CN103271901A - 二氢杨梅素在制备抗肝癌药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药领域领域，更具体地，涉及二氢杨梅素在制备抗肝癌药物中的应用。二氢杨梅素作为一种黄酮类化合物，显示出了较强的抗癌特性。试验证明，二氢杨梅素在抑制肝癌细胞的增殖，诱导肝癌细胞凋亡，降低肝癌细胞粘附能力及组织肝癌细胞侵袭和转移的方面都可发挥积极作用，同时，DHM可显著降低肝癌细胞中过氧化物，谷胱甘肽和ATP的含量。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域领域，更具体地，涉及二氢杨梅素在制备抗肝癌药物中的应用。
背景技术
肝癌是临床常见恶性肿瘤之一，全球每年新发肝癌患者约60万，患者死亡率高居世界第三位。我国是乙肝大国，原发性肝癌多在乙肝肝硬化的基础上发展而来，同时长期酗酒以及不良的饮食习惯也被证明与肝癌发生有着密切的关系。目前我国肝癌发病人数约占全球肝癌发病总人数半数以上，肝癌已经成为严重威胁人民健康和生命的一大杀手，其危险性不容小视。因此，寻找与开发可有效抑制肝癌细胞生长于迁移的药物，延长肝癌患者的生存时间，降低肝癌死亡率具有非常重要的意义。
二氢杨梅素（Dihydromyricetin,DHM），又名蛇葡萄素（Ampelopsin）。提取自葡萄科蛇葡萄属植物藤茶的叶中，属黄酮类化合物，其分子式为C15H12O8。有研究证明，DHM可加速乙醇代谢产物乙醛的快速分解，从而降低酒精对肝脏的损害，另外，DHM已被证明的护肝作用还包括改善肝细胞损伤引起的血清乳酸脱氢酶活力增加，抑制肝性M细胞胶原纤维形成等。但目前为止未见有将二氢杨梅素作为抗肝癌药物的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中的上述不足，提供一种二氢杨梅素在制备抗肝癌药物中的应用。
本发明所要解决的上述技术问题通过以下技术方案予以实现：
二氢杨梅素在制备抗肝癌药物中的应用。
所述的二氢杨梅素具有如下结构：
二氢杨梅素在制备抗肝癌药物中的应用。
二氢杨梅素在制备肝癌细胞迁移抑制剂的应用。
作为一种优选方案，所述的肝癌细胞为QGY7701、QSG7701、Huh7、MHcc97H、MHcc97L、QGY7703、SK-HEP-1或HepG2细胞。
二氢杨梅素在制备降低肝癌细胞中ATP含量的药物的应用。
作为一种优选方案，所述的肝癌细胞为QGY7701、QSG7701、Huh7、MHcc97H、MHcc97L、QGY7703、SK-HEP-1或HepG2细胞。
二氢杨梅素在制备降低肝癌细胞的GSH含量的药物的应用。
作为一种优选方案，所述的肝癌细胞为QGY7701、QSG7701、Huh7、MHcc97H、MHcc97L、QGY7703、SK-HEP-1或HepG2细胞。
二氢杨梅素在制备降低肝癌细胞活性氧（ROS）含量的药物的应用。
作为一种优选方案，所述的肝癌细胞为QGY7701、QSG7701、Huh7、MHcc97H、MHcc97L、QGY7703、SK-HEP-1或HepG2细胞。
二氢杨梅素在制备抑制肝癌细胞QGY7701增殖的药物或制备诱导肝癌细胞QGY7701凋亡的药物中的应用。
二氢杨梅素在制备QGY7701细胞的P53、Caspase3、Caspase9或PARP表达促进剂上的应用。
二氢杨梅素在制备QSG7701细胞的P53、Caspase3、Caspase9或PARP表达促进剂上的应用。
二氢杨梅素在制备抑制肝癌细胞QSG7701、Huh7、MHcc97H、MHcc97L、QGY7703或SK-HEP-1增殖的药物中的应用。
二氢杨梅素在制备抑制原代肝癌细胞增殖或诱导原代肝癌细胞凋亡的药物、或制备中的应用。
本发明具有如下有益效果：DHM作为一种黄酮类化合物，显示出了较强的抗癌特性。试验证明，DHM在抑制肝癌细胞的增殖，诱导肝癌细胞凋亡，降低肝癌细胞粘附能力及组织肝癌细胞侵袭和转移的方面都可发挥积极作用，同时，DHM可显著降低肝癌细胞中过氧化物，谷胱甘肽和ATP的含量。
由本发明的实施方案可以看出，DHM对多种肝癌细胞均具有抑制增殖和诱导凋亡的作用，尤其是对QGY7701,QSG7701,QGY7703更加具有十分突出抑制率，特异性非常明显，效果显著。同时,试验证实DHM对正常肝细胞没有毒害作用。
附图说明
图1：二氢杨梅素分子式。
图2:不同浓度DHM对HepG2细胞的抑制作用。
图3：不同浓度DHM对QGY7701细胞的抑制作用。
图4：不同浓度DHM对QSG7701细胞的抑制作用。
图5：不同浓度DHM对Hepal-6细胞的抑制作用。
图6：不同浓度DHM对Huh7细胞的抑制作用。
图7：不同浓度DHM对MHcc97H细胞的抑制作用。
图8：不同浓度DHM对MHcc97L细胞的抑制作用。
图9：不同浓度DHM对QGY7703细胞的抑制作用。
图10：不同浓度DHM对SK-HEP-1细胞的抑制作用。
图11：不同浓度DHM对L-02细胞的作用。
图12：不同浓度DHM对HL7702细胞的作用
图13-A1：QSG7701细胞在DHM作用12h时control组细胞图片。
图13-A2：QSG7701细胞在DHM作用12h时5μM组细胞图片。
图13-A3：QSG7701细胞在DHM作用12h时10μM组细胞图片。
图13-A4：QSG7701细胞在DHM作用12h时25μM组细胞图片。
图13-A5：QSG7701细胞在DHM作用12h时50μM组细胞图片。
图13-A6：QSG7701细胞在DHM作用12h时100μM组细胞图片。
图13-A7：QSG7701细胞在DHM作用12h时150μM组细胞图片。
图13-B1：QSG7701细胞在DHM作用24h时control组细胞图片。
图13-B2：QSG7701细胞在DHM作用24h时5μM组细胞图片。
图13-B3：QSG7701细胞在DHM作用24h时10μM组细胞图片。
图13-B4：QSG7701细胞在DHM作用24h时25μM组细胞图片。
图13-B5：QSG7701细胞在DHM作用24h时50μM组细胞图片。
图13-B6：QSG7701细胞在DHM作用24h时100μM组细胞图片。
图13-B7：QSG7701细胞在DHM作用24h时150μM组细胞图片。
图13-C1：QSG7701细胞在DHM作用36h时control组细胞图片。
图13-C2：QSG7701细胞在DHM作用36h时5μM组细胞图片。
图13-C3：QSG7701细胞在DHM作用36h时10μM组细胞图片。
图13-C4：QSG7701细胞在DHM作用36h时25μM组细胞图片。
图13-C5：QSG7701细胞在DHM作用36h时50μM组细胞图片。
图13-C6：QSG7701细胞在DHM作用36h时100μM组细胞图片。
图13-C7：QSG7701细胞在DHM作用36h时150μM组细胞图片。
图13-D1：QSG7701细胞在DHM作用48h时control组细胞图片。
图13-D2：QSG7701细胞在DHM作用48h时5μM组细胞图片。
图13-D3：QSG7701细胞在DHM作用48h时10μM组细胞图片。
图13-D4：QSG7701细胞在DHM作用48h时25μM组细胞图片。
图13-D5：QSG7701细胞在DHM作用48h时50μM组细胞图片。
图13-D6：QSG7701细胞在DHM作用48h时100μM组细胞图片。
图13-D7：QSG7701细胞在DHM作用48h时150μM组细胞图片。
图13-E1：QSG7701细胞在DHM作用72h时control组细胞图片。
图13-E2：QSG7701细胞在DHM作用72h时5μM组细胞图片。
图13-E3：QSG7701细胞在DHM作用72h时10μM组细胞图片。
图13-E4：QSG7701细胞在DHM作用72h时25μM组细胞图片。
图13-E5：QSG7701细胞在DHM作用72h时50μM组细胞图片。
图13-E6：QSG7701细胞在DHM作用72h时100μM组细胞图片。
图13-E7：QSG7701细胞在DHM作用72h时150μM组细胞图片。
图14：不同浓度DHM处理后24h后QGY7701细胞的凋亡情况。
图15：DHM对SK-HEP-1细胞粘附能力的影响。
图16-A：不同浓度DHM处理24h后HepG2细胞凋亡相关因子的表达情况。
图16-B：不同浓度DHM处理24h后QSG7701细胞凋亡相关因子的表达情况。
图16-C：不同浓度DHM处理24h后Hepal-6细胞凋亡相关因子的表达情况。
图16-D：不同浓度DHM处理24h后QGY7703细胞凋亡相关因子的表达情况。
图17：DHM对SK-HEP-1细胞运动能力的影响。
图18-A：SK-HEP-1细胞侵袭试验对照组细胞图片。
图18-B：SK-HEP-1细胞侵袭试验DHM处理50μM组细胞图片。
图18-C：SK-HEP-1细胞侵袭试验DHM处理100μM组细胞图片。
图18-D：DHM对SK-HEP-1细胞侵袭能力的影响。
图19：DHM对降解肝癌细胞基底膜酶类（mmp系统）的影响。
图20-A：不同浓度DHM处理6h后HepG2细胞ROS含量比较。
图20-B：不同浓度DHM处理12h后HepG2细胞ROS含量比较。
图20-C：不同浓度DHM处理24h后HepG2细胞ROS含量比较。
图21-A：不同浓度DHM处理6h后HepG2细胞GSH含量比较。
图21-B：不同浓度DHM处理12h后HepG2细胞GSH含量比较。
图21-C：不同浓度DHM处理24h后HepG2细胞GSH含量比较。
图22-A：不同浓度DHM处理6h后HepG2细胞ATP含量比较。
图22-B：不同浓度DHM处理12h后HepG2细胞ATP含量比较。
图22-C：不同浓度DHM处理24h后HepG2细胞ATP含量比较。
图23：不同浓度DHM对原代肝癌细胞的抑制作用。
图24：不同浓度DHM处理后24h后原代肝癌细胞的凋亡情况。
图25：DHM对HL7702细胞凋亡的影响
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例本身对发明不做任何形式的限定。
实施例1DHM对肝癌细胞系增殖的影响
一、肝癌细胞株体外培养
1.细胞来源
人肝癌细胞系HepG2，Huh7，SK-HEP-1购自中国科学院上海细胞库；MHcc97L，MHcc97H，QSG7701，QGY7703购自上海拜力生物科技有限公司；QGY7701购自上海市妇幼保健院；人正常肝细胞株L-02购自Science Cell公司；小鼠肝癌细胞株Hepal-6获赠自上海交通大学。
2．细胞培养与传代
HepG2，QSG7701，L-02和Hepal-6使用1640培养基（Gibco）；Huh7，SK-HEP-1，MHcc97L，MHcc97H，QGY7701和QGY7703使用DMEM培养基（Gibco）。在细胞培养时向培养基中添加10%胎牛血清（fetal bovine serum,FBS,Gibco）。上述细胞株均在37℃，5%CO2培养箱中培养，待细胞生长至占培养皿底部80～90%时，使用0.25%胰酶-EDTA消化并传代。
二、DHM对细胞增殖能力的影响
主要试验材料：二氢杨梅素（Dihydromyrictin,DHM,Sigma）溶解于二甲亚砜（DMSO）中，配制成50mM浓缩液，-20℃保存，使用时分别稀释为5,10,25,50,100和150μM，即配即用；噻唑蓝（MTT,Sigma）溶于PBS中，终浓度为5mg/mL，4℃保存，配制后一周内使用；胰酶（Gibco）；PBS；6孔板（Nunc）。
试验方法：将细胞消化，离心并重悬浮于相应培养液中，以1×104/孔的密度种植于96孔板，置于37℃，5%CO2培养箱中培养24h后，移除原培养液，加入新鲜配制的，分别含有5,10,25,50,100,150μM DHM的培养液继续培养，分别于培养的12h,24h,36h,48h和72h终止培养，向每孔加入20μL MTT，再重新置于37℃，5%CO2培养箱中培养4h后，小心移除含有MTT的培养液，每孔加入DMSO150μL,小心摇晃混匀后在酶标仪OD570nm处检测各孔的吸光值。每个浓度设置三个重复组。
试验结果：
DHM对HepG2细胞具有一定的剂量依赖效应，在DHM作用36h后，DHM对HepG2细胞的抑制率可超过10%，处理72h后，150μM组的抑制率可达到20%（图2）；
DHM对QGY7701,QSG7701和Hepal-6细胞具有明显的时间依赖性抑制作用和剂量依赖性抑制作用：QGY7701细胞在DHM作用24h后，150μM组的抑制率即可达到40%以上，作用48h后150μM组的抑制率可超过50%（图3）；QSG7701细胞在DHM作用24h后出现呈剂量依赖与时间依赖性的细胞碎裂现象（图13）,细胞碎片使得MTT检测显示出促进细胞生长的假阳性结果，（图4）经DAPI染色观察，发现在碎裂现象严重的高浓度试验组中细胞全部死亡，即处理时间超过36h，药物处理浓度超过50μM时，抑制率可达到100%；在药物作用48h前，低浓度的DHM对Hepal-6细胞的影响似乎没有明显的剂量依赖，但150μM组的抑制率显著高于其他各组，在药物处理48h后，抑制率达到40%以上（P＜0.05），在药物作用72h时，同样因为细胞死亡碎裂的原因而显示出了DHM促进细胞增殖的假阳性结果（图5）。
DHM对Huh7,MHcc97H和MHcc97L细胞的作用没有明显的剂量依赖现象，但随着处理时间的延长，细胞增殖的抑制率呈上升趋势：在DHM处理12h时，各浓度组几乎没有增殖抑制现象，但在处理24h之后，抑制率随时间推移逐步升高，但Huh7和MHcc97L细胞的部分试验组会因严重的细胞碎裂现象而呈现强促增殖的假阳性结果。其中，MHcc97H在DHM处理72h时，150μM组的抑制率可达到50%；MHcc97L在DHM处理72h时抑制率可超过30%；Huh7在DHM作用48h后，处理浓度大于50μM的试验组抑制率均可超过40%（图6,7,8）。
DHM对QGY7703，SK-HEP-1和L-02，HL7702没有明显的增殖抑制作用（图9,10,11，12）。
实施例2DHM对肝癌细胞凋亡的诱导作用
一、细胞培养与传代
本试验使用人肝癌细胞系QGY7701购自上海妇幼保健院，培养基为添加10%FBS的DMEM培养液，在37℃，5%CO2培养箱中培养，待细胞生长至占培养皿底部80～90%时，使用0.25%胰酶-EDTA消化并传代。
二、DHM对肝癌细胞凋亡的影响
主要试验材料：DHM,溶解于二甲亚砜（DMSO）中，配制成50mM浓缩液，-20℃保存，使用时分别稀释为25,50,100和150μM，即配即用；FITC AnnexinⅤ Apoptosis Detection Kit Ⅰ(BD Pharmingen)；Accutase-Enzyme CellDetachment Medium(eBioscience)；PBS；60mm培养皿，流式专用上样管。
试验方法：将细胞消化成细胞悬液后，以合适的密度铺于60mm培养皿中，于37℃，5%CO2培养箱中孵育约24h，待细胞生长至占培养皿底部50%左右时，移除原培养液，加入新鲜配制的，分别含有25,50,100,150μM DHM的培养液继续培养。培养24h后小心收集上清液并使用Accutase-Enzyme CellDetachment Medium消化细胞，将细胞悬液与上清液混合离心，将收集到的细胞用PBS洗涤一次，离心并重悬浮于1×Binding Buffer，调节细胞密度为1×106个/mL。吸取100μL细胞悬液至上样管中，加入5μL Annexin Ⅴ–FITC和5μLPropidium Iodide(PI)，混匀后避光室温反应15min，再向每管中加入400μL1×Binding Buffer，使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
试验结果：DHM诱导肝癌细胞凋亡的能力呈现剂量依赖性。在加药处理24h时，各组细胞的凋亡率伴随加药浓度的增加而升高，当药物浓度达到100μM时，细胞的凋亡率可达到26.03±4.69（图14）。
实施例3细胞凋亡相关因子表达Werstern Blotting检测
一、细胞培养与传代
人肝癌细胞系HepG2购自中国科学院上海细胞库；QSG7701，QGY7703购自上海拜力生物科技有限公司；小鼠肝癌细胞株Hepal-6获赠自上海交通大学。HepG2，QSG7701和Hepal-6使用1640培养基（Gibco），QGY7703使用DMEM培养基（Gibco）。在细胞培养时向培养基中添加10%胎牛血清（fetal bovine serum,FBS,Gibco）。上述细胞株均在37℃，5%CO2培养箱中培养，待细胞生长至占培养皿底部80～90%时，使用0.25%胰酶-EDTA消化并传代。
二、细胞凋亡相关因子的表达检测
主要试验材料：DHM,溶解于二甲亚砜（DMSO）中，配制成50mM浓缩液，-20℃保存，使用时分别稀释为50和100μM，即配即用；RIPA裂解液（Beyotime）；PMSF；BCA蛋白浓度测定试剂盒（Beyotime），兔抗人一抗（P53,PARP,Caspase3,Caspase8,Caspase9）；小鼠抗人一抗（β-Tubulin）；辣根过氧化物酶共轭的山羊抗兔二抗和山羊抗鼠二抗；丙烯酰胺，SDS，亚硫酸铵，Tris-Base，PVDF膜，ECL发光液（GE Healthcare）。
试验方法：将细胞消化成细胞悬液后，以合适的密度铺于60mm培养皿中，于37℃，5%CO2培养箱中孵育约24h，待细胞生长至占培养皿底部60%左右时，移除原培养液，加入新鲜配制的，分别含有50μM和100μM DHM的培养液继续培养，以不加DHM的培养液为对照组。在加入DHM后24h终止培养，移除培养液并用PBS洗涤两次，加入含有1%PMSF的RIPA裂解液裂解细胞。将裂解液4℃，12000×g/min离心10min，收集上清，测定蛋白浓度后，等蛋白量上样，10%SDS-PAGE电泳分离蛋白，转膜至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭，TBST（含1%Tween20）洗涤后一抗（P53,PARP,Caspase3,Caspase8,Caspase9）4℃孵育过夜。TBST洗涤5次，每次5min，二抗室温孵育1h，TBST洗涤5次，每次5min，使用ECL发光液化学发光并在暗室曝光，分析相关蛋白表达趋势。
试验结果：
HepG2细胞在DHM处理24h时，随着DHM浓度的增加，P53，Caspase8与Caspase9的主条带与剪切条带均表现出增强趋势；PARP表达则呈现递减趋势；Caspase3的表达无明显变化（图16-A）。
QSG7701细胞在DHM处理24h时，随着DHM浓度的增加，P53，Caspase3,Caspase8的剪切片段，PARP的主带及剪切片段均呈现递增的趋势；Caspase9的表达无显著变化（图16-B）。
Hepal-6细胞在DHM处理24h时，随着DHM浓度的增加，P53，Caspase8和Caspase9呈现递增趋势；PARP主带及剪切条带均随浓度增加而减弱；Caspase3的表达无显著变化（图16-C）。
QGY7701细胞在DHM处理24h时，随着DHM浓度的增加，P53，Caspase3，Caspase9，PARP均呈现递增的趋势（图16-D）。
实施例4DHM对肝癌细胞的粘附功能的影响
一、细胞培养与传代
本试验使用人肝癌细胞系SK-HEP-1购自中国科学院上海细胞库，培养基为添加10%FBS的DMEM培养液，在37℃，5%CO2培养箱中培养，待细胞生长至占培养皿底部80～90%时，使用0.25%胰酶-EDTA消化并传代。
二、细胞粘附试验
主要试验材料：二氢杨梅素（Dihydromyrictin,DHM,Sigma）溶解于二甲亚砜（DMSO）中，配制成50mM浓缩液，-20℃保存，使用时分别稀释为10,25，50，100和150μM，即配即用；噻唑蓝（MTT,Sigma）溶于PBS中，终浓度为5mg/mL，4℃保存，配制后一周内使用；胰酶；96孔板。
试验方法：将细胞消化，离心，分别用含有0，10，25，50，100，150μM DHM的DMEM培养基重悬浮细胞，调整细胞密度为1×106个/mL，接种在铺有Matrigel基质的96孔板中，每孔100μL，置于37℃，5%CO2培养箱中贴壁培养，24h后移除含DHM的培养液，更换新培养液后，向每孔加入20μL MTT，再重新置于37℃，5%CO2培养箱中培养4h，小心移除含有MTT的培养液，每孔加入DMSO150μL，轻摇混匀后在酶标仪OD570nm处检测各孔的吸光值。每个浓度设置三个重复组。
试验结果：结果显示，添加DHM的试验组细胞的贴壁能力显著低于对照组(P＜0.01)，且细胞的贴壁能力与DHM的浓度存在剂量依赖（图15）。说明DHM可有效降低肝癌细胞的粘附能力。
实施例5DHM对肝癌细胞运动功能的影响
一、细胞培养与传代
本试验使用人肝癌细胞系SK-HEP-1购自中国科学院上海细胞库，培养基为添加10%FBS的DMEM培养液，在37℃，5%CO2培养箱中培养，待细胞生长至占培养皿底部80～90%时，使用0.25%胰酶-EDTA消化并传代。
二、细胞迁移试验
主要试验材料：二氢杨梅素（Dihydromyrictin,DHM,Sigma）溶解于二甲亚砜（DMSO）中，配制成50mM浓缩液，-20℃保存，使用时分别稀释为50，100μM，即配即用。
试验方法：将细胞消化，离心，重悬浮后以5×105个/孔的密度接种于六孔板中，置于37℃，5%CO2培养箱中培养24h，待细胞生长至融合状态，用枪头在六孔板上做一条笔直的划痕，划痕完毕后，小心吸出培养液，加入适量PBS清洗3遍，每孔加入无血清DMEM并加药（0，50，100μM）。在37℃，5%CO2培养箱中继续培养24h后终止培养，于倒置显微镜下观察划痕愈合的程度并拍照。
试验结果：由细胞划痕图片可以看出，在未经药物处理的对照组，划痕12h时已经有一定数量的细胞迁徙至划痕处，而24h后迁徙至划痕处的细胞数量更多；而经DHM处理过的试验组，不论是50μM组还是100μM组，其中肝癌细胞的运动能力都受到明显的抑制，处理后12h和24h迁移入划痕区的细胞明显少于对照组（图17）。
实施例6DHM对肝癌细胞基底膜侵袭能力的影响
一、细胞培养与传代
本试验使用人肝癌细胞系SK-HEP-1购自中国科学院上海细胞库，培养基为添加10%FBS的DMEM培养液，在37℃，5%CO2培养箱中培养，待细胞生长至占培养皿底部80～90%时，使用0.25%胰酶-EDTA消化并传代。
二、细胞侵袭试验
主要试验材料：二氢杨梅素（Dihydromyrictin,DHM,Sigma）溶解于二甲亚砜（DMSO）中，配制成50mM浓缩液，-20℃保存，使用时分别稀释为50和150μM，即配即用；聚碳酸酯膜；24孔板；Transwell细胞培养小室。
试验方法：将细胞用含有1%BSA的DMEM培养液饥饿培养过夜，向24孔板中加入含10%FBS的DMEM培养液，每孔600μL，并在孔中浸入粘有聚碳酸酯膜的Transwell细胞培养小室（聚碳酸酯膜上铺有一层Matrigel作为基质屏障）。消化细胞，计数后每孔接种细胞1×105个，接种细胞时所使用的培养液分别为含有0,50,100μM DHM的DMED培养基（含10%FBS）。将24孔板放入37℃，5%CO2培养箱中孵育24h，取出小室及聚碳酸酯膜，将膜用甲醇固定，HE染色后用棉签擦掉膜上层未穿过的细胞，二甲苯透化后用中性树胶封片，置于显微镜下计数侵袭细胞。
试验结果：经50μM和100μM DHM处理的试验组在孵育24h后，侵入聚碳酸质膜的细胞数量（19.60±5.59和7.80±5.22，图18-B,C）显著少于未经药物处理的对照组（69.60±26.60，图18-A）。说明DHM可有效地抑制肝癌细胞的侵袭作用（图18-D）。
实施例7DHM对降解肝癌细胞基底膜酶类（mmp系统）的影响
一、细胞培养与传代
本试验使用人肝癌细胞系SK-HEP-1购自中国科学院上海细胞库，培养基为添加10%FBS的DMEM培养液，在37℃，5%CO2培养箱中培养，待细胞生长至占培养皿底部80～90%时，使用0.25%胰酶-EDTA消化并传代。
二、肝癌细胞基底膜酶类蛋白表达检测
主要试验材料：DHM,溶解于二甲亚砜（DMSO）中，配制成50mM浓缩液，-20℃保存，使用时分别稀释为50和100μM，即配即用；RIPA裂解液（Beyotime）；PMSF；BCA蛋白浓度测定试剂盒（Beyotime），兔抗人一抗（MMP-9,MMP-2,P38,P-P38,ERK1/2,P-ERK1/2,JNK,P-JNK,PCK,β-Actin）；辣根过氧化物酶共轭的山羊抗兔二抗；丙烯酰胺，SDS，亚硫酸铵，Tris-Base，PVDF膜，ECL发光液（GE Healthcare）。
试验方法：将细胞消化成细胞悬液后，以合适的密度铺于60mm培养皿中，于37℃，5%CO2培养箱中孵育约24h，待细胞生长至占培养皿底部60%左右时，移除原培养液，加入新鲜配制的，分别含有0,10,25,50,100和150μM DHM的培养液继续培养12h和24h，分别终止培养，移除培养液并用PBS洗涤两次，加入含有1%PMSF的RIPA裂解液裂解细胞。将裂解液4℃，12000×g/min离心10min，收集上清，测定蛋白浓度后，等蛋白量上样，10%SDS-PAGE电泳分离蛋白，转膜至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭，TBST（含1%Tween20）洗涤后一抗（MMP-9,MMP-2,P38,P-P38,ERK1/2,P-ERK1/2,JNK,P-JNK,PCK）4℃孵育过夜。TBST洗涤5次，每次5min，二抗室温孵育1h，TBST洗涤5次，每次5min，使用ECL发光液化学发光并在暗室曝光，分析相关蛋白表达趋势。
试验结果：DHM处理12h和24h时，MMP-2的表达均无明显变化趋势；MMP-9在DHM处理12h时，表达量变化趋势不明显，但在药物处理24h时，MMP-9的表达量随DHM浓度的升高而降低；P38的表达不随时间的延长或浓度的增加发生明显变化，但P-P38随时间的延长和DHM浓度的升高表现出减弱的趋势；DHM处理12h和24h时，ERK的表达均随DHM浓度的升高而增强，但P-ERK的表达虽然在DHM处理12h时表现出浓度依赖性的增强，但在DHM处理24h时却随DHM浓度的升高，蛋白表达量呈现减弱的趋势；DHM作用并不引起JNK表达量的变化，但是P-JNK的量表现出随浓度升高而增大的趋势；PCK在DHM处理12h和24h时蛋白表达量均随浓度升高而增大（图19）。
实施例8DHM对细胞活性氧（ROS）含量的影响
一、细胞培养与传代
本试验使用人肝癌细胞系HepG2购自中国科学院上海细胞库，培养基为添加10%FBS的1640培养液，在37℃，5%CO2培养箱中培养，待细胞生长至占培养皿底部80～90%时，使用0.25%胰酶-EDTA消化并传代。
二、细胞ROS含量检测
主要试验材料：二氢杨梅素（Dihydromyrictin,DHM,Sigma）溶解于二甲亚砜（DMSO）中，配制成50mM浓缩液，-20℃保存，使用时分别稀释为10,50,和100μM，即配即用；DCFDA Cellular ROS Detection Assay Kit(Abcam Inc,UK)，黑色96孔板（Nunc）。
试验方法：将细胞消化，离心并重悬浮于含10%FBS的1640培养液中，以2.5×104/孔的密度接种于黑色96孔板中，置于37℃，5%CO2培养箱中孵育过夜。后续步骤按照DCFDA Cellular ROS Detection Assay Kit试剂盒说明书进行：将DHM用1×supplemented buffer solution（1×buffer solution添加10%FBS）分别稀释为10,50,和100μM。将细胞从培养箱中移出，移除1640培养液后，加入含有DHM的supplemented buffer solution，重新置于37℃，5%CO2培养箱中继续培养，以不含DHM的1×supplemented buffer solution培养的细胞作为对照组。分别在培养的6h,12h和24h，移除supplemented buffer solution，用PBS洗涤一遍后，每孔加入100μL DCFDA mix(25μM DCFDA溶解于1×buffer solution中)，37℃孵育45min，用PBS洗涤一次后，使用酶标仪进行检测（激发光485nm，发射光535nm）。每组设三个重复
实验结果：使用DHM(10,50和100μM)处理6h（图20-A），12h（图20-B）和24h（图20-C）的HepG2细胞中，ROS含量均显著低于对照组。说明DHM可显著降低HepG2细胞的ROS含量。
实施例9DHM对细胞谷胱甘肽（GSH）含量的影响
一、细胞培养与传代
本试验使用人肝癌细胞系HepG2购自中国科学院上海细胞库，培养基为添加10%FBS的1640培养液，在37℃，5%CO2培养箱中培养，待细胞生长至占培养皿底部80～90%时，使用0.25%胰酶-EDTA消化并传代。
二、细胞GSH含量检测
主要试验材料：二氢杨梅素（Dihydromyrictin,DHM,Sigma）溶解于二甲亚砜（DMSO）中，配制成50mM浓缩液，-20℃保存，使用时稀释为100μM，即配即用；ApoSENSOR Glutathione Detection Kit(BioVision,CA)，黑色96孔板（Nunc）。
试验方法：将细胞消化，离心并重悬浮于含10%FBS的1640培养液中，计数，每组收集1x106个细胞到1.5ml离心管中，700rpm/min离心5min，弃去上层培养液。加入100μL Cell Lysis Buffer重悬细胞，冰浴10min，13000rpm/min离心10min，将上清液转移到新的EP管中，每组取上清液100μL转移至黑色96孔板中，酶标仪检测，激发光为380nm发射光460nm。
试验结果：试验证明，使用DHM处理6h（图21-A），12h（图21-B）和24h（图21-C）的HepG2细胞，其GSH含量显著低于常规对照组。说明DHM可显著降低肝癌细胞的GSH含量。
实施例10DHM对细胞ATP的影响
一、细胞培养与传代
本试验使用人肝癌细胞系HepG2购自中国科学院上海细胞库，培养基为添加10%FBS的1640培养液，在37℃，5%CO2培养箱中培养，待细胞生长至占培养皿底部80～90%时，使用0.25%胰酶-EDTA消化并传代。
二、细胞ATP含量检测
主要试验材料：二氢杨梅素（Dihydromyrictin,DHM,Sigma）溶解于二甲亚砜（DMSO）中，配制成50mM浓缩液，-20℃保存，使用时分别稀释为10,50,和100μM，即配即用；ApoSENSOR cell viability assay kit(BioVision,CA)。
试验方法：细胞消化，离心并重悬浮于含10%FBS的1640培养液中，调整细胞密度，以103～104个/孔的密度接种于96孔板中，置于37℃，5%CO2培养箱中过夜培养以使细胞贴壁。移除培养液，向各孔中分别加入含有10,50,和100μM DHM的1640培养液继续培养细胞，以不含DHM的1640培养基培养的细胞作为对照组。在培养的6h,12h和24h分别终止培养，移除培养液，每孔加入100μL Nuclear Releasing Reagen，室温震摇5min，再加入5μL ATPMonitoring Enzym，轻摇混匀，1min内光度计读数并记录数据。每组设三个重复。
试验结果：试验证明，使用DHM处理6h（图22-A），12h（图22-B）和24h（图22-C）的HepG2细胞，其ATP含量显著低于常规对照组。说明DHM可显著降低肝癌细胞的ATP总量。
实施例11DHM对原代分离的肝癌细胞增殖的影响
一、原代肝癌细胞的分离
原代肝癌细胞来自广东医学院附属医院肝细胞肝癌患者手术切除下的癌肿组织，使用组织块培养法获得的原代肝癌细胞。
二、DHM对原代肝癌细胞增殖能力的影响
主要试验材料：二氢杨梅素（Dihydromyrictin,DHM,Sigma）溶解于二甲亚砜（DMSO）中，配制成50mM浓缩液，-20℃保存，使用时分别稀释为5,10,25,50,100和150μM，即配即用；噻唑蓝（MTT,Sigma）溶于PBS中，终浓度为5mg/mL，4℃保存，配制后一周内使用；胰酶（Gibco）；PBS；6孔板（Nunc）。
试验方法：将细胞消化，离心并重悬浮于相应培养液中，以1×104/孔的密度种植于96孔板，置于37℃，5%CO2培养箱中培养24h后，移除原培养液，加入新鲜配制的，分别含有5,10,25,50,100,150μM DHM的培养液继续培养，分别于培养的6h,12h,24h,36h,48h和72h终止培养，向每孔加入20μL MTT，再重新置于37℃，5%CO2培养箱中培养4h后，小心移除含有MTT的培养液，每孔加入DMSO150μL,小心摇晃混匀后在酶标仪OD570nm处检测各孔的吸光值。每个浓度设置三个重复组。
试验结果：DHM自药物处理的6h起及开始对原代肝癌细胞发生作用，作用效果非常明显，当剂量为150μM时，药物处理6h的原代细胞增殖抑制率超过60%；当药物处理48h时增殖抑制率甚至达到80%以上（图23）。说明DHM可有效地抑制原代分离的肝癌细胞增殖。
实施例12DHM对原代培养的肝癌细胞凋亡的诱导作用
一、原代肝癌细胞的分离
原代肝癌细胞来自广东医学院附属医院肝细胞肝癌患者手术切除下的癌肿组织，使用组织块培养法获得的原代肝癌细胞。
二、DHM对原代肝癌细胞凋亡的影响
主要试验材料：DHM,溶解于二甲亚砜（DMSO）中，配制成50mM浓缩液，-20℃保存，使用时分别稀释为50和100μM，即配即用；顺铂；FITC AnnexinⅤ Apoptosis Detection Kit Ⅰ(BD Pharmingen)；Accutase-Enzyme CellDetachment Medium(eBioscience)；PBS；60mm培养皿，流式专用上样管。
试验方法：将细胞消化成细胞悬液后，以合适的密度铺于60mm培养皿中，于37℃，5%CO2培养箱中孵育约24h，待细胞生长至占培养皿底部50%左右时，移除原培养液，加入新鲜配制的，分别含有50和100μM DHM的培养液继续培养，以不加药组作为阴性对照，以加入5μg/ml抗癌特效药顺铂的试验组为阳性对照。培养24h后小心收集上清液并使用Accutase-Enzyme Cell DetachmentMedium消化细胞，将细胞悬液与上清液混合离心，将收集到的细胞用PBS洗涤一次，离心并重悬浮于1×Binding Buffer，调节细胞密度为1×106个/mL。吸取100μL细胞悬液至上样管中，加入5μL Annexin Ⅴ–FITC和5μL PropidiumIodide(PI)，混匀后避光室温反应15min，再向每管中加入400μL1×Binding Buffer，使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
试验结果：DHM可有效诱导原代肝癌细胞的凋亡。100μM DHM处理组的细胞凋亡率（36.8±4.38%）显著高于顺铂组的凋亡率（21%±6.34,P<0.05,图24）。
实施例13DHM对永生化肝细胞HL7702的凋亡作用检测
一、细胞培养与传代
本试验使用人肝永生化细胞系HL7702购自中国科学院上海细胞库，培养基为添加10%FBS的1640培养液，在37℃，5%CO2培养箱中培养，待细胞生长至占培养皿底部80～90%时，使用0.25%胰酶-EDTA消化并传代。
二、DHM对肝癌细胞凋亡的影响
主要试验材料：DHM,溶解于二甲亚砜（DMSO）中，配制成50mM浓缩液，-20℃保存，使用时分别稀释为10,50和100μM，即配即用；FITC AnnexinⅤ Apoptosis Detection Kit Ⅰ(BD Pharmingen)；Accutase-Enzyme CellDetachment Medium(eBioscience)；PBS；60mm培养皿，流式专用上样管。
试验方法：将细胞消化成细胞悬液后，以合适的密度铺于60mm培养皿中，于37℃，5%CO2培养箱中孵育约24h，待细胞生长至占培养皿底部50%左右时，移除原培养液，加入新鲜配制的，分别含有10,50和100μM DHM的培养液继续培养。分别培养24h，48h后小心收集上清液并使用Accutase-Enzyme CellDetachment Medium消化细胞，将细胞悬液与上清液混合离心，将收集到的细胞用PBS洗涤一次，离心并重悬浮于1×Binding Buffer，调节细胞密度为1×106个/mL。吸取100μL细胞悬液至上样管中，加入5μL Annexin Ⅴ–FITC和5μLPropidium Iodide(PI)，混匀后避光室温反应15min，再向每管中加入400μL1×Binding Buffer，使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
试验结果：DHM不能诱导人永生化细胞系HL7702细胞凋亡。直至加药处理48h后，HL7702细胞凋亡率仍与不加药的对照组无显著差异，说明DHM仅诱导肝癌细胞凋亡，而对正常肝细胞无诱导凋亡的作用（图25）。
Claims (10)
1.二氢杨梅素在制备抗肝癌药物中的应用。
2.二氢杨梅素在制备肝癌细胞迁移抑制剂或制备肝癌细胞增殖抑制剂的应用。
3.二氢杨梅素在制备降低肝癌细胞中ATP含量的药物的应用。
4.二氢杨梅素在制备降低肝癌细胞的GSH含量的药物的应用。
5.二氢杨梅素在制备降低肝癌细胞活性氧（ROS）含量的药物的应用。
6.如权利要求1-5任一权利要求所述的应用，其特征在于所述的肝癌细胞为QGY7701、QSG7701、Huh7、MHcc97H、MHcc97L、QGY7703或SK-HEP-1。
7.二氢杨梅素在制备抑制肝癌细胞QGY7701增殖的药物或制备诱导肝癌细胞QGY7701凋亡的药物中的应用。
8.二氢杨梅素在制备QGY7701细胞的P53、Caspase3、Caspase9或PARP表达促进剂上的应用。
9.二氢杨梅素在制备QSG7701细胞的P53、Caspase3、Caspase9或PARP表达促进剂上的应用。
10.二氢杨梅素在制备抑制原代肝癌细胞增殖或诱导原代肝癌细胞凋亡的药物、或制备中的应用。
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Application publication date: 20130904 |