结果。
图3为不同粒径DNA明胶纳米微凝胶电泳检测结果，其中其中M为对照用的标准品，第1-10泳道分别为粒径为155±12nm、170±9nm、206±23nm、243±28nm、318±33nm、340±6nm、384±19nm、452±25nm、523±18nm、813±25nm的DNA微凝胶PCR扩增后，电泳检测结果。
图4为DNA明胶纳米微凝胶防伪涂料，防伪辨识电泳检测结果，其中M为对照用的标准品，1-8泳道是样品电泳检测结果。
图5为粒径243±28nm的DNA明胶纳米微凝胶粒径分布图。
图6为实施例四的DNA明胶纳米微凝胶透射电镜照片。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明做详细叙述。
实施例一
参照图1，一种DNA明胶纳米微凝胶防伪涂料制备，包括以下步骤：
步骤一、从已知小牛胸腺基因序列，使用Primer Pemier5.0软件设计对应引物，Oligo6.0软件评价引物质量并计算其退火温度值；按照如下体系以及热循条件，进行聚合酶链式反应（以下简称PCR）扩增条件如下：50μL体系，其中包括10×PCR缓冲液5μL、1.0g/L模板DNA1μL、5.0U/μL TaqDNA聚合酶0.25μL、2.5mmol/L dNTP4μL、20μmol/L引物上下游各1μL；
扩增程序：95℃变性10分钟；95℃变性60秒，55.2℃退火60秒，72℃延伸60秒，共25个循环；72℃再延伸5分钟反应终止。扩增可获得一段长度为400bp的DNA片段；
步骤二、配置5%（w/v）明胶溶液，45℃条件下加入等体积的丙酮，弃掉上清，冷冻干燥，得到纯化明胶，并配成5%（w/v）纯化明胶溶液；
步骤三、取1mL纯化明胶溶液于50mL烧杯中，在50℃，200转/分钟的搅拌速度下，加入50μL步骤一所得DNA溶液，按0.5mL/s的速率滴加2mL的2mol/L醋酸钠溶液，并补加蒸馏水至溶液的总体积为10mL，使继续搅拌10分钟；加入0.5mL吐温-20，并将水浴锅温度降到15℃，继续搅拌30分钟；
步骤四、逐滴滴加20%（w/v）硫酸钠，至溶液浑浊，并在1分钟内不再澄清，逐滴加入乙醇至溶液澄清，搅拌30分钟；
步骤五、加入50μL25%甲醛交联90秒，随后加入2.0mL的12%(w/v)偏重亚硫酸钠溶液终止交联反应，持续搅拌10h后，4℃静置过夜；
步骤六、透析72小时后，真空冷冻干燥12小时得到白色针状粉末，取0.005g粉末溶解到10mL酯胶清漆中，混匀，得到DNA明胶纳米微凝胶的防伪涂料。
本实施例得到DNA明胶纳米微凝胶，平均粒径为155±12nm，参照图3第1泳道。取1mL防伪涂料均匀涂于直径为110mm滤纸片上，自然挥干。将该纸片投入烧杯中并加入体积比为1：1的正己烷与水混合溶液，萃取微凝胶。针对第一步所得扩增产物，设计一对能够扩增200bp长度的引物并计算其退火温度值按照说明书中条件进行PCR扩增检测。参照图4，检测结果显示，该方法所得防伪涂胶中的DNA能够有效地被PCR扩增检测，可以起防伪作用。
实施例二
一种DNA明胶纳米微凝胶防伪涂料制备，包括以下步骤：
步骤一、从已知泡桐树叶基因序列，使用Primer Pemier5.0软件设计对应引物，Oligo6.0软件评价引物质量并计算其退火温度值；按照如下体系以及热循条件，进行聚合酶链式反应（以下简称PCR）扩增条件如下：50μL体系，其中包括10×PCR缓冲液5μL、1.0g/L模板DNA1μL、5.0U/μL TaqDNA聚合酶0.25μL、2.5mmol/L dNTP4μL、20μmol/L引物上下游各1μL；
扩增程序：95℃变性10分钟；95℃变性60秒，55.2℃退火60秒，72℃延伸60秒，共25个循环；72℃再延伸5分钟反应终止；扩增可获得一段长度为720bp的DNA片段，参照图2；
步骤二、配置7%（w/v）明胶溶液，45℃条件下加入2倍体积的丙酮，弃掉上清，冷冻干燥，得到纯化明胶，并配成5%（w/v）纯化明胶溶液；
步骤三、取1.5mL纯化明胶溶液于50mL烧杯中，在50℃，300转/分钟的搅拌速度下，加入100μL DNA溶液，按0.5mL/s的速率滴加3.5mL的2mol/L醋酸钠溶液，补加蒸馏水使溶液的总体积为10mL，继续搅拌10分钟；加入0.5mL吐温-40，并将水浴锅温度降到25℃，继续搅拌30分钟；
步骤四、逐滴滴加20%(w/v)硫酸铵，至溶液浑浊，并在1分钟内不再澄清，逐滴加入异丙醇至溶液澄清，搅拌30分钟；
步骤五、加入75μL戊二醛交联60秒，随后加入3.0mL的12%(w/v)偏重亚硫酸钠溶液终止交联反应，持续搅拌10h后，4℃静置过夜；
步骤六、透析72小时后，真空冷冻干燥12小时得到白色针状粉末。取0.01g粉末溶解到10mL酯胶清漆中，混匀，得到DNA明胶纳米微凝胶的防伪涂料。
本实施例得到DNA明胶纳米微凝胶，平均粒径为170±9nm，参照图3第2泳道。取1mL防伪涂料均匀涂于直径为110mm滤纸片上，自然挥干。将该纸片投入烧杯中并加入体积比为1：1的正己烷与水混合溶液，萃取微凝胶。针对第一步所得扩增产物，设计一对能够扩增200bp长度的引物并计算其退火温度值按照说明书中条件进行PCR扩增检测。检测结果显示，该方法所得防伪涂胶中的DNA能够有效地被PCR扩增检测，可以起防伪作用。
实施例三
一种DNA明胶纳米微凝胶防伪涂料制备，包括以下步骤：
步骤一、从已知大肠杆菌DH5α基因序列，使用Primer Pemier5.0软件设计对应引物，Oligo6.0软件评价引物质量并计算其退火温度值。按照如下体系以及热循条件，进行聚合酶链式反应（以下简称PCR）扩增条件如下：50μL体系，其中包括10×PCR缓冲液5μL、1.0g/L模板DNA1μL、5.0U/μL TaqDNA聚合酶0.25μL、2.5mmol/L dNTP4μL、20μmol/L引物上下游各1μL；
扩增程序：95℃变性10分钟；95℃变性60秒，55.2℃退火60秒，72℃延伸60秒，共25个循环；72℃再延伸5分钟反应终止；扩增可获得一段长度为900bp的DNA片段；
步骤二、配置10%（w/v）明胶溶液，45℃条件下加入5倍体积的丙酮，弃掉上清，冷冻干燥，得到纯化明胶，并配成5%（w/v）纯化明胶溶液；
步骤三、取2mL纯化明胶溶液于50mL烧杯中，在50℃，600转/分钟的搅拌速度下，加入500μLDNA溶液，按0.5mL/s的速率滴加5mL的2mol/L醋酸钠溶液，并补加蒸馏水使溶液的总体积为10mL，使继续搅拌10分钟；加入0.5mL吐温-60，并将水浴锅温度降到30℃，继续搅拌30分钟；
步骤四、逐滴滴加20%(w/v)氯化钠，至溶液浑浊，并在1分钟内不再澄清，加入乙醇与异丙醇体积比1：1混合液至溶液澄清，搅拌30分钟；
步骤五、加入100μL25%甘油醛交联30秒，随后加入5.0mL的12%(w/v)偏重亚硫酸钠溶液终止交联反应，持续搅拌10h后，4℃静置过夜；
步骤六、透析72小时后真空冷冻干燥12小时得到白色针状粉末，取0.05g粉末溶解到10mL酯胶清漆中，混匀，得到DNA明胶纳米微凝胶的防伪涂料。
本实施例得到DNA明胶纳米微凝胶，平均粒径为206±23nm，参照图3第3泳道；取1mL防伪涂料均匀涂于直径为110mm滤纸片上，即涂料的密度为1.049×10-4mg/mm2，自然挥干；将该纸片投入烧杯中并加入体积比为1：1的正己烷与水混合溶液，萃取微凝胶。针对第一步所得扩增产物，设计一对能够扩增200bp长度的引物并计算其退火温度值按照说明书中条件进行PCR扩增检测；检测结果显示，该方法所得防伪涂胶中的DNA能够有效地被PCR扩增检测，可以起防伪作用。
实施例四
一种DNA明胶纳米微凝胶防伪涂料制备，包括以下步骤：
步骤一、从已知小牛胸腺基因序列，使用Primer Pemier5.0软件设计对应引物，Oligo6.0软件评价引物质量并计算其退火温度值。按照如下体系以及热循条件，进行聚合酶链式反应（以下简称PCR）扩增条件如下：50μL体系，其中包括10×PCR缓冲液5μL、1.0g/L模板DNA1μL、5.0U/μL TaqDNA聚合酶0.25μL、2.5mmol/L dNTP4μL、20μmol/L引物上下游各1μL；
扩增程序：95℃变性10分钟；95℃变性60秒，55.2℃退火60秒，72℃延伸60秒，共25个循环；72℃再延伸5分钟反应终止；扩增可获得一段长度为400bp的DNA片段；
步骤二、配置5%（w/v）明胶溶液，45℃条件下加入等体积的丙酮，弃掉上清，冷冻干燥，得到纯化明胶，并配成5%（w/v）纯化明胶溶液；
步骤三、取1mL纯化明胶溶液于50mL烧杯中，在50℃，200转/分钟的搅拌速度下，加入100μL DNA溶液，按0.5mL/s的速率滴加2mL的2mol/L醋酸钠溶液，补加蒸馏水使溶液的总体积为10mL，继续搅拌10分钟；加入0.5mL吐温-65，并将水浴锅温度降到15℃，继续搅拌30分钟；
步骤四、逐滴滴加20%(w/v)硫酸钠与20%(w/v)硫酸钠体积比1：1混合液，至溶液浑浊，并在1分钟内不再澄清，加入乙醇与异丙醇体积比1：1混合物至溶液澄清，搅拌30分钟；
步骤五、加入50μL25%表氯醇交联60秒，随后加入2.0mL的12%(w/v)偏重亚硫酸钠溶液终止交联反应，持续搅拌10h后，4℃静置过夜；
步骤六、透析72小时后真空冷冻干燥12小时得到白色针状粉末。取0.05g粉末溶解到10mL酯胶清漆中，混匀，得到DNA明胶纳米微凝胶的防伪涂料。
本实施例得到DNA明胶纳米微凝胶，参照图3第4泳道、图5和图6，平均粒径为243±28nm，形貌如图6所示。取1mL防伪涂料均匀涂于直径为110mm滤纸片上，即涂料的密度为1.049×10-4mg/mm2，自然挥干。将该纸片投入烧杯中并加入体积比为1：1的正己烷与水混合溶液，萃取微凝胶。针对第一步所得扩增产物，设计一对能够扩增200bp长度的引物并计算其退火温度值按照说明书中条件进行PCR扩增检测。检测结果显示，该方法所得防伪涂胶中的DNA能够有效地被PCR扩增检测，可以起防伪作用。
实施例五
一种DNA明胶纳米微凝胶防伪涂料制备，包括以下步骤：
步骤一、从已知小牛胸腺基因序列，使用Primer Pemier5.0软件设计对应引物，Oligo6.0软件评价引物质量并计算其退火温度值；按照如下体系以及热循条件，进行聚合酶链式反应（以下简称PCR）扩增条件如下：50μL体系，其中包括10×PCR缓冲液5μL、1.0g/L模板DNA1μL、5.0U/μL TaqDNA聚合酶0.25μL、2.5mmol/L dNTP4μL、20μmol/L引物上下游各1μL；
扩增程序：95℃变性10分钟；95℃变性60秒，55.2℃退火60秒，72℃延伸60秒，共25个循环；72℃再延伸5分钟反应终止；扩增可获得一段长度为720bp的DNA片段；
步骤二、配置5%（w/v）明胶溶液，45℃条件下加入等体积的丙酮，弃掉上清，冷冻干燥，得到纯化明胶，并配成5%（w/v）纯化明胶溶液；
步骤三、取2mL纯化明胶溶液于50mL烧杯中，在50℃，300转/分钟的搅拌速度下，加入100μLDNA溶液，按0.5mL/s的速率滴加5mL的2mol/L醋酸钠溶液，并补加蒸馏水使溶液的总体积为10mL，使继续搅拌10分钟；加入0.5mL吐温-80，并将水浴锅温度降到25℃，继续搅拌30分钟；
步骤四、逐滴滴加10%(w/v)硫酸钠与氯化钠质量比1：1混合溶液，至溶液浑浊，并在1分钟内不再澄清，加入乙醇至溶液澄清，搅拌30分钟；
步骤五、加入100μL氰酸酯交联60秒，随后加入2.0mL的12%(w/v)偏重亚硫酸钠溶液终止交联反应，持续搅拌10h后，4℃静置过夜；
步骤六、透析72小时后真空冷冻干燥12小时得到白色针状粉末；取0.01g粉末溶解到10mL酯胶清漆中，混匀，得到DNA明胶纳米微凝胶的防伪涂料。
本实施例得到DNA明胶纳米微凝胶，平均粒径为318±33nm，参照图3第5泳道，取1mL防伪涂料均匀涂于直径为110mm滤纸片上，即涂料的密度为1.049×10-4mg/mm2，自然挥干。将该纸片投入烧杯中并加入体积比为1：1的正己烷与水混合溶液，萃取微凝胶。针对第一步所得扩增产物，设计一对能够扩增200bp长度的引物并计算其退火温度值按照说明书中条件进行PCR扩增检测。检测结果显示，该方法所得防伪涂胶中的DNA能够有效地被PCR扩增检测，可以起防伪作用。
实施例六
一种DNA明胶纳米微凝胶防伪涂料制备，包括以下步骤：
步骤一、从已知大肠杆菌DH5α基因序列，使用Primer Pemier5.0软件设计对应引物，Oligo6.0软件评价引物质量并计算其退火温度值。按照如下体系以及热循条件，进行聚合酶链式反应（以下简称PCR）扩增条件如下：50μL体系，其中包括10×PCR缓冲液5μL、1.0g/L模板DNA1μL、5.0U/μL TaqDNA聚合酶0.25μL、2.5mmol/L dNTP4μL、20μmol/L引物上下游各1μL；
扩增程序：95℃变性10分钟；95℃变性60秒，55.2℃退火60秒，72℃延伸60秒，共25个循环；72℃再延伸5分钟反应终止；
扩增可获得一段长度为720bp的DNA片段；
步骤二、配置5%（w/v）明胶溶液，45℃条件下加入等体积的丙酮，弃掉上清，冷冻干燥，得到纯化明胶，并配成5%（w/v）纯化明胶溶液；
步骤三、取2mL纯化明胶溶液于50mL烧杯中，在50℃，300转/分钟的搅拌速度下，加入100μL DNA溶液，按0.5mL/s的速率滴加2mL的2mol/L醋酸钠溶液，并补加蒸馏水使溶液的总体积为10mL，使继续搅拌10分钟；加入0.5mL吐温-85，并将水浴锅温度降到30℃，继续搅拌30分钟；
步骤四、逐滴滴加20%(w/v)硫酸铵，至溶液浑浊，并在1分钟内不再澄清，加入异丙醇至溶液澄清，搅拌30分钟；
步骤五、加入50μL的氧化葡聚糖溶液。交联60秒，随后加入3.0mL的12%(w/v)偏重亚硫酸钠溶液终止交联反应，持续搅拌10h后，4℃静置过夜；
步骤六、透析72小时后真空冷冻干燥12小时得到白色针状粉末。取0.01g粉末溶解到10mL酯胶清漆中，混匀，得到DNA明胶纳米微凝胶的防伪涂料。
本实施例得到DNA明胶纳米微凝胶，平均粒径为340±6nm，参照图3第6泳道。取1mL防伪涂料均匀涂于直径为110mm滤纸片上，即涂料的密度为1.049×10-4mg/mm2，自然挥干。将该纸片投入烧杯中并加入体积比为1：1的正己烷与水混合溶液，萃取微凝胶。针对第一步所得扩增产物，设计一对能够扩增200bp长度的引物并计算其退火温度值按照说明书中条件进行PCR扩增检测。检测结果显示，该方法所得防伪涂胶中的DNA能够有效地被PCR扩增检测，可以起防伪作用。
实施例七
一种DNA明胶纳米微凝胶防伪涂料制备，包括以下步骤：
步骤一、从已知泡桐树叶树基因序列，使用Primer Pemier5.0软件设计对应引物，Oligo6.0软件评价引物质量并计算其退火温度值；按照如下体系以及热循条件，进行聚合酶链式反应（以下简称PCR）扩增条件如下：50μL体系，其中包括10×PCR缓冲液5μL、1.0g/L模板DNA1μL、5.0U/μL TaqDNA聚合酶0.25μL、2.5mmol/L dNTP4μL、20μmol/L引物上下游各1μL；
扩增程序：95℃变性10分钟；95℃变性60秒，55.2℃退火60秒，72℃延伸60秒，共25个循环；72℃再延伸5分钟反应终止；扩增可获得一段长度为400bp的DNA片段；
步骤二、配置5%（w/v）明胶溶液，45℃条件下加入等体积的丙酮，弃掉上清，冷冻干燥，得到纯化明胶，并配成5%（w/v）纯化明胶溶液；
步骤三、取2mL纯化明胶溶液于50mL烧杯中，在50℃，200转/分钟的搅拌速度下，加入100μLDNA溶液，按0.5mL/s的速率滴加2mL的2mol/L醋酸钠溶液，并补加蒸馏水使溶液的总体积为10mL，使继续搅拌10分钟；加入0.5mL司盘-20，并将水浴锅温度降到15℃，继续搅拌30分钟；
步骤四、逐滴滴20%(w/v)硫酸铵，至溶液浑浊，并在1分钟内不再澄清，加入异丙醇溶液澄清，搅拌30分钟；
步骤五、加入50μL的戊二醛溶液交联30秒，随后加入5.0mL的12%(w/v)偏重亚硫酸钠溶液终止交联反应，持续搅拌10h后，4℃静置过夜；
步骤六、透析72小时后真空冷冻干燥12小时得到白色针状粉末。取0.01g粉末溶解到10mL酯胶清漆中，混匀，得到DNA明胶纳米微凝胶的防伪涂料。
本实施例得到DNA明胶纳米微凝胶，平均粒径为384±6nm，参照图3第7泳道。取1mL防伪涂料均匀涂于直径为110mm滤纸片上，即涂料的密度为1.049×10-4mg/mm2，自然挥干。将该纸片投入烧杯中并加入体积比为1：1的正己烷与水混合溶液，萃取微凝胶。针对第一步所得扩增产物，设计一对能够扩增200bp长度的引物并计算其退火温度值按照说明书中条件进行PCR扩增检测。检测结果显示，该方法所得防伪涂胶中的DNA能够有效地被PCR扩增检测，可以起防伪作用。
实施例八
一种DNA明胶纳米微凝胶防伪涂料制备，包括以下步骤：
步骤一、从已知大肠杆菌DH5α基因序列，使用Primer Pemier5.0软件设计对应引物，Oligo6.0软件评价引物质量并计算其退火温度值；按照如下体系以及热循条件，进行聚合酶链式反应（以下简称PCR）扩增条件如下：50μL体系，其中包括10×PCR缓冲液5μL、1.0g/L模板DNA1μL、5.0U/μL TaqDNA聚合酶0.25μL、2.5mmol/L dNTP4μL、20μmol/L引物上下游各1μL；
扩增程序：95℃变性10分钟；95℃变性60秒，55.2℃退火60秒，72℃延伸60秒，共25个循环；72℃再延伸5分钟反应终止；扩增可获得一段长度为720bp的DNA片段；
步骤二、配置5%（w/v）明胶溶液，45℃条件下加入等体积的丙酮，弃掉上清，冷冻干燥，得到纯化明胶，并配成5%（w/v）纯化明胶溶液；
步骤三、取2mL纯化明胶溶液于50mL烧杯中，在50℃，200转/分钟的搅拌速度下，加入100μLDNA溶液，按0.5mL/s的速率滴加2mL的2mol/L醋酸钠溶液，并补加蒸馏水使溶液的总体积为10mL，使继续搅拌10分钟；加入0.5mL司盘-40，并将水浴锅温度降到25℃，继续搅拌30分钟；
步骤四、逐滴滴加20%(w/v)硫酸钠，至溶液浑浊，并在1分钟内不再澄清，加入异丙醇至溶液澄清，搅拌30分钟；
步骤五、加入75μL25%的戊二醛与甲醛体积比1：1混合液，交联30秒，随后加入2.0mL的12%(w/v)偏重亚硫酸钠溶液终止交联反应，持续搅拌10h后，4℃静置过夜；
步骤六、透析72小时后真空冷冻干燥12小时得到白色针状粉末。取0.01g粉末溶解到10mL酯胶清漆中，混匀，得到DNA明胶纳米微凝胶的防伪涂料。
本实施例得到DNA明胶纳米微凝胶，平均粒径为452±25nm，参照图3第8泳道。取1mL防伪涂料均匀涂于直径为110mm滤纸片上，即涂料的密度为1.049×10-4mg/mm2，自然挥干。将该纸片投入烧杯中并加入体积比为1：1的正己烷与水混合溶液，萃取微凝胶。针对第一步所得扩增产物，设计一对能够扩增200bp长度的引物并计算其退火温度值按照说明书中条件进行PCR扩增检测。检测结果显示，该方法所得防伪涂胶中的DNA能够有效地被PCR扩增检测，可以起防伪作用。
实施例九
一种DNA明胶纳米微凝胶防伪涂料制备，包括以下步骤：
步骤一、从已知小牛胸腺基因序列，使用Primer Pemier5.0软件设计对应引物，Oligo6.0软件评价引物质量并计算其退火温度值；按照如下体系以及热循条件，进行聚合酶链式反应（以下简称PCR）扩增条件如下：50μL体系，其中包括10×PCR缓冲液5μL、1.0g/L模板DNA1μL、5.0U/μL TaqDNA聚合酶0.25μL、2.5mmol/L dNTP4μL、20μmol/L引物上下游各1μL；
扩增程序：95℃变性10分钟；95℃变性60秒，55.2℃退火60秒，72℃延伸60秒，共25个循环；72℃再延伸5分钟反应终止；扩增可获得一段长度为720bp的DNA片段；
步骤二、配置5%（w/v）明胶溶液，45℃条件下加入等体积的丙酮，弃掉上清，冷冻干燥，得到纯化明胶，并配成5%（w/v）纯化明胶溶液；
步骤三、取2mL纯化明胶溶液于50mL烧杯中，在50℃，200转/分钟的搅拌速度下，加入100μLDNA溶液，按0.5mL/s的速率滴加2mL的2mol/L醋酸钠溶液，并补加蒸馏水使溶液的总体积为10mL，使继续搅拌10分钟；加入0.5mL司盘-60，并将水浴锅温度降到30℃，继续搅拌30分钟；
步骤四、逐滴滴加20%(w/v)硫酸铵，至溶液浑浊，并在1分钟内不再澄清，加入异丙醇至溶液澄清，搅拌30分钟；
步骤五、加入50μL25%的戊二醛交联30秒，随后加入2.0mL的12%(w/v)偏重亚硫酸钠溶液终止交联反应，持续搅拌10h后，4℃静置过夜；
步骤六、透析72小时后真空冷冻干燥12小时得到白色针状粉末。取0.01g粉末溶解到10mL酯胶清漆中，混匀，得到DNA明胶纳米微凝胶的防伪涂料。
本实施例得到DNA明胶纳米微凝胶，平均粒径为523±18nm，参照图3第9泳道。取1mL防伪涂料均匀涂于直径为110mm滤纸片上，即涂料的密度为1.049×10-4mg/mm2，自然挥干。将该纸片投入烧杯中并加入体积比为1：1的正己烷与水混合溶液，萃取微凝胶。针对第一步所得扩增产物，设计一对能够扩增200bp长度的引物并计算其退火温度值按照说明书中条件进行PCR扩增检测。检测结果显示，该方法所得防伪涂胶中的DNA能够有效地被PCR扩增检测，可以起防伪作用。
实施例十
一种DNA明胶纳米微凝胶防伪涂料制备，包括以下步骤：
步骤一、从已知小牛胸腺基因序列，使用Primer Pemier5.0软件设计对应引物，Oligo6.0软件评价引物质量并计算其退火温度值；按照如下体系以及热循条件，进行聚合酶链式反应（以下简称PCR）扩增条件如下：50μL体系，其中包括10×PCR缓冲液5μL、1.0g/L模板DNA1μL、5.0U/μL TaqDNA聚合酶0.25μL、2.5mmol/L dNTP4μL、20μmol/L引物上下游各1μL；
扩增程序：95℃变性10分钟；95℃变性60秒，55.2℃退火60秒，72℃延伸60秒，共25个循环；72℃再延伸5分钟反应终止；扩增可获得一段长度为720bp的DNA片段；
步骤二、配置5%（w/v）明胶溶液，45℃条件下加入等体积的丙酮，弃掉上清，冷冻干燥，得到纯化明胶，并配成5%（w/v）纯化明胶溶液；
步骤三、取2mL纯化明胶溶液于50mL烧杯中，在50℃，600转/分钟的搅拌速度下，加入100μLDNA溶液，按0.5mL/s的速率滴加2mL的2mol/L醋酸钠溶液，并补加蒸馏水使溶液的总体积为10mL，使继续搅拌10分钟；加入0.5mL司盘-80，并将水浴锅温度降到25℃，继续搅拌30分钟；
步骤四、逐滴滴加20%(w/v)氯化钠，至溶液浑浊，并在1分钟内不再澄清，加入异丙醇至溶液澄清，搅拌30分钟；
步骤五、滴加75μL25%戊二醛溶液交联0秒，加入2.0mL的12%(w/v)偏重亚硫酸钠溶液，持续搅拌10h后，4℃静置过夜；
步骤六、透析72小时后真空冷冻干燥12小时得到白色针状粉末。取0.01g粉末溶解到10mL酯胶清漆中，混匀得到DNA明胶纳米微凝胶的防伪涂料。
本实施例得到DNA明胶纳米微凝胶，平均粒径为813±45nm，参照图3第10泳道。取1mL防伪涂料均匀涂于直径为110mm滤纸片上，即涂料的密度为1.049×10-4mg/mm2，自然挥干。将该纸片投入烧杯中并加入体积比为1：1的正己烷与水混合溶液，萃取微凝胶。针对第一步所得扩增产物，设计一对能够扩增200bp长度的引物并计算其退火温度值按照说明书中条件进行PCR扩增检测。检测结果显示，该方法所得防伪涂胶中的DNA能够有效地被PCR扩增检测，可以起防伪作用。
Claims (2)
1.一种DNA明胶纳米微凝胶防伪涂料制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、从泡桐树叶、小牛胸腺或大肠杆菌DH5αDNA中，通过聚合酶链式反应（PCR），扩增一段长度为400-900bp的DNA片段；
步骤二、将5-10%（w/v）的明胶溶液，45℃条件下加入体积比1：1-1：5的丙酮中，弃掉上清，冷冻干燥，得到纯化明胶，并配成5%（w/v）纯化明胶溶液；
步骤三、取1-2mL步骤二中所得纯化明胶溶液于50mL烧杯中，在50℃，200-600转/分钟的搅拌速度下，加入50-500μL步骤一所得DNA溶液，按照0.5mL/s的速率滴加2-5mL浓度2mol/L醋酸钠溶液，并补加蒸馏水使溶液的总体积为10mL，继续搅拌10分钟；加入0.5mL表面活性剂，并将体系温度降到15-30℃，继续搅拌30分钟；
所述步骤三中的表面活性剂包括吐温-20、吐温-40、吐温-60、吐温-65、吐温-80、吐温-85、司盘-20、司盘-40、司盘-60、司盘-80中的一种；
步骤四、逐滴滴加蛋白沉淀剂，至溶液浑浊，并在1分钟内不再澄清，加入溶剂化试剂至溶液澄清，搅拌30分钟；
所述的蛋白沉淀剂为硫酸钠、硫酸铵或氯化钠中的一种，或者其中两种以上任意比例的混合物；
所述的溶剂化试剂为乙醇、异丙醇中的一种或这两种任意比例的混合物；
步骤五、加入50-100μL的交联剂交联0-90秒，随后加入2.0-5.0mL浓度12%(w/v)偏重亚硫酸钠溶液终止交联反应，持续搅拌10h后，4℃静置过夜；
所述交联剂为甲醛、戊二醛、甘油醛、表氯醇、氰酸酯、氧化葡聚糖中的一种或者其中两种以上的混合物；
步骤六、透析72小时，真空冷冻干燥12小时得到白色粉末即DNA明胶纳米微凝胶；取0.005-0.05g该粉末溶解到10mL酯胶清漆中，混匀，即可制成DNA明胶纳米微凝胶的防伪涂料。
2.根据权利要求1所述的一种DNA明胶纳米微凝胶防伪涂料制备方法，其特征在于，步骤一的扩增具体为：从已知泡桐树叶树、小牛胸腺或大肠杆菌DH5α基因序列，使用Primer Pemier5.0软件设计对应引物，Oligo6.0软件评价引物质量并计算其退火温度值，按照如下体系以及热循条件，进行聚合酶链式反应扩增条件如下：50μL体系，其中包括10×PCR缓冲液5μL、1.0g/L模板DNA1μL、5.0U/μL TaqDNA聚合酶0.25μL、2.5mmol/L dNTP4μL、20μmol/L引物上下游各1μL；扩增程序：95℃变性10分钟；95℃变性60秒，55.2℃退火60秒，72℃延伸60秒，共25个循环；72℃再延伸5分钟反应终止。
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108159022A (zh) * | 2017-12-26 | 2018-06-15 | 西安医学院 | 一种阿霉素与abt-263双药纳米载体及其制备方法 |
| CN110189146A (zh) * | 2019-05-28 | 2019-08-30 | 何震 | 一种基于区块链的艺术品身份标识系统 |
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Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1302905A (zh) * | 2000-12-22 | 2001-07-11 | 天津南开戈德集团有限公司 | 含脱氧核糖核酸类物质防伪识别材料的制作方法 |
| CN1891301A (zh) * | 2005-01-27 | 2007-01-10 | 复旦大学 | 一种纳米微凝胶、其制备方法及应用 |
| US20090069903A1 (en) * | 2007-07-03 | 2009-03-12 | Histogenics Corporation | Method For Improvement Of Differentiation Of Mesenchymal Stem Cells Using A Double-Structured Tissue Implant |
| CN101891986A (zh) * | 2010-06-23 | 2010-11-24 | 叶欣 | 一种利用单核甘酸多态性生物遗传标记进行防伪的印泥 |
| US20110014131A1 (en) * | 2009-07-20 | 2011-01-20 | Nanoink, Inc. | Nanomolding micron and nano scale features |
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1302905A (zh) * | 2000-12-22 | 2001-07-11 | 天津南开戈德集团有限公司 | 含脱氧核糖核酸类物质防伪识别材料的制作方法 |
| CN1891301A (zh) * | 2005-01-27 | 2007-01-10 | 复旦大学 | 一种纳米微凝胶、其制备方法及应用 |
| US20090069903A1 (en) * | 2007-07-03 | 2009-03-12 | Histogenics Corporation | Method For Improvement Of Differentiation Of Mesenchymal Stem Cells Using A Double-Structured Tissue Implant |
| US20110014131A1 (en) * | 2009-07-20 | 2011-01-20 | Nanoink, Inc. | Nanomolding micron and nano scale features |
| CN101891986A (zh) * | 2010-06-23 | 2010-11-24 | 叶欣 | 一种利用单核甘酸多态性生物遗传标记进行防伪的印泥 |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108159022A (zh) * | 2017-12-26 | 2018-06-15 | 西安医学院 | 一种阿霉素与abt-263双药纳米载体及其制备方法 |
| CN108159022B (zh) * | 2017-12-26 | 2020-05-26 | 西安医学院 | 一种阿霉素与abt-263双药纳米载体及其制备方法 |
| CN110189146A (zh) * | 2019-05-28 | 2019-08-30 | 何震 | 一种基于区块链的艺术品身份标识系统 |
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